Б. Лабораторний практикум.

Визначення вмісту піровиноградної кислоти у крові та сечі (модифікований метод Умбрайта)

Принцип методу . Піровиноградна кислота в кислому середовищі при дії 2,4-динітрофенілгідразину осаджується в вигляді 2,4-динітрофенілгідразону піровиноградної кислоти, який з лугом утворює сполуку червоно-коричневого кольору. Інтенсивність забарвлення пропорційна концентрації піровиноградної кислоти і визначається колориметрично.

Матеріал для дослідження: сеча, кров.

Реактиви: стандартний розчин натрій пірувату (5 мг%), 0,1% розчин ДНФГ, 12% розчин натрій гідроксиду, 10% ТХА (термін зберігання не більше 1 міс.), дистильована вода.

Обладнання: штатив з пробірками, піпетки на 1 мл, центрифужні пробірки, центрифуги, ФЕК, кювета довжиною оптичного шляху 5 мм.

Хід роботи. Визначення ПВК у крові. В центрифужну пробірку внести 0,3 мл крові та 0,7 мл води і після перемішування додати 1 мл 10% розчину ТХА та відцентрифугувати при 1500 об./хв. Протягом 15 хв.

Взяти три пробірки: в першу (дослідну) внести 0,3 мл надосадової рідини, у другу (стандартну) - 0,3 мл стандартного розчину натрій пірувату, у третю (контрольну) - 0,3 мл води. В кожну пробірку додати по 0,4 мл 0,1% розчину ДНФГ, перемішати та поставити в темне місце на 20 хв., після чого додати по 1 мл 12% розчину натрій гідроксиду.

Через 5 хв. визначити екстинкцію стандартної і дослідної проби на ФЕК (синій світлофільтр, кювета довжиною оптичного шляху 5 мм) відносно контролю.

Визначення ПВК у сечі. Взяти три пробірки: в першу (дослідну) внести 0,3 мл розведеної у 3 рази сечі, у другу (стандартну) – 0,3 мл стандартного розчину натрій пірувату, у третю (контрольну) – 0,3 мл води. В кожну пробірку додати по 0,5 мл 0,1% розчину ДНФГ, перемішати і поставити в темне місце на 20 хв. Після цього додати по 1 мл 12% розчину натрій гідроксиду.

Через 5 хв. визначити екстинкцію стандартної і дослідної проби на ФЕК (синій світлофільтр, кювета з довжиною оптичного шляху 5 мм) відносно контролю.

Розрахунок вмісту піровиноградної кислоти провести:

1. За формулою:

 

Сд. – вміст ПВК у дослідній пробі (мг%);

С_ст – вміст ПВК у стандартній пробі (мг%);

Е_д – екстинкція дослідної проби;

Е_ст. – екстинкція стандартної проби.

У випадку визначення вмісту ПВК сечі необхідно врахувати її розведення.

2. За калібрувальною кривою, для побудови якої з основного стандартного розчину (200 мг/л) піровиноградної кислоти приготувати серію розведень.

Взяти шість пробірок, в які внести відповідно 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5 та 0,6 мл основного стандартного розчину ПВК і загальний об'єм розчину довести дистильованою водою до 10 мл.

Після цього з кожної пробірки відібрати по 0,3 мл розчину і перенести в інші пронумеровані пробірки із врахуванням концентрації в них ПВК. Проби обробити як дослідні.

На основі отриманих результатів побудувати калібрувальну криву: на осі абсцис відкласти значення концентрації ПВК, а на осі ординат – відповідні їм значення екстинкції.

У крові практично здорових людей вміст ПВК складає 0,114 мМоль/л (10 мг/л). Концентрація ПВК у крові немовлят у тричі вища. За добу з сечею практично здорових людей виділяється 200 мг піровиноградної кислоти.

Підвищення екскреції відмічають при нестачі вітаміну В₁ та гіпоксіях різного походження.

Дати відповіді на запитання

1. Записати схему утворення ПВК з глюкози.

2. Які шляхи перетворення ПВК в організмі?

3. Пояснити принцип методу визначення ПВК в біоматеріалі.

 

ЛАБОРАТОРНЕ ЗАНЯТТЯ №22

⇐ Предыдущая123456Следующая ⇒

Поделиться: