Глава 3. ПЦР диагностика внелегочных форм туберкулеза

 

Туберкулез поражает практически любой орган. По локализации различают: костно-суставный (встречается у 47 % всех больных внелегочным туберкулезом); мочеполовых органов (37 %); глаз (5, 5 %); мозговых оболочек (менингит - 4 %); лимфатических узлов (2, 5 %); брюшины (1, 5 %); кожи (1, 5%).

Совсем редко встречается туберкулез других органов: перикарда, надпочечников, кишечника и т.д. Внелегочными формами туберкулеза чаще болеют взрослые (79 %) и реже - дети и подростки (соответственно 16 % и 5%).

Независимо от места поражения цикл воспаления везде одинаков: очаг (гранулема) - расплавление его (казеоз) - образование полости распада (каверна) - возникновение при санировании фиброза (склерозирование). Начальные проявления заболевания при минимальных поражениях дают картину интоксикации организма. По мере распространения процесса его симптоматика зависит от нарушений, присущих пораженному органу.

Рекомендуемый для исследования материал:

при гинекологическом туберкулезе - ткань эндометрия или биоптаты маточных труб;

при туберкулезе костей у детей - фрагменты костей;

при туберкулезе костей у взрослых - гной, некротические массы;

при туберкулезе суставов - параллельное исследование синовиальной жидкости и синовиальной оболочки.

при туберкулезном менингите - менингеальная жидкость

При других внелегочных локализациях туберкулеза - биоптаты из очагов поражения (слизистая кишечника, биоптат надпочечников и т.д.).

Подготовка образцов послеоперационного и биопсийного материала к ПЦР-анализу.

Из твердых клинических образцов, отобранных для анализа методом ПЦР, отделяют по два фрагмента, так, чтобы в случае разнородности материала (фрагмент кости - грануляции, ткань почки - гной) в исследуемые фрагменты попали все типы материала. Отделенные фрагменты подвергают щелочному лизису. К 0.05 куб. см тщательно растертого стеклянной палочкой образца приливают 0.11 мл раствора, содержащего 0.1М NaOH, 1М NaCl и 0.5% додецилсульфата натрия, тщательно встряхивают и инкубируют 10 мин. на кипящей водяной бане. После охлаждения до комнатной температуры ДНК из образцов костей и суставов выделяют методом сорбции на диатомовой земле в присутствии солей гуанидина с предварительным осаждением изопропанолом.

Из образцов ткани (ткань почки, эндометрий, биоптаты маточных труб) ДНК для ПЦР после щелочного лизиса выделяют следующим образом. К каждому образцу добавляют по 900 мкл раствора, содержащего 6М роданистый гуанидин, 2% Triton Х-100 и 0.05М ЭДТА и по 10 мкл суспензии сорбента (диатомовой земли). Инкубируют 20 мин. при комнатной температуре, периодически встряхивая, затем центрифугируют 15 сек. при 10000g. Дважды проводят отмывку 0.5 мл 4М роданистого гуанидина[5]. Однократно проводят отмывку 1 мл изопропанола. Дважды проводят отмывку 70.0% этанолом и однократно - ацетоном. При проведении отмывок после добавления отмывочного реагента образцы интенсивно встряхивают и центрифугируют 15 сек. при 10000g, после чего супернатант аккуратно отсасывают или сливают. В случае, если после отмывки каким-либо из отмывочных реагентов супернатант имеет выраженную окраску, повторяют отмывку этим реагентом. После последней отмывки осадок подсушивают с открытой крышкой 5-10 мин. при 50 град. C, а затем ДНК элюируют с сорбента ТЕ-буфером (встряхивают с 50 мкл буфера и инкубируют 10 мин. с закрытой крышкой при 50 град. C) и центрифугируют 15 сек. при 10000g. Супернатант отбирают, стараясь не захватывать частицы осадка диатомовой земли, и используют для проведения ПЦР. ПЦР проводят параллельно с двумя фрагментами каждого образца.

Синовиальную жидкость от одного больного разливают по микроцентрифужным пробиркам в объеме 1.5 мл и центрифугируют 5 мин. при 10000g. Супернатант сливают. В случае если объем осадка составляет менее 20 мкл, объединяют осадки из нескольких центрифужных пробирок. Осадки инактивируют нагреванием, для чего к ним добавляют 100 мкл физиологического раствора и инкубируют 15 мин. на кипящей водяной бане. Далее ДНК выделяют так же, как из образцов тканей, и используют для проведения ПЦР.

Чувствительность и специфичность метода ПЦР для диагностики внелегочного туберкулеза ничуть не отличается от легочного туберкулеза. Можно сказать, что независимо от формы туберкулеза эффективность ПЦР диагностики остается самой высокой.

 

Глава 4. Роль метода ПЦР в дифференциальной диагностике различных заболеваний органов дыхания.

 

Заболеваний органов дыхания существует огромное количество, но мы разберем лишь часть из них, как показательный пример роли метода ПЦР в их дифференциальной диагностике с туберкулезом легких.

 

Таблица №1 Основные дифференциально-диагностические признаки ОТБ и сходных заболеваний.

Признаки	Пневмония	Доброкачест- венные опухоли	Пери-фери-ческий рак	Метаста- тичес-кий рак	Очаговый туберкулез
Начало заболевания	Острое	Бессимптомное
Характерные данные анамнеза	Контакт по ОРВИ, простуда, пневмония	Нет		Приз-наки основ-ной опухоли	Контакт с ТБ или «рентгено-архив» по ТБ
Влажные хрипы в легких	Часто	Нет			Редко
Изменения гемограммы	Имеются	Нет	Выражены (анемия, ↑ СОЭ) при значительном прогрессировании,		Чаще отсут-ствуют
Бактериоло-гия мокроты	Бактериаль-ная патогенная флора	Обычно сапрофитная флора			У 10-15% больных -МБТ(+)
Цитология мокроты	-	-	Иногда атипичные клетки		-
Бронхо-скопия	Катараль-ный эндобранхит	-	Возможно опухолевое поражение бронхов		У 20-30% ТБ бронхов
Локализа-ция теней	Чаще средние и нижние отделы	Нет строгой локализации, при периферическом раке, чаще средние и нижние отделы			Верхушка легкого
Контуры тени	Нечеткие	Четкие	Лучистые	Четкие
Вовлечение корня легкого	Иногда	Нет	Возможно, но редко		Редко
Динамика	Быстрое исчезновение теней	Отсут-ствие	Удвоение за полгода	Возможны новые тени	Обычно незначительная
ПЦР диагностика на МБТ	-	-	-	-	Положительна в 90-95%

 

Основываясь на данные таблицы №1 можно сказать, что для дифференциальной диагностики органов дыхания нужно учитывать множество факторов, но метод ПЦР ставит окончательную «жирную точку» на постановке диагноза туберкулеза. Единственным значительным минусом этого метода является его дороговизна.

DNA-STRIP технология

Принцип метода

На ДНК-стрипы нанесены специфические пробы, которые комплементарны амплифицируемым нуклеиновым кислотам (ампликонам). После денатурации одноцепочечные ампликоны специфически связываются с пробами на стрипах (гибридизация) и затем визуализируются в последовательной энзиматической реакции (со стрептавидином и щелочной фосфатазой).

Молекулярно-генетическое исследование для идентификации видо микобактерий из культурального материала

Методология

Тест Geno Type Mycobacterium AS (Additional Species) основан на технологии DNA•STRIP® и обеспечивает идентификацию следующих

видов бактерий: M. simiae, M. mucogenicum, M. goodii, M. celatum, M. smegmatis, M. genavense, M. lentiflavum, M. heckeshornense,. szulgai/M. intermedium, M. phlei, M. haemophilum, M. kansasii, M. ulcerans, M. gastri, M. asiaticum, и M. shimoidei.

Процедура проведения теста подразделяется на три этапа: Выделение ДНК из культур (выросших на плотной или жидкой среде; необходимые для этого реагенты в наборе не поставляются), мультиплексная амплификация с биотинилированными праймерами (необходимая термостабильная ДНК полимераза не поставляется), реверс-гибридизация. Гибридизация включает следующие этапы: химическая денатурация продуктов амплификации, гибридизация одноцепочечных ампликонов, меченых биотином, на мембраносвязанных зондах, тщательная отмывка, добавление конъюгата стрептовидина/щелочной фосфатазы (АР) и опосредованная щелочной фосфатазой, реакция окрашивания. Простая и быстрая оценка полученных результатов проводится с помощью прилагаемого шаблона.

⇐ Предыдущая12345Следующая ⇒

Поделиться: