ПРИНЦИП МЕТОДА ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) - метод амплификации ДНК inv itro, с помощью которого в течение нескольких часов можно выделить и размножить определѐ нную последовательность ДНК в миллиарды раз.

Возможность получения огромного количества копий одного строго определѐ нного участка генома значительно упрощает исследование имеющегося образца ДНК.

В основе метода ПЦР лежит природный процесс - комплементарное достраивание ДНК матрицы, осуществляемое с помощью фермента ДНК-полимеразы.

Для проведения амплификации необходимы следующие компоненты:

ДНК-матрица (ДНК или ее часть, содержащая искомый специфический фрагмент);

Комплементарное достраивание цепи начинается не в любой точке последовательности ДНК, а только в определенных стартовых блоках - коротких двунитевых участках. При присоединении таких блоков к специфическим участкам ДНК можно направить процесс синтеза новой цепи только в этом участке, а не по всей длине ДНК цепи. Для создания стартовых блоков в заданных участках ДНК используют две олигонуклеотидные затравки, называемые праймерами.

Праймеры - синтетические олигонкулеотиды длиной 20-30 пар оснований, комплементарные последовательностям ДНК на границах определяемого специфического фрагмента. Выбор специфического фрагмента и подбор праймеров играет важнейшую роль в специфичности проведения амплификации, что сказывается на качестве проведения анализа. Праймеры комплементарны последовательностям ДНК на левой и правой границах специфического фрагмента и ориентированы таким образом, что достраивание новой цепи ДНК протекает только между ними.

Смесь дезоксинуклеотидтрифосфатов (дНТФ) (смесь четырех дНТФ, являющихся материалом для синтеза новых комплементарных цепей ДНК);

Фермент Taq-полимераза - термостабильная ДНК-полимераза, катализирующая удлинение цепей праймеров путем последовательного присоединения нуклеотидных оснований к растущей цепи синтезируемой ДНК;

Буферный раствор (реакционная среда, содержащая ионы Mg2+, необходимые для поддержания активности фермента).

Каждый цикл амплификации включает 3 этапа, протекающих в различных температурных режимах:

1 этап: Денатурация ДНК (расплетение двойной спирали). Протекает при +93-950С в течение 1 мин.

2 этап: Присоединение праймеров (отжиг). Присоединение праймеров происходит комплементарно к соответствующим последовательностям на противоположных цепях ДНК на границах специфического участка.

Для каждой пары праймеров существует своя температура отжига, равнаяоколо 55-650С. Время отжига – 1 мин.

3 этап: Достраивание цепей ДНК. Комплементарное достраивание цепей ДНК происходит от 5’-конца к 3’-концу цепи в противоположных направлениях, начиная с участков присоединения праймеров. Материалом для синтеза новых цепей ДНК служат добавляемые в раствор дезоксирибонуклеотидтрифосфаты (дНТФ). Процесс синтеза катализируется ферментом термостабильной ДНК-полимеразой (Taq-полимеразой) и проходит при температуре +70-720С. Время протекания синтеза – 1 мин.

Для получения достаточного количества копий искомого фрагмента ДНК амплификация включает несколько около 40 циклов. Образовавшиеся в первом цикле амплификации новые цепи ДНК служат матрицами для второго цикла амплификации, в котором происходит образование искомого специфического фрагмента ДНК (ампликона).

При многократном повторении циклов синтеза происходит экспоненциальное увеличение числа копий специфического фрагмента ДНК, что позволяет из небольшого количества анализируемого материала, который может содержать единичные клетки микроорганизмов получить достаточное количество ДНК копий для идентификации их методом электрофореза.

Таким образом, ПЦР представляет собой многократное увеличение числа копий (амплификация) специфического участка ДНК катализируемое ферментом ДНК-полимеразой. Накопление ампликонов происходит в геометрической прогрессии по формуле 2n, где n-число циклов амплификации. Поэтому, даже если в исходном растворе первоначально находилась только одна двухцепочечная молекула ДНК, то за 40 циклов в растворе накапливается около 108 молекул ампликона. Этого количества достаточно для достоверной визуальной детекции этого фрагмента методом электрофореза.

 

 

ТЕМА: МЕДИКО-ГЕНЕТИЧЕСКОЕ КОНСУЛЬТИРОВАНИЕ.

ПРЕНАТАЛЬНАЯ ДИАГНОСТИКАНАСЛЕДСТВЕННЫХ

ЗАБОЛЕВАНИЙ

 

1. СУЩНОСТЬ МЕДИКО-ГЕНЕТИЧЕСКОГО КОНСУЛЬТИРОВАНИЯ

2. ОЦЕНКА РИСКА НАСЛЕДСТВЕННОЙ И ВРОЖДЕННОЙ ПАТОЛОГИИ

3. ПРЕНАТАЛЬНАЯ ДИГНОСТИКА

4. НЕПРЯМЫЕ МЕТОДЫ ПРЕНАТАЛЬНОЙ ДИАГНОСТИКИ

5. ИНВАЗИВНЫЕ (ОПЕРАТИВНЫЕ) МЕТОДЫ ПРЕНАТАЛЬНОЙ ДИАГНОСТИКИ

6. ЭТИЧЕСКИЕ ПРИНЦИПЫ МЕДИКО-ГЕНЕТИЧЕСКОГО КОНСУЛЬТИРОВАНИЯ

 

СУЩНОСТЬ МЕДИКО-ГЕНЕТИЧЕСКОГО

КОНСУЛЬТИРОВАНИЯ

Медико-генетическое консультирование - это специализированный вид медицинской помощи. Смысл его – профессиональная оценка риска рождения в конкретной семье ребенка с наследственной болезнью или врожденным уродством. Оценить такой риск иногда достаточно сложно, но всегда - очень важно, потому что многие из наследственных и врожденных болезней приводят к инвалидности или даже к смерти.

Целью генетического консультирования в общепопуляционном смысле является снижение груза патологической наследственности, а цель отдельной консультации – помощь семье в принятии правильного решения по вопросам планирования семьи.

Медико-генетическое консультирование наиболее эффективно, когда оно проводится как проспективное консультирование, когда семья еще только планирует рождение первенца. При этом риск рождения больного ребенка определяется до наступления беременности или в ранние ее сроки.

Ретроспективное консультирование проводится после рождения больного ребенка (врожденные пороки развития, задержка физического развития и умственная отсталость) относительно здоровья будущих детей.

Обратиться за консультацией можно и во время беременности, но этот вариант несколько хуже, особенно – если семья обращается не в первом, а во втором триместре текущей беременности.

В некоторых случаях полезным оказывается добрачное медико-генетическое консультирование – например, при наличии в семье наследственных болезней, или болезней с семейным накоплением.

Консультирование всех семей можно признать оптимальным подходом, поскольку в ряде стран такая практика позволила значительно снизить количество инвалидизирующих болезней, а значит – предупредила множество человеческих трагедий. Но " тотальное" медико-генетическое консультирование – чрезвычайная редкость. В абсолютном большинстве стран семьи обращаются к врачу генетику только при наличии факторов риска – особенностей семейной истории, образа жизни супругов, состояния их здоровья. Статистика свидетельствует: таких " семей риска" – около10%.Такие широкие показания обусловлены фактом: риск рождения ребенка с наследственной болезнью или врожденным пороком развития есть у любой супружеской пары при каждой беременности. Этот риск складывается из многих составляющих:

- наследственного груза, доставшегося от многих поколений предков;

- новых мутаций, происходящих в ДНК яйцеклеток и сперматозоидов;

- неблагоприятных физических, химических и др. влияний внешней среды на организм развивающегося эмбриона;

- неблагоприятных влияний на эмбрион со стороны материнского организма (инфекционные, эндокринные и др. болезни матери).

Любой человек имеет вышеперечисленные факторы риска. Поэтому и нужна количественная оценка их опасности для потомства конкретной семьи. К счастью, в большинстве случаев риск рождения ребенка с наследственной болезнью низок – не превышает 5%. Но убедиться в этом позволяет только медико-генетическое консультирование.

В ряде же случаев такой риск исчисляется в более высоких цифрах –в семьях, имеющих отягощенную наследственность, при высоко вероятном действии на организм супругов вредных факторов окружающей среды, наличии у женщины некоторых заболеваний. При таких ситуациях медико-генетическое консультирование еще актуальнее, поскольку позволяет избежать многих трагических для семьи последствий.

⇐ Предыдущая16171819202122232425Следующая ⇒

Поделиться: