Раздел 6 Продукты жизнедеятельности микроорганизмов и их промышленное получение

 

К самому большому классу лекарств, получаемых путем микробного синтеза, относятся антибиотики. По разнообразию и показаниям к применению они занимают первое место среди продукции мировой фармацевтической промышленности. Сегодня известно более 6000 видов антибиотиков, более 100 из которых находят применение в медицинской практике, в том числе при лечении таких тяжелых заболеваний, как туберкулез, менингит, плеврит, пневмония.

Второй класс лекарственных веществ, производимых биотехнологическим путем, - гормоны. К традиционным микробиологическим продуктам относятся стероидные гормоны - кортизон, преднизолон, которые широко применяют при лечении различных аллергических заболеваний, в том числе такого тяжелого, как бронхиальная астма, а также ревматоидного артрита и других недугов. Спектр гормональных препаратов, производимых путем микробного синтеза, значительно пополнился за счет пептидных гормонов, представляющих генно-инженерные продукты. Следует отметить такие антивирусные, антиопухолевые и иммуномодулирующие агенты, как интерфероны и интерлейкины.

Среди лекарственных средств особое место занимают ферменты. Известно применение протеолитических ферментов при лечении заболеваний пищеварительных органов, ожоговых поражений и различных ран для удаления некротических тканей. При лечении патологий обмена веществ применяют липазы. Протеиназы с фибринолитическим действием используют для растворения тромбов. С помощью таких препаратов, как стрептокиназа и урокиназа, лечат тромбоз коронарных сосудов сердца, легких, конечностей.

Важный вклад микробной биотехнологии в медицину состоит в получении профилактических препаратов, причем этот вид продукции не имеет дублера в химической промышленности. Большие перспективы в получении новых вакцин открывает генная инженерия. При этом необходимый защитный антиген можно получить с помощью непатогенного микроорганизма и, таким образом, избежать опасностей, связанных с токсичностью обычных вакцин.

По прогнозам, к 2050 году население Земли возрастет до 10 млрд человек и для обеспечения его потребности в продукции сельского хозяйства нужно будет увеличить объемы производства на 75 %. Анализ проблемы обеспечения человека продовольствием специалистами разных стран показал, что в основном она заключается в недостатке белка животного происхождения, который по аминокислотному составу более богат, чем растительный белок. Промышленная микробиология поставляет животноводству по крайней мере три вида важных веществ: кормовой белок или белково-витаминные концентраты (БВК), незаменимые аминокислоты и кормовые антибиотики. Добавление 1 т БВК в корма обеспечивает экономию 7 т фуражного зерна и дополнительное производство 0, 8 т свинины или 5 т мяса птицы. Включение 1 т кормовых дрожжей в рацион телят и поросят позволяет экономить 6 т цельного молока. Наиболее продуктивным сырьем для получения микробного белка следует считать клетчатку, причем преимущественно используются не отходы древесины, а подсолнечная лузга, кукурузные кочерыжки, солома и другие отходы сельского хозяйства, которые ежегодно воспроизводятся. Второй вид биотехнологической продукции - незаменимые аминокислоты, производство которых для медицины и сельского хозяйства интенсивно развивается во всем мире. Среди них такие, как лизин и метионин, обязательно должны содержаться в готовом виде в пище человека и кормах животных. Метионин производят с помощью химической технологии, а лизин - в основном биотехнологически.

Еще одно направление повышения урожайности растений связано с использованием бактерий, фиксирующих атмосферный азот. Фиксацию азота обеспечивают ферменты - продукты nif-генов. В настоящее время практически решена проблема увеличения дозы nif-генов у клубеньковых бактерий рода Rhizobium. Большинство генов, контролирующих способность этих бактерий к симбиозу с бобовыми растениями, локализуется на плазмидах. Это расширяет возможности использования методов генной инженерии для увеличения эффективности азотфиксации и как следствие - улучшения азотного питания растений.

 

Классификация продуктов биотехнологических производств

Спектр продуктов, образующихся методами биотехнологии, необычайно широк и разнообразен. Од­ноклеточные организмы используют для получения биомассы, являющейся источником кормового белка. Клетки, особенно в иммобилизованном состоянии, выступают в роли биологических катализаторов для процессов биотрансформации.

Процессами биотрансформации называют реакции превращения исходных органических соединений (предшественников) в целе­вой продукт с помощью клеток живых организмов или фермен­тов, выделенных из них. В последние годы высокая специфичность процессов биотрансформации и эффективность иммобилизован­ных ферментов нашли широкое применение для крупномасштаб­ного производства аминокислот, антибиотиков, стероидов и дру­гих промышленно важных продуктов.

Продуктами биотехнологических производств являются при­родные макромолекулы — белки, ферменты, полисахариды.

Первичные метаболиты необходимы для роста клеток. К ним относятся структурные единицы биополимеров — аминокислоты, нуклеотиды, моносахариды, а также витамины, коферменты, органические кислоты и другие соединения. Вто­ ричные метаболиты (антибиотики, пигменты, токсины) — низ­комолекулярные соединения, не требующиеся для выживания клеток и образующиеся по завершении фазы их роста.  

Центральное звено биотехнологического процесса — живая клетка, в которой одномоментно синтезируется великое множе­ство разнообразных соединений. В норме обмен веществ в клетке осуществляется по принципам строжайшей экономии, что обес­печивается сложнейшей системой регуляции обмена веществ. За­дача биотехнолога состоит в обеспечении сверхсинтеза одного из продуктов метаболизма, что достигается как путем изменения ге­нетической программы организма, так и посредством нарушения регуляторных систем метаболизма в нем.

 

Тема 6.1 Биотехнология получения первичных метаболитов. Производство аминокислот

Среди соединений, получаемых биотехнологическими методами, аминокислоты занимают первое место по объему производства и второе место по стоимости, уступая по последнему параметру лишь антибиотикам. Объем мирового производства аминокислот со­ставляет более 500 тыс. т в год, из которых 300 тыс. т приходится на глутамат натрия, 100 тыс. т на лизин и 140 тыс. т на метионин. Одна­ко указанный объем — лишь небольшая доля от требуемого коли­чества аминокислот. По данным ВОЗ, потребность человечества всего лишь в четырех незаменимых аминокислотах составляет, млн т: для лизина — 5, метионина — 4, треонина — 3, 7 и триптофана — 2.

Аминокислоты — структурные единицы белков. Природные ами­нокислоты вовлечены в биосинтез ферментов, ряда гормонов, витаминов, антибиотиков, алкалоидов, токсинов и других азот­содержащих соединений (пурины, пиримидины, гем и пр.). В орга­низме животного практически половина белковых аминокислот не синтезируется. Они называются незаменимыми аминокислотами и должны поступать в организм с пищей. Недостаток каждой из этих аминокислот в пищевом или кормовом рационе приводит к нарушению обмена веществ, замедлению роста и развития.

Помимо применения в качестве пищевых добавок, приправ и усилителей вкуса аминокислоты используют как сырье в хими­ческой, парфюмерной и фармацевтической промышленности и при производстве ряда других веществ:

глицин — подсластитель, антиоксидант, бактериостатик;

аспарагиновая кислота — усилитель вкуса, сырье для синтеза аспартама;

глутаминовая кислота — усилитель вкуса, препарат для лече­ния психических заболеваний;

гистидин — противовоспалительное средство;

метионин — пищевая и кормовая добавки;

цистеин — фармацевтический препарат;

треонин и триптофан — пищевые и кормовые добавки;

фенилаланин — сырье для получения аспартама;

лизин — пищевая и кормовая добавки, сырье для получения искусственных волокон и пленок.

В промышленных масштабах белковые аминокислоты получают:

1) гидролизом природного белоксодержащего сырья;

2) химическим синтезом;

3) микробиологическим синтезом;

4) биотрансформацией предшественников аминокислот с по­мощью микроорганизмов или выделенных из них ферментов (химико-микробиологический метод).

Существенный недостаток методов химического синтеза ами­нокислот состоит в получении целевых препаратов в виде раце­мической смеси D- и L-стереоизомерных форм. Подавляющее боль­шинство природных аминокислот относится к L-ряду. D-a-аминокислоты обнаружены лишь в составе гликопротеинов клеточ­ных стенок бактерий, антибиотиков и некоторых токсинов. Про­ницаемость L-аминокислот в клетке в 500 раз превышает таковую ее антипода. Стереоспецифичны также транспорт и метаболизм аминокислот. Исключением в этом отношении является лишь метионин, метаболизм которого не стереоизбирателен, благодаря чему данная аминокислота получается преимущественно путем хими­ческого синтеза. Разделение рацематов других аминокислот — до­рогая и чрезвычайно трудоемкая процедура.

Наиболее перспективен и экономически выгоден микробиоло­ гический синтез аминокислот. Более 60 % всех производимых в на­стоящее время промышленностью высокоочищенных препаратов белковых аминокислот получают именно этим способом, главное преимущество которого в сравнении с методами химического син­теза состоит в возможности получения L-аминокислот на основе возобновляемого сырья.

Перспективные штаммы продуцентов постоянно улучшают по­средством селекции мутантов с измененной генетической про­граммой и регуляторными свойствами. Распространенные объек­ты селекции продуцентов — микроорганизмы, относящиеся к родам Brevibacterium, Micrococcus, Corynebacterium, Arthrobacter (табл. 8).

Аминокислоты – первичные метаболиты. Они синтезируются в клетке только в нужном количестве, и их биосинтез находится под строгим контролем. Для получения сверхсинтеза нужно обойти этот контроль.

В промышленности чаще используют микроорганизмы: коринебактерии (Corynebacterium glutamatum), бревибактерии (Brevibacterium flavum), E. coli (сконстр. методами генетической инженерии) p. Mucrococcus.

Микроорганизмы выращивают на определенной питательной среде.

 

 

Таблица 8

Микроорганизмы — продуценты аминокислот

(по Н. Б. Градовой и О. А. Решетник, 1987)

Аминокислота	Микроорганизмы
Аргинин	Е. coli, Bacillus subtilis, Corynebacterium glutamicum
	Brevibacterium flavum, Serratia marcescens
Гистидин	B.flavum, C. glutamicum, S. marcescens, виды Steptomyces
Изолейцин	B. flavum, C. glutamicum, B. subtilis, S. marcescens
Лейцин	Brevibacterium lactofermentum, S. marcescens, C. glutamicum
Лизин	B. flavum, C. glutamicum
Фенилаланин	B. flavum, C. glutamicum
Пролин	B. flavum
Серии	C. glutamicum

После ферментации культуральную жидкость высушивают. Получается  кормовой препарат, или экстрагируют аминокислоты из культуральной жидкости и очищают с помощью ионообменных смол с последующей кристаллизацией. Получают  высокоочищенный препарат.

 

Получение глутаминовой кислоты (дикий штамм):

1 способ получения глутаминовой кислоты – использование дикого штамма со сниженной активностью фермента. Глутаминовая кислота выделяется из клетки, особенно при ее увеличенной проницаемости цитоплазматической мембраны.  Проницаемость цитоплазматической мембраны повышается, если клетке не хватает биотина (не синтезируется или мало в питательной среде).

2 способ: выращивание микроорганизмов, которые не синтезируют биотин, в среде с низкой его концентрацией (1-5 мкг/л). Если его будет достаточно, то происходит рост, а не синтез глутаминовой кислоты. Иногда для увеличения проницаемости цитоплазматической мембраны используют пенициллин, цефалоспирин, поверхностно активные вещества.

Штамм: C. glutamaticum, требующий биотин на углеводных средах. Выход составляет 50% при использовании сахаров, концентрация - 100 г/л.

 

Получение лизина (использование мутантов)

Лизин занимает 2 место в кормопроизводстве после метионина. Злаки им обеднены. Так как одновременно образуется 3 аминокислоты, то для большего получения одной необходимо блокировать процесс образования двух  других. Фермент аспартаткиназа ингибируется по принципу обратной связи, то есть при большой концентрации треонина и лицина, синтез кислот останавливается, и наоборот. Используют повышение проницаемости клеточных мембран, т.е. в среде мало биотина; есть пенициллин (2-4 мкг/л); детергенты (твин 40, 60) (1-5 мкг/л).

В качестве источников углерода наиболее достаточны глюкоза, сахар. Для снижения стоимости среды используют вторсырье: свежая меласса, молочная сыворотка, гидролизаты крахмала, сульфитные щелока. В качестве источников азота используют  мочевину, соли аммония. Добавляют стимуляторы роста:  экстракты кукурузы, гидролизаты отрубей, дрожжи, а также микро и макроэлементы.

Схема производства

1. Получение посевного материала – 1 сут.

2. Приготовление и стерилизация питательной среды

3. Подготовка и стерилизация воздуха

4. Ферментация  55-72 ч. (лизин появляется в культуральной жидкости через  25-30 ч.).

5. Выделение целевого продукта. Жидкий концентрат  подкисляют НСl, добавляют для стабилизации бисульфат натрия, упаривают, сушат

 

Подобные реакции и техника используются для получения изолейцина, орнитина, цитрулина, гистидина, аргинина.

При получении аминокислот L-треонин L-триптофан  используют мутанты генной инженерии штамма E. coli, выхот продукта соответственно  20 и 6 г/л. Фенилаланин, тирозин – в природных условиях уровень синтеза низкий, обойти нельзя.

Особенность процессов получения аминокислот микробиологическим синтезом: полное использование побочных продуктов. Осадок микроорганизмов, промывают водой, высушивают. Получается кормовой  препарат.

 

⇐ Предыдущая12345678Следующая ⇒

Поделиться: