Глюкозооксидазний метод визначення вмісту глюкози у крові, сироватці крові, спинальній рідині.

Принцип методу. Фермент глюкозооксидаза окиснює глюкозу з утворенням глюконової кислоти і гідроген пероксиду, який окиснює о-толідин, внаслідок чого утворюється сполука блакитно-синього кольору:

Інтенсивність забарвлення прямо пропорційна концентрації глюкози в розчині та визначається колориметрично.

Метод високоспецифічний і чутливий. Дає змогу визначати вміст глюкози від 0,2 до 4,0 г/л.

Матеріал для дослідження: кров, сироватка крові, спінальна рідина.

Реактиви: стандартний розчин глюкози (1 г/л), ізотонічний розчин натрій хлориду, 5% розчин цинк сульфату, 0,3М розчин натрій гідроксиду, ензимо-хромогенний реактив, дистильована вода.

Обладнання: штатив з пробірками, центрифужні пробірки, піпетки на 1 і 5 мл, центрифуга, ФЕК, кювета довжиною оптичного шляху 10 мм.

Хід роботи. У центрифужну пробірку внести 0,1 мл крові (сироватки крові, спінальної рідини) і 1,1 мл ізотонічного розчину натрій хлориду, перемішати. Додати 0,4 мл 5% розчину цинк сульфату та 0,4 мл 0,3М розчину натрій гідроксиду. Суміш ретельно перемішати і через 10 хв. відцентрифугувати при 2500 об./хв. протягом 10 хв.

Взяти три пробірки: в першу (дослідну) внести 1 мл центрифугату, у другу (стандартну) - 1 мл стандартного розчину глюкози, у третю (контрольну) - 1 мл води. В кожну пробірку додати по 3 мл ензимо-хромогенного реактиву, перемішати.

Через 20 хв. (!) визначити екстинкцію стандартної і дослідної проби на ФЕК (червоний світлофільтр, 600-650 нм, кювета довжиною оптичного шляху 10 мм) відносно контролю.

Розрахунок вмісту глюкози в біоматеріалі провести за формулою:

С_д – вміст глюкози в дослідній пробі (мМоль/л);

С_ст – вміст глюкози у стандартній пробі (мМоль/л);

Е_д – екстинкція дослідної проби;

Е_ст – екстинкція стандартної проби;

 

У цільній крові практично здорових людей вміст глюкози складає 3,32-5,55 мМоль/л, а у плазмі – 3,32-6,10 мМоль/л. Сеча практично здорових людей містить сліди глюкози. В добовому об'ємі сечі може міститися до 125-130 мг глюкози.

Дати відповіді на запитання

1. Дати визначення поняття «цукор крові» та «істинна глюкоза крові».

2. Назвати основні шляхи поповнення вмісту глюкози у крові.

3. Записати схему циклу Корі.

4. Роль печінки в регуляції вмісту цукру у крові.

Зауваження

1. Цільну кров необхідно досліджувати відразу після відбирання. При зберіганні крові концентрація глюкози в ній швидко зменшується внаслідок гліколізу (швидкість зниження 7% за годину). Запобігти цьому можна внесенням у пробу натрій фториду.

2. Не слід залишати кров невідцентрифугованою більше ніж на30 хв.

3. Сироватку, яку зберігали тривалий час, не бажано використовувати для аналізу.

4. У сироватці крові чи плазмі концентрація глюкози стабільна при температурі 2-8 ⁰С протягом 3 діб (72 год.).

5. Концентрація глюкози не знижується при стабілізації ТХА.

6. За 3 доби до проведення аналізу необхідно виключити вживання аскорбінової кислоти та антибіотиків тетрациклінового ряду.

7. Якщо після кип'ятіння вміст пробірок став непрозорим, проби слід відцентрифугувати протягом 10 хв. і визначити екстинкцію центрифугату.

ЛАБОРАТОРНЕ ЗАНЯТТЯ №20

⇐ Предыдущая123456Следующая ⇒

Поделиться: