М е т о д ы с т е р и л и з а ц и и

Стерилизация или обеспложивание (от лат. sterilis – бесплодный) – это процесс полного уничтожения вегетативных форм микроорганизмов и их спор с любых поверхностей. В микробиологической практике стерилизуют стеклянную посуду, питательные среды, инструменты и другие предметы лабораторного обихода.

Различают термическую стерилизацию, обусловленную воздействием на предметы высокой температуры, и холодную стерилизацию, осуществляемую при комнатной температуре (фильтрование, воздействие ультрафиолетовыми лучами, ультразвуком, обработка химическими веществами – антисептиками). В микробиологической практике наиболее часто используются приемы термической стерилизации: прокаливание в пламени спиртовки, стерилизацию сухим жаром, насыщенным паром под давлением, текучим паром и т.д.

Прокаливание в пламени (фламбирование). Этим методом стерилизуют бактериологические иглы, петли, шпатели, пипетки, предметные стекла, пинцеты, ножницы, прокаливая их перед использованием в пламени спиртовки. При этом микроорганизмы, как и все живое, сгорают под действием высокой температуры.

Стерилизация сухим жаром. Этот способ осуществляется в специальном сушильном шкафу при температуре 160-170⁰С в течение 1-2 часов. Действие сухого жара в отсутствие влаги заключается в обугливании микроорганизмов и их спор. Этим способом стерилизуют стеклянную посуду – чашки Петри, колбы, пробирки, пипетки. Перед стерилизацией пробирки и колбы закрывают ватно-марлевыми пробками, чашки Петри и пипетки плотно завертывают в бумагу во избежание попадания на них микроорганизмов из воздуха после окончания термообработки.

Стерилизация паром под давлением (автоклавирование). Это наиболее быстрый и надежный способ стерилизации питательных сред, посуды, халатов, осуществляемый в специальных герметически закрывающихся аппаратах – автоклавах. Сущность метода заключается в обработке материала паром под давлением выше атмосферного. При нормальном атмосферном давлении водяной пар имеет температуру 100⁰С. При увеличении же давления внутри сосуда с горячим водяным паром значительно повышается температура пара (табл. № 1), что ускоряет гибель микроорганизмов и их спор.

 

Таблица 1 - Режимы стерилизации

Избыточное давление, атм	tо насыщенного пара, оС	Продолжительность стерилизации, мин
0, 5
1, 5

 

Стерилизация текучим паром. Этот способ термической обработки проводится в аппарате Коха и используется для стерилизации питательных сред, изменяющих свойства при температуре выше 100^оС. При этом субстрат нагревают при 100 ^оС (температура кипения воды при нормальном давлении) в течение 1 час. Поскольку при таком режиме погибают только вегетативные формы, то прибегают к трехкратной или дробной стерилизации. При этом в интервале между стерилизациями питательные среды выдерживают в течение 24 часов в термостатах при температуре 28-37^оС для ускорения прорастания содержащихся в среде спор, а полученные вегетативные клетки уничтожаются при последующем нагревании при 100^оС.

Проводить дробную стерилизацию можно и в автоклаве с незавинченной крышкой, когда пар будет свободно выходить из аппарата наружу.

Стерилизация фильтрованием. Сущность метода заключается в пропускании (фильтровании) жидких питательных сред, растворов, изменяющих свои свойства даже при незначительном нагревании, через специальные мелкопористые фильтры, на которых задерживаются микроорганизмы. Чаще всего на практике применяют мембранные фильтры из коллодия, ацетата, целлюлозы, асбестовые фильтры Зейтца, «свечи» из каолина (свечи Шамберлана), инфузорной земли (свечи Беркефельда) и др.

Стерилизуемая жидкость наливается через стерильный фильтр в стерильный приемник, в котором с помощью насоса создается вакуум. Микроорганизмы оседают в порах фильтра благодаря как механической преграде, так и в результате электрической адсорбции (клетки в водной суспензии имеют отрицательный заряд, а фильтры изготовлены из положительно заряженных материалов).

 

Посевы и пересевы микроорганизмов

Посевом в микробиологической практике называется заражение стерильной питательной среды каким-либо исследуемым материалом (вода, пищевые продукты и т.д.) для выявления микроорганизмов. Пересев – это перенос выращенных микроорганизмов в свежую стерильную питательную среду.

В микробиологической практике используются следующие основные способы посевов (пересевов) микроорганизмов:

а) штрихом – осуществляется бактериологической петлей из пробирки в

пробирку или в чашку Петри;

б) уколом – проводится бактериологической иглой из пробирки в пробирку;

в) газоном – осуществляется шпателем Дригальского в чашке Петри;

г) розливкой.

При посевах (пересевах) культуры необходимо соблюдать стерильность, т.е. предотвращать возможность загрязнения исследуемого материала и питательных сред посторонними микроорганизмами.

 

4.3.1 Посев штрихом (уколом) из пробирки в пробирку

Техника посева по этапам показана на рис. 3.

а) зажечь спиртовку;

б) взять в левую руку две пробирки: одну, из которой будет проводиться пересев, и другую со свежей питательной средой (ближе к себе), (см. рис.3, а);

 

Рисунок 3 - Посев из пробирки в пробирку

 

в) прокалить бактериологическую петлю (иглу) в пламени (см. рис.3, а);

г) открыть пробирки, захватив одновременно обе ватные пробки мизинцем правой руки (см. рис.3, б);

д) обжечь края обеих пробирок (см. рис.3, б);

е) внести петлю в пробирку с микроорганизмами и, захватив немного микробной взвеси, перенести ее, не касаясь стенок пробирки, в пробирку со свежей питательной средой (см. рис.3, в, г), т.е произвести посев культуры.

Посев штрихом осуществляется на скошенный агар (агар-косячкок) – петлю осторожно вводят в пробирку до границы конденсационной воды и зигзагообразными движениями распределяют материал по поверхности агара снизу вверх.

Посев уколом осуществляется в агаровый столбик – среду прокалывают бактериологической иглой до дна пробирки.

Посев на жидкие среды – материал, взятый петлей, наносят на стенку пробирки у верхнего уровня среды, и слегка встряхивая пробирку, смывают его средой.

ж) обжечь обе пробирки и края пробирок и одновременно в пламени закрыть обе пробирки (см. рис. 3, д);

з) обжечь петлю в пламени (см. рис. 3, е).

Посев суспензии микроорганизмов можно производить с помощью пипетки. Для этого профламбированной пипеткой набирают жидкость, выпускают ее содержимое (при количественном посеве – определенный объем) в свежую питательную среду. После посева использованную пипетку опускают в сосуд с дезинфицирующим раствором.

 

4.3.2 Посев газоном

Посев газоном используется для изучения поверхностного роста культур. Исследуемый материал наносят петлей или пипеткой на поверхность застывшей питательной среды в чашке Петри и затем равномерно распределяют его по поверхности, пользуясь предварительно простерилизованным шпателем Дригальского.

Левой рукой слегка приподнимают крышку чашки Петри, стоящей на поверхности стола, а правой - вносят в чашку шпатель. Круговыми движениями шпателя распределяют культуру по всей поверхности плотной питательной среды.

 

4.3.3 Посев розливкой

Посев розливкой используют в случае необходимости вырастить микроорганизмы в толще среды (глубинный посев). Глубинный посев можно осуществить двумя способами:

1) Культуру микроорганизмов вносят в пробирки с расплавленной и охлажденной до 40-50^оС плотной питательной средой, а затем выливают эту смесь в чашки Петри;

2) Взвесь микроорганизмов вносят бактериологической петлей или пипеткой непосредственно на дно стерильной чашки Петри, слегка приоткрыв крышку, а затем заливают ее расплавленной и охлажденной до 40-50^оС плотной питательной средой. Среду с культурой тщательно перемешивают круговыми движениями чашки, не поднимая ее с поверхности стола. После этого чашку оставляют на столе до застывания агара.

 

⇐ Предыдущая12345Следующая ⇒

Поделиться: