Раздел 3 Основы микробиологического производства

Тема 3. 1 Селекция микроорганизмов

 

В большинстве случаев выбор микробиологического способа получения того или иного вещества обусловлен полным отсутствием или невозможностью синтеза его химическим путем.

Продукты микробного синтеза для того, чтобы стать объектом рентабельного промышленного производства, должны выделяться микробной клеткой в питательную среду и накапливаться в среде в количествах, которые оправдывали бы сырьевые и энергетические затраты на культивирование микроорганизмов и выделение продукта. Промышленные штаммы должны обладать высокой скоростью роста, использовать дешевые не пищевые субстраты, быть устойчивыми к заражению посторонней микрофлорой и бактериофагами и др. Это позволяет значительно снизить затраты на производство целевого продукта.

Путем простого подбора не удается получить высокоактивных продуцентов, возникает задача изменения природы микроорганизма в нужном направлении. Природные штаммы микроорганизмов не обладают способностью выделять и накапливать в питательной среде, то есть продуцировать такое количество нужного продукта, которое обеспечило бы достаточно низкую его стоимость и требуемый народному хозяйству или медицине объем производства. Природные штаммы некоторых групп микроорганизмов подвергаются воздействиям с целью получения наследственных изменений – мутаций, приводящих к усилению природной способности микроорганизмов синтезировать и продуцировать определенное вещество, синтезировать вещество в избытке – сверх своих потребностей. Повышение уровня продуктивности – постоянная забота селекционеров. Для этого используют методы селекции. С их помощью получены промышленные штаммы микроорганизмов, синтетическая активность которых превышает активность исходных штаммов в десятки и сотни раз.

Теоретически мутации, способствующие сверхсинтезу продукта, могут затрагивать большое число структурных генов, кодирующих ферменты всех этапов синтеза, транспорта и катаболизма данного продукта, а также регуляторные гены. Результат таких мутаций может проявляться в различных изменениях метаболизма клеток:

1) повышение скорости поглощения и утилизации субстрата клеткой;

2) повышение уровня синтеза ферментов или их активности;

3) блокирование побочных реакций синтеза для снижения расхода предшественников на синтез других метаболитов;

4) блокирование дальнейшего внутриклеточного превращения продукта;

5) обеспечение эффективной экскреции продукта из клеток;

6) блокирование деградации продукта;

7) усиление позитивных форм регуляции синтеза продукта.

Этот перечень, естественно, не полон, так как наши сведения о связи биосинтезов того или иного продукта с другими процессами в клетке не являются исчерпывающими.

Селекция – направленный отбор мутантов, т.е. организмов, наследственность которых претерпела скачкообразное изменение вследствие структурной модификации в нуклеотидной последовательности ДНК. Методы, основанные на отборе спонтанных мутаций, сыграли важную роль в развитии различных технологий с использованием микроорганизмов. Таким путем за длительное время были отобраны штаммы пивных, винных, пекарских дрожжей, уксуснокислых, пропионовокислых бактерий и др. Метод ограничен из-за низкой частоты спонтанных мутаций, однако, его возможности не исчерпаны. Высокие плотности микробных популяций, достигающие 10⁹ клеток и более на 1 мл суспензии, в сочетании с непрерывным культивированием биообъекта в больших объемах на протяжении многих поколений позволяют получить достаточно большие количества мутантов. Пример отбора наиболее продуктивных мутантов при культивировании в непрерывном режиме – отбор дрожжей Saccharomyces uvarum по признаку устойчивости к этанолу, продукту жизнедеятельности дрожжей.

Селекционная работа включает несколько этапов.

1. Выбор исходного микроорганизма для селекции.

2. Подготовка исходного штамма к селекционной работе, то есть необходимо изучить естественную изменчивость микроорганизма по морфологическим признакам и по уровню продукции желаемого вещества.

3. Получение мутантов с помощью физических, химических, мутагенных факторов (алкилирующие агенты, диэтисульфат).

4. Отбор мутантов с повышенным уровнем продукции.

Представляет интерес получение новых штаммов путем применения смешанных культур. Так в среде, содержащей гербицид Далапон, культивировали смесь культур, один из компонентов которой Pseudomonas putida вначале не мог расти с Далапоном, но через 2900 ч хемостатного культивирования возник мутант этого штамма, обозначенный PS, который был способен утилизировать Далапон как единственный субстрат. У мутанта оказалась измененная, очень активная дегалогеназа, необходимая для использования гербицида. Полагают, что другие штаммы были «бутафорией», поддерживающей рост исходного штамма, пока не возник и не отселекционировался новый мутант. В создании нового штамма участвует ряд факторов: селективное давление, поддержка роста «слабыми штаммами», перенос генетического материала при помощи плазмид и фагов.

К значительному ускорению селекции ведет индуцированный мутагенез – резкое увеличение частоты мутаций биообъекта при искусственном повреждении генома. Достижения молекулярной генетики позволили ввести в практику целенаправленные методы отбора продуцентов – по их устойчивости к структурным аналогам целевого продукта. Метод основан на регуляции ферментов по принципу обратной связи конечным продуктом биосинтетического пути. Повышение концентрации метаболита ингибирует активность фермента, участвующего в синтезе метаболита, или репрессирует синтез этого фермента.

В первой половине 70-х годов ХХ века развитие молекулярной биологии привело к возникновению новой экспериментальной техники, которая получила в России название «генной инженерии», а на западе – «работа с рекомбинантными молекулами ДНК». Суть этой технологии заключается во фрагментировании молекул ДНК в строго определенных участках, воссоединении таких ферментов, т.е. в создании новых рекомбинантных молекул ДНК in vitro. Сегодня возможен перенос генов любого организма в любой другой организм.

В системе хозяин – вектор (небольшой фрагмент молекулы ДНК) – хозяинсм участвуют бациллы, псевдомонады, актиномицеты, дрожжи.

Перспективы применения генной инженерии для совершенствования штаммов микроорганизмов сегодня кажутся почти неограниченными. Будет развиваться такое направление, как создание штаммов – продуцентов белков человека, сельскохозяйственных животных и растений. Это направление связано не только с медициной и ветеринарией, но и с пищевой промышленностью. Близки к завершению работы по созданию микробиологической технологии производства ренина (сычужный фермент), используемого в сыроделии, сладкого белка – тауматина (в 3000 раз слаще сахара) и других продуктов.

Ведутся работы по совершенствованию штаммов дрожжей, используемых в пивоварении и виноделии. Этим микроорганизмам передаются гены, которые могут обеспечить усвоение пентоз, разрушение фенольных соединений.

Камнем преткновения часто является не методология генной инженерии, а неполное знание биохимических путей синтеза того или иного соединения.

С помощью методов генетической инженерии можно конструировать по определенному плану новые формы микроорганизмов, способных синтезировать самые различные продукты, в том числе продукты животного и растительного происхождения. Излюбленный объект генетической инженерии E. coli секретирует сравнительно мало белков, кроме того, клеточная стенка этой бактерии содержит токсическое вещество эндокотин, которое необходимо тщательно отделять от продуктов, используемых в фармакологических целях. Как объекты генетической инженерии перспективны грамположительные бактерии, эукариотические организмы. Генетическая инженерия дает не только новые продуценты ценных соединений, но позволяет также повышать эффективность организмов, используемых в производстве. Распространенным способом повышения выхода полезного продукта является амплификация – увеличение числа копий генов. Амплификацией генов в составе векторов получены высокоэффективные продуценты треонина и пролина.

Питательная среда обеспечивает жизнедеятельность, рост и развитие продуцентов, эффективный синтез целевого продукта. Питательные среды могут иметь неопределенный состав, т.е. включать биогенные (растительные, животные, микробные) добавки – мясной экстракт, кукурузную муку, морские водоросли и т.д. Подобные среды готовят на водопроводной воде. Применяют также синтетические среды, приготовленные из чистых химических соединений в заранее определенных соотношениях на дистиллированной воде. С экономической точки зрения наиболее целесообразно употребление природного, более дешевого сырья. Компромиссный подход – использование полусинтетических сред, в состав которых вместе с соединениями известной химической природы входят биогенные добавки. Компонентный состав сред зависит от пищевых потребностей биообъекта.

Биотехнологические процессы могут быть основаны на периодическом или непрерывном культивировании. Современные периодические процессы основаны на принципе дифференцированных режимов культивирования, который отвечает смене фаз роста культуры. Широко применяют периодическое культивирование с подпиткой, отъемно-доливочное или полунепрерывное культивирование, культивирование с диализом. В непрерывных процессах продуцент постоянно поддерживается в экспоненциальной фазе роста. Различают хемостатный и турбидостатный режимы непрерывного культивирования.

 

Тема 3.2 Типовая технологическая схема микробиологического производства

 

Большое разнообразие биотехнологических процессов, нашедших промышленное применение, приводит к необходимости рассмотреть общие, наиболее важные проблемы, возникающие при создании любого биотехнологического производства. Процессы промышленной биотехнологии разделяют на 2 большие группы: производство биомассы и получение продуктов метаболизма. Однако такая классификация не отражает наиболее существенных с технологической точки зрения аспектов промышленных биотехнологических процессов. В этом плане необходимо рассматривать стадии биотехнологического производства, их сходство и различие в зависимости от конечной цели биотехнологического процесса.

 

Общая схема ферментации

В настоящее время микробиологическую промышленность рассматривают как производство, включающее подготовку сырья, приготовление сред, проведение собственно ферментации, выделение и очистку продукта и обработку или удаление отходов. Причем обработке или утилизации отходов придают особо важное значение. При пуске нового завода 10-15 % капиталовложений поглощает обработка отходов.

В промышленной микробиологии полный процесс получения целевого продукта подразделяется на две главные фазы: ферментацию и выделение продукта. Ферментация – энергодающий путь метаболизма, в котором органические соединения выступают как доноры и акцепторы электронов (в этом смысле ферментация аналогична брожению). Термин используется в технической микробиологии для обозначения любого процесса выращивания микроорганизмов, независимо от аэробности. Чем лучше известен и расшифрован путь метаболизма микроорганизмов, тем больше возможностей для рационального ведения метаболического процесса.

 

Среды и сырье для микробиологической промышленности

В микробиологической промышленности более целесообразно использовать синтетические среды. При подборе сред исходят из потребностей микроорганизма в элементах питания, которые зависят от элементного состава его клеток. Поскольку элементный состав большей части клеток сходен, то обычно питательные среды содержат (г/л): глюкозу (как источник С) – 20, K₂HPO₄ (как источник К, Р) – 1; MgSO₄ 7H₂O – 0, 4; CaCl₂ – 0, 03, Fe₂ (SO₄ )₃ – 12·10^-4; ZnSO₄ – 4·10^-4; MnSO₄ - 4·10^-4. Как источник азота используют (NH₄)₂HPO₄, (NH₄)H₂PO₄ – 3 г/л, фосфатный буфер необходим для поддержания рН 6, 0-7, 5 для бактерий, 4, 5-7, 0 – для плесневых грибов; 4, 5- 6, 0 – для дрожжей.

10-60 % стоимости продуктов ферментации приходится на стоимость компонентов среды и, прежде всего, на стоимость источника углерода. Для снижения затрат в микробиологическом производстве обычно применяют дешевые среды, приготовленные на основе растительного сырья.

Как источник углерода чаще всего используют злаковый крахмал, мелассы, декстрозу, растительное масло, метанол, н-парафины, целлюлозу. Как источник азота – кукурузный экстракт, соевая мука, рыбная мука, мочевина, дрожжевой экстракт, гидролизат белка, сернокислый аммоний.

При приготовлении сред в промышленном масштабе учитывают состав ингредиентов, качество сырья, вариабельность сырья от партии к партии, соотношение С/N, содержание примесей.

 

Биореакторы для аэробной ферментации

Существуют три главных типа конструкций биореакторов: сосуды без внутренних частей, сосуды с перемешиванием (мешалкой) и барботажные колонны. Ферментеры для лаборатории (объем до 20 л) изготавливают из стекла. Большие ферментеры конструируют из нержавеющей стали. Отношение высоты к ширине от 2: 1 до 6: 1, а мешалка может находиться в верхней или нижней части биореактора.

 

Функции биореактора.

 

1. Контроль за перемещением на границе с внешней средой, то есть соблюдение стерильности.

а) Не должно быть выхода клеток из реактора; не допускать инфицирования внешней среды.

б) Не должно быть проникновения посторонних микроорганизмов в биореактор, т. е. ферментер должен быть герметичным.

2. Возможность введения субстрата и кислорода.

3. Возможность выведения продукта (в том числе СО₂).

4. Удаление тепла.

Стерильность обеспечивается типом конструкций ферментера. Для осуществления других функций ферментера используют перемешивание, аэрацию, охлаждение.

 

Последовательность стадий при проведении ферментации

Общая схема ферментационных процессов для производства первичных и вторичных метаболитов показана ниже.

Стадия	Ход ферментации
I II     III IV	Сохранение инокулята Подготовка инокулята а) 1-2 качалочные колбы б) получение спор Предварительная ферментация культур Продукционная ферментация

 

I стадия. Сохранение инокулята в течение длительного периода – главное условие для практической ферментации. Важно не просто сохранить клетки жизнеспособными, но и сохранить их способность к образованию продукта. Цель сохранения – поддержание штамма без его деления как можно дольше (чтобы избежать спонтанных мутаций).

Рабочие штаммы получают из маточных культур, которые не должны пересеваться чаще одного раза в 2 года.

Для каждого штамма выбирают наиболее подходящий способ сохранения: при низких температурах (2-6 ^оС), замораживании (-18 ^оС или при -80 ^оС в рефрижераторах) или при -196 ^оС в жидком азоте. Замораживание производят постепенно (1 ^оС/мин). Число выживших клеток может составлять около 5 %, т.к. клетки могут погибнуть во время замораживания и оттаивания. Лиофилизация – лучший способ сохранения инокулята. Добавление защитных веществ (обезжиренное молоко или сахароза) снижает возможность гибели клеток во время лиофилизации. Лиофилизированные культуры могут сохраняться неограниченно долгое время.

II стадия. Рост инокулята. Стандартное время для роста инокулята

- лиофилизированные культуры 4-10 дней;

- замороженные при низкой температуре бактерии – 4-48 ч; актиномицеты – 1-5 дней; грибы – 1-5 дней.

Если для некоторых ферментаций нужен споровый материал, то сохранившуюся культуру выращивают на твердой среде 8-24 часа. В качестве субстрата используют отруби, горох, рис, ячмень.

III стадия. Предварительная ферментация для получения достаточного количества инокулята для большого продукционного ферментера. Обычно требуется для инокуляции следующие концентрации клеток: бактерии 0, 1-3 %; актиномицеты 5-10 %; грибы 5-10 %.

IV стадия. Продукционная ферментация. Выращивание в ферментерах. Используют ферментеры различных размеров, в зависимости от природы получаемого целевого продукта (1-20 м³ – ферменты; 40-80 м³ – антибиотики, протеазы и др. ферменты; 450 м³ – аминокислоты).

 

Условия проведения ферментации

Температура. Иногда вначале повышают температуру, чтобы за короткое время получить биомассу, после чего температуру снижают. С помощью температурной манипуляции можно очень сильно изменить выход продукта. Например, если повысить температуру только на 1 % выше оптимума, то выход продукта в пенициллиназной реакции снижается на 20 %.

Чтобы получить оптимальный выход продукта, ферментацию надо вести при постоянном температурном режиме. Поэтому тепло, которое образуется при перемешивании и метаболической активности микроорганизмов, необходимо удалять с помощью охладительных систем. Чем более окислено вещество, используемое как субстрат, тем меньше тепла выделяется. Так, при использовании глюкозы микроорганизмами выделяется 0, 42 ккал/г клеток, метана – 0, 061 ккал/г клеток.

Содержание О₂ в жидкости. Критическим фактором ферментаций служит массоперенос газов: кислорода и диоксида углерода. Кислород часто выступает лимитирующим фактором. Он плохо растворяется: в 1 л воды при 20 ^оС в растворенном состоянии находится только 0, 3 ммоля О₂, а в питательной среде ещё ниже.

Для ферментаций, осуществляемых одноклеточными организмами, наиболее важный фактор, контролирующий скорость переноса О₂ связан с устойчивостью фазовой границы пузырьков газа и жидкости. Микробные клетки, находящиеся рядом с газовыми пузырьками, могут непосредственно поглощать газ через фазовые границы, и перенос газов к таким клеткам увеличен. Перенос же кислорода сквозь агломераты или скопления клеток затруднен и становится лимитирующим фактором. При использовании глюкозы в качестве субстрата требуется кислорода для Aerobacter aerogenes 515, E. coli – 400, Penicillium chryzogenum – 410, Candida utilis – 460 мгО₂ /г сухих клеток.

При избыточном аэрировании может угнетаться биосинтез вследствие быстрого окисления углеродного субстрата, поэтому скорость аэрации устанавливается в соответствии с потребностью организма в кислороде.

Давление. Ферментацию осуществляют при избыточном давлении 0, 2-0, 5 бар, чтобы избежать инфицирования.

Перемешивание. Если применяют дисковые мешалки, то скорость перемешивания в зависимости от размеров ферментера следующая: 0, 02 м³ – 250-450 об/мин; 0, 2 м³ – 250-350 об/мин; 1-20 м³ – 120-180 об/мин; 40-150 м³ – 120-150 об/мин.

Контроль за ходом ферментации. Для анализа используют специальные датчики, которые должны быть стерильные, если они помещаются в стерильные зоны ферментера. Измеряют физические параметры (температура, давление, вязкость и т.п.), химические (рН, концентрация О₂, СО₂, концентрация субстратов, концентрация продуктов), биологические (число клеток, наличие фага, посторонней микрофлоры).

Для поддержания параметров в оптимальном режиме в настоящее время используют ЭВМ.

Выделение продукта

Целевой продукт (если это не клетки) в промышленных микробиологических производствах обычно находится в очень небольшом количестве огромного объема жидкости.

Целевой продукт – клетки микроорганизмов или их метаболиты, которые сохраняются в клетках – внутриклеточные метаболиты или выделяются наружу - внеклеточные метаболиты.

На первой ступени выделения продукта сепарируют клеточный материал и нерастворимые в культуральной жидкости вещества от фильтрата. Сепарацию осуществляют путем фильтрации или седиментации. Фильтрация в промышленности производится в барабанных фильтрах через фильтрующую ткань. Седиментацию производят в специальных центрифугах.

Для выделения внутриклеточных веществ клетки микроорганизмов разрушают, в частности, ультразвуком.

На второй ступени выделения продукты ферментации концентрируют. Липофильные вещества экстрагируют органическими растворителями, например, этанолом или пропанолом.

Для очистки продуктов ферментации используют хроматографические методы, мембранные прессы. На последних стадиях очистки используют кристаллизацию и осаждение с помощью химических реактивов.

На последней стадии выделения производят высушивание целевого продукта. Высушивание осуществляют с помощью конвективной (в сухом воздухе), контактной (адсорбентом) сушек, а также высушивание из замороженного состояния.

Выход продукта– потери продукта составляют при ферментации белка – 5 %; антибиотиков – 20-50 %; внеклеточных ферментов – 10 %; внутриклеточных – 90 %.

Готовые препараты помимо инфекционного начала могут содержать наполнители, стабилизирующие вещества и прилипатели. В качестве наполнителей можно использовать бентонит, глину, тальк, каолин. Из прилипателей – тритон х-100 (ПАВ), твин-2, диэтиловый эфир и др. Введение в препарат некоторых ингредиентов, в частности, 1 % сухого снятого молока, обеспечивает хорошую защиту действующего начала от инактивации солнечными лучами.

Хранение биопрепаратов

Хранятся биопрепараты в сухих, защищенных от атмосферных осадков и попадания прямого солнечного света помещениях, отдельно от ядохимикатов. Температура хранения: не выше + 30 ^оС. и не ниже -30 ^оС. Оптимальная температура хранения 5-10 ^оС.

Срок хранения без снижения качества со дня изготовления при влажности 50-60 % - 30 дней; при влажности 5-8 % в воздухопроницаемой упаковке изготовитель определяет на срок до одного года. Практика применения биопрепаратов показала, что препараты можно использовать после 2 – 3 и более лет хранения, предварительно определив качество биопрепарата. Работы по контролю качества препарата осуществляют специалисты – микробиологи или лица, прошедшие стажировку в специальных лабораториях.

 

Определение качества биопрепарата

 В паспорте на биопрепарат обычно указывается его титр, то есть количество спор или клеток в одном грамме наполнителя, срок годности, норма расхода на гектар.

Определение титра бакпрепарата одной партии проводят по его средней пробе. Для анализа берут 500 г препарата. После определения влажности, которая не должна быть более 5%, определяют титр препарата. Для этого отобранный образец просеивают, отвешивают 1г и растворяют его в 100 мл стерильной воды. Затем делают разведения и высевают на питательные среды в условиях стерильности. В качестве питательных сред рекомендуется использовать для выращивания бактерий рыбо – пептонный агар, грибов – сусло-агар. Для высева на питательные среды берут разведения препарата, которые дают рост не более 300 и не менее 50 колоний в одной чашке Петри. Из каждого разведения делают посев в трех повторностях, равномерно распределяя суспензию по всей площади питательного агара. Чашки с посевами выдерживают в термостате при температуре 26- 28⁰С в течении 2 – 3 суток. Затем проводят подсчет выросших колоний и по трем чашкам определяют их среднее число на 1мл суспензии. Количество выросших колоний умножают на показатель разведения и таким образом определяют количество микробных тел в 1г препарата. Если их число уменьшилось, то норму расхода препарата увеличивают в соответствии с количеством оставшихся живых клеток.

Непосредственно перед употреблением биопрепарата в лабораторных условиях проводят оценку их биологической активности на насекомых, которые зимуют в стадии гусениц или яиц (боярышница, непарный шелкопряд, ивовая волнянка, лиственничная листовертка и т.д.). Например, в условиях Иркутской области для этой цели можно использовать гусениц боярышницы, которые питаются листьями яблони, черемухи, реже рябины. Гусеницы третьего возраста зимуют в гнездах по 10 – 30 экземпляров из одного или нескольких листьев. Эти зимующие гнезда собирают поздно осенью и сохраняют в прохладном помещении. В апреле – мае гусеницы могут быть использованы в опытах по определению биологической активности препаратов. До выхода гусениц из гнезд в начале апреля заготовляют побеги веток черемухи для получения зеленого корма. По достижении листовыми пластинками достаточной площади (5 -10 см²) их обрабатывают в различных вариантах биопрепаратом контрольной и проверяемой партии и подсаживают гусениц. Гусениц подопытных и контрольных (необработанных) вариантов содержат в марлевых изоляторах или стеклянных емкостях. Ежедневно садки с гусеницами тщательно осматривают, подсчитывая погибших. На 5 – 7 сутки устанавливают процент гибели насекомых, который и характеризует биологическую активность препарата. Так, если после заражения насекомых препаратом проверяемой партии погибло 60 %, а в стандартной – 90 % гусениц, то биологическая активность снижена на 30 %. Поэтому в производственных условиях норма расхода биопрепарата должна быть повышена, при всех остальных одинаковых условиях (температура, физиологическое состояние насекомых и др.) на эту же величину.

 

Тема 3.3  Иммобилизованные клетки микроорганизмов и их применение

 

Клетки микроорганизмов – неиссякаемый источник ферментов. Они способны выполнять самые тонкие реакции и сложнейшие многостадийные синтезы. Такие процессы не всегда могут быть воспроизведены путем химического синтеза. Кроме того, химические методы в ряде случаев уступают микробиологическим по эффективности, так как имеют больше стадий, происходят в агрессивных средах под высоким давлением и дают низкий выход.

Закрепленные (иммобилизованные) микроорганизмы имеют стабильную работу ферментов. Иммобилизованные микроорганизмы используют для биосинтеза ряда соединений в течение нескольких месяцев и даже лет. Следует напомнить, что в природе, а именно, в почвах, иле, горных породах, на поверхности растений микроорганизмы в основном существуют в закрепленном состоянии. Ещё 150 лет назад в Германии использовали закрепленные на буковой стружке бактерии для производства уксуса. Особое внимание привлекли иммобилизованные клетки в конце 60-х - в начале 70-х годов 20 века. На десятилетие раньше начались работы по иммобилизации ферментов.

Крупномасштабное применение имеют следующие процессы с использованием иммобилизованных ферментов.

1. Получение 6-аминолпенициллиновой кислоты – с помощью иммобилизованной пенициллинамидазы (Россия, Япония, Финляндия).

2. Получение глюкозо-фруктозных сиропов с использованием иммобилизованной глюкозоизомеразы (США, Великобритания, Голландия, Япония, Дания).

3. Разделение смесей аминокислот с помощью фермента – аминоацилазы (Япония).

4. Получение безлактозного молока с помощью фермента лактазы (Чехословакия, США, Италия).

Для иммобилизации применяют микроорганизмы различных таксономических групп: живые клетки, а также мертвые (ацетоновые препараты) и в различной степени поврежденные (замороженные, высушенные и др.). Иммобилизации могут быть подвергнуты не только вегетативные клетки, но и споры микроорганизмов.

Используют для иммобилизации адсорбцию, ковалентное и поперечное связывание, включение в гели. Иммобилизованные клетки применяют в промышленном масштабе при получении аспарагиновой, яблочной кислот (Япония, Китай, США), фенилаланина (США), в виноделии (Дания, Франция), пивоварении (Россия, Чехия).

Приведем способ иммобилизации клеток E.coli, включенных в полиакриловый гель. 10 кг клеток E. coli суспендируют в 40 л физ.раствора, добавляют 7, 5 кг акриламида; 0, 4 кг метиленбисакриламида, 5 л 5 %-ного диметиламинопропионитрила и 5 л 2, 5 % -ного персульфата калия; смесь оставляют при 40 ^оС на 10-15 мин. Образовавшийся гель разрезают на кубики размером 2-3 мм. Время потери 50 % активности такого препарата 120 сут. (неиммобилизованных клеток – 2 сут.). Полученными гранулами заполняют колонку. Раствор фумарата аммония (1 моль/л) пропускают через колонку рН 8, 5; 37 ^оС, скорость протока 0, 6 об/ч. Кристаллы продукта собирают центрифугированием и промывают водой. Выход составляет 3048 кг (95 % от теоретического). Процесс полностью автоматизирован.

Иммобилизованные клетки микроорганизмов – один из перспективных типов биокатализаторов. Широко применяется не только в области синтеза ценных органических соединений, но и при очистке сточных вод и воздуха от загрязнений, для извлечениея из них ценных веществ. Решение проблем биоэнергетики и азотфиксации связано с применением иммобилизованных клеток.

 

Тема 3.4 Бактериофаги в микробиологической промышленности

 

Микробиологическое производство, использующее бактерии-продуценты, может в определенных условиях оказаться зависимым от бактериофагов. Лизис бактерий в промышленных аппаратах-ферментерах, вызванный бактериофагами (фаголизис) снижает выход конечного продукта или ухудшает его качество и тем самым приносит экономический ущерб.

Фаголизис может быть и причиной особого, генетического загрязнения внешней среды. В производстве обычно используются бактериальные культуры ограниченного числа видов. В случае их массового лизиса и попадания определенных фагов во внешнюю среду может наблюдаться не только качественное изменение состава микроорганизмов, но и взаимодействие «производственных» и «природных» фагов. Это может привести к появлению в природных условиях генетически новых вариантов фагов ещё более активно лизирующих данный продуцент или способных лизировать близкородственные виды бактерий. Следовательно, нарушаются сложившиеся биоценотические отношения.

Бактериофаги, способные вызвать инфекцию клеток, имеют 2 состояния: 1- внеклеточный свободный фаг и 2 – состояние вегетативного фага. Внеклеточный фаг биологически неактивен, а вегетативный фаг – активен, это состояние фага после инфекции чувствительных бактерий.

Фаги принято делить на три типа.

1 тип – истинно вирулентные фаги. Инфекция ими неизбежно ведет к гибели инфицированной клетки.

2 тип – умеренные фаги. После инфекции ими возможны 2 варианта: литический (гибель клеток) и лизогенный, т.е. геном умеренного фага переходит в особое состояние – профаг. Клетка, несущая профаг, называется лизогенной или просто лизогеном. В состоянии профага геном умеренного фага передается от клетки ее потомкам при клеточном делении как угодно долго в ряду поколений.

3 тип фагов. Инфицирование ими не ведет к гибели бактерий. Развитие фага сказывается в замедлении скорости деления бактерий.

 

Попадание фагов на производство

То, как фаг попадает на производство, в существенной степени определяется характером самого производства. Так, например, в отраслях промышленности, где производство ведется в открытых емкостях, фаг может попадать в них из воздуха, с добавками и т.д. В случае таких производств (сыроделие, виноделие), лизисы вызываются в основном фагами, попавшими из внешней среды (экзогенные фаги). В этом случае единственной гарантией безлизисного производства может быть использование комплекса специально разработанных мер.

В случае, когда производство ведется в стерильных условиях в специальном аппаратурном оформлении, основным источником фаголизиса являются фаги, имеющие эндогенное происхождение (вирулентные мутанты профагов лизогенных продуцентов) и лишь при нарушении определенных технологических условий (некачественная стерилизация среды, воздуха, добавок и т.п.) лизис может быть вызван экзогенными фагами.

Данные о наличии и количестве фагов, активных в отношении используемого на данном предприятии продуцента систематически регистрируются. Фаговый профиль завода дает оценку фагового фона на данном производстве, создающегося путем периодически возникающих фаголизисов.  Данные фагового профиля завода следует обязательно учитывать при смене продуцента.

Борьба с фаголизисом в производственных условиях состоит из работы по их предупреждению, а также из мероприятий, которые необходимо осуществлять при угрозе фаголизиса, и при окончательном подтверждении роли фагов как основной причины неудачных ферментаций, и после определения пути его попадания на производство.

Профилактические мероприятия:

1) Соблюдение технологической дисциплины: надежность стерилизации питательных сред, воды, воздуха, добавок. Тщательное соблюдение правил санитарии, герметичность оборудования, использование свободного от фагов посевного материала.

2) Использование соответствующих штаммов-продуцентов. Эти штаммы должны по возможности отвечать двум требованиям: быть нелизогенными и быть устойчивыми ко всем известным фагам, активным в отношении данного продуцента.

Специальные меры при возникновении фаголизиса. Необходимо знать признаки, по которым могут быть опознаны неудачные лизисные ферментации.

1. Возрастание титра фага в культуральной жидкости, появление негативных колоний.

2. Вспенивание культуральной жидкости (лизис клеток ведет к освобождению большого количества белков, обеспечивающих устойчивость пены).

3. Медленное нарастание оптической плотности (мутности) культуры может быть обусловлено лизисом части популяции бактерий фагом. В некоторых случаях происходит почти полное просветление суспензии бактерий.

4. Возрастание вязкости культуральной жидкости (из-за освобождения при лизисе высокомолекулярных компонентов – нуклеиновых кислот, полисахаридов).

5. Изменение рН (подкисление среды).

6. Падение уровня выхода конечного продукта.

7. Развитие сопутствующих микроорганизмов может вести к изменению цвета, запаха культуральной жидкости. Наличие фаголизиса и исчезновение бактерий-продуцентов исходной популяции может создать для развития загрязняющих микроорганизмов особо благоприятные условия.

После получения окончательного доказательства роли бактериофага в неудачной ферментации (выделение фага из культуральной жидкости) проводят работы по «гашению» вспышки фаголизиса.

1. Выяснение пути попадания фага на производство (эндогенный или экзогенный мутант ранее встречаемого фага).

2. Если эндогенный фаг – проводят замену продуцента и временно производят другой продукт, с другим продуцентом.

3. Поиск фагоустойчивого штамма в группе заранее отобранных запасных продуцентов и при нахождении такого – немедленное введение его в производство.

4. Проведение очистки (стерилизация) оборудования с использованием физических, химических методов (хлорамин, УФ-излучение и т.д.).

Очевидно, что универсального способа борьбы с фаголизисами не существует. Однако постоянная, систематически проводимая работа по выделению бактериофагов, исследование их свойств, быстрое внедрение фагоустойчивых штаммов бактерий могут стать основой производства, свободного от фаголизиса.

 

ПЕРЕЧЕНЬ КОНТРОЛЬНЫХ ВОПРОСОВ К РАЗДЕЛУ 3

 

1. Требования, предъявляемые к промышленным штаммам микроорганизмов. Как получают промышленные штаммы микроорганизмов?

2. Способы селекции промышленных штаммов микроорганизмов и основные этапы. На основании чего выбирают объект для селекции?

3. Приведите схемы получения новых штаммов микроорганизмов путем естественного мутагенеза, путем искусственного мутагенеза, путем рекомбиногенеза; укажите условия, реагенты, механизмы, результаты.

4. Каким образом стабилизируют, консервируют и хранят промышленные штаммы микроорганизмов?

5. Охарактеризуйте периодическое культивирование: S-кривая роста, фазы роста и их значение. Параметры кривой роста, удельная скорость роста, валовая скорость роста. Период генерации, экономический коэффициент культивирования, влияние концентрации питательных веществ на скорость роста.

⇐ Предыдущая12345678Следующая ⇒

Поделиться: