Обработка с использованием N-ацетил-l-цистеина и гидроокиси натрия (NALC-NаOH).

Применение муколитического препарата N-ацетил-L-цистеина (NALC), используемого для быстрого разжижения мокроты, позволяет снизить концентрацию деконтаминирующего вещества (NaOH) до конечной концентрации 1% при смешивании с пробой. Этот метод повышает высеваемость микобактерий, однако требует больше затрат времени и средств. Ацетилцистеин в растворе быстро теряет активность, поэтому раствор нужно готовить ежедневно. Цитрат натрия включен в литическую смесь для связывания ионов тяжелых металлов, которые могут присутствовать в пробе и инактивировать действие N-ацетил-L-цистеина.

Обработку материала NALC-NаOH производят следующим образом:

К 10 мл или меньше диагностического материала добавляют равный объем раствора NALC-NаOH, встряхивают в течение 10-20 секунд для перемешивания пробы, затем оставляют на 15 минут при комнатной температуре. Если необходима более эффективная деконтаминация, можно повысить концентрацию NaOH до 5-6%, не увеличивая время экспозиции пробы с деконтаминирующим раствором.

После 15-минутной экспозиции доводят объем пробы до 50 мл дистиллированной водой, перемешивают и центрифугируют при 3000g в течение 15 мин. Надосадочную жидкость отбирают. Осадок немедленно засевают на питательную среду с параллельным приготовлением мазка.

Подготовка пробирок и посев образца для автоматизированной системы BACTEC MGIT 960

Пробирка MGIT 960 содержит модифицированную бульонную основу 7H9.Примерная формула содержит следующие компоненты на 1000 мл дистиллированной воды:

модифицированная бульонная основа Мидлбрук 7H9 - 5, 9 г

казеиновый пептон - 1, 25 г.

Формула корректируется с возможным внесением добавок в зависимости от функциональных требований. На дне пробирки имеется помещенный в силикон флуоресцентный датчик. Пробирку во время наполнения промывают 10% CO₂, затем закрывают полипропиленовой завинчивающейся крышкой. Крышку открывать следует только в случае необходимости внесения каких-либо веществ в среду.

Для системы BACTEC MGIT 960 предусмотрена ростовая добавка MGIT(MGIT Growth Supplement. Добавку необходимо добавлять в пробирку MGIT до инокуляции пробы. В состав ростовой добавки MGIT на 1 000 мл дистиллированной воды входят:

бычий альбумин 50, 0 г

декстроза 20, 0 г

каталаза 0, 03 г

олеиновая кислота 0, 1 г

полиоксиэтилена стеарат 1, 1 г

Для снижения риска контаминации используется смесь антибиотиков PANTA, которая вносится в пробирку MGIT до инокуляции проб вместе с обогатительной добавкой. Каждый флакон MGIT PANTA (для MGIT 960) содержит лиофилизированную смесь антибактериальных препаратов со следующей концентрацией на момент изготовления:

полимиксин B 6, 000 ед.

амфотерицин B 600 мг

налидиксовая кислота 2, 400 мг

триметоприм 600 мг

азлоциллин 600 мг

Процедура подготовки пробирок MGIT и посев образца.

a. Разведение лиофилизированной добавки PANTA

• Растворить PANTA (добавку с антибиотиками для подавления роста посторонней флоры) в 15 мл обогатительной добавки MGIT Growth Supplement, добавив ее во флакон с PANTA. Оставить на 15 минут.

• Добавить 0, 8 мл полученного раствора в каждую пробирку MGIT непосредственно перед посевом материала.

• Все манипуляции проводить в ламинарном боксе II- класса защиты.

b. Посев в пробирку MGIT

Все этапы работы должны выполняться только в ламинарном боксе II- класса защиты.

• Внимательно осмотреть пробирку MGIT и убедиться, что она пригодна для работы (наличие силиконового кольца на дне пробирки, объем жидкости - 7 мл, крышка плотно закрыта).

• Написать на пробирках идентификационные лабораторные номера.

• С помощью стерильной одноразовой пипетки внести 0, 5 мл ресуспендированного осадка в подготовленною пробирку MGIT и 0, 1-0, 25 мл в пробирку с плотной питательной средой Левенштейна-Йенсена.

• Закрыть немедленно после внесения плотно крышку пробирки и аккуратно несколько раз перевернуть пробирку, чтобы перемешать содержимое.

• Обработать снаружи пробирки и пробки дезсредством, поместить пробирки в штатив и оставить на 30 минут при комнатной температуре.

• Для исключения перекрестной контаминации и поддержания оптимальной концентрации углекислого газа в пробирках, всегда необходимо открывать только одну пробирку на минимально возможное время.

с. Меры предосторожности

Основным источником контаминации среды MGIT являются микроорганизмы из окружающей среды, попавшие в пробирку во время внесения добавок и материала, поэтому необходимо соблюдать следующие правила:

. Все добавки вносить только в ламинарном боксе II-класса защиты.

. Не открывать несколько пробирок одновременно.

. Открывать пробирку MGIT на максимально короткое время.

. При внесении ростовой добавки рекомендуется пользоваться дозатором.

. Всегда плотно закручивать крышку. Если она сидит неплотно, могут возникнуть сложности с детекцией флуоресценции.

. Проба, внесенная в пробирку объемом более 0, 5 мл, может повлиять на показатель pH среды и вызвать ложную флуоресценцию, а также может усилить контаминацию.

d. Инкубация

Все засеянные пробирки MGIT необходимо поместить в прибор. Протокол исследования на автоматизированной системе BACTEC MGIT 960 -6 недель.

Температура инкубации для микобактерий туберкулеза + 37°С, допустимые колебания температуры от + 35°С до +38°С. В процессе инкубации встряхивание и перемещение пробирок запрещено.

е. Детекция положительного роста

О появлении положительной пробирки прибор сообщает появлением красной индикации на наружной панели соответствующего ящика и значка «+», а также звуковым сигналом.

При наличии индикации о положительном результате необходимо открыть указанный ящик; нажать клавишу под иконкой «извлечь положительные пробирки»; извлечь пробирку из указанной прибором ячейки; считать штрих-код извлеченной пробирки.

Следует просмотреть пробирку и визуально определить наличие роста микобактерий. Обычно в жидкой среде микобактерии растут в виде своеобразной «зернистости» или белых хлопьев, при этом прозрачность среды может почти не меняться. Как правило, рост микобактерий сосредоточен на дне пробирки. Сильное помутнение среды может свидетельствовать о наличии контаминации посторонней флорой.

Максимальное время инкубации пробирок в приборе MGIT - 42 дня. Пробирки, в которых размножение микобактерий не зафиксировано прибором в течение указанного времени, идентифицируются системой как отрицательные. В этом случае прибор сообщает появлением зеленой индикации на наружной панели соответствующего ящика и звуковым сигналом.

Для того чтобы извлечь «отрицательные» пробирки, необходимо открыть соответствующий ящик и нажать клавишу под иконкой «извлечь положительные пробирки» - прибор укажет зеленым световым сигналом на те пробирки, которые необходимо удалить. Необходимо извлечь пробирку из ячейки и отсканировать штрих-код, а также просмотреть пробирку, пытаясь визуально определить наличие возможного роста микобактерий и контаминации (мутность, дисперсность и т.д.).

Молекулярно-генетическое исследование для идентификации видов микобактерий из культурального материала

Выделение ДНК

Исходным материалом для теста могут быть бактерии, выросшие как на плотной среде (Левенштайна-Йенсена, Миддлбрук), так и в жидкой (например, BACTEC, MB-check). Тест не подходит для детекции микобактерий из прямого материала пациентов. Рабочая площадь должна быть чистой от амплифицированной ДНК. Решающим моментом является нагревание образцов до 95°C в течение 20 минут, чтобы обеспечить полный лизис клеток и инактивировать вегетативные бактерии. Можно применять любые методы выделения ДНК, позволяющие получить амплифицируемую ДНК из бактерий. Следующий краткий протокол позволяет получить ДНК, подходящую для амплификации:

а. При работе с бактериями, выросшими на плотной среде, петлей отобрать бактерии и суспендировать в примерно 300 мкл воды.

(вода должна быть пригодна для молекулярно-биологических исследований)

б. При работе с бактериями, выросшими на жидкой среде, в работу берётся 1 мл. Бактерии осаждают при центрифугировании в ттечение 15 мин при 10000g в стандартной настольной центрифуге с аэрозоль-непроницаемым ротором в ламинарном боксе II класса.

Супернатант слить, а бактерии ресуспендировать на вортексе в 100-300 мкл воды.

. Инкубировать бактерии из пп. 1а и 1б на водяной бане 20 минут при 95°C.

. Обработать пробу в ультразвуковой бане в течение 15 мин

. Центрифугировать пробу на максимальной скорости 5 мин, и использовать 5 мкл супернатанта для ПЦР. Если предполагается более

длительное хранение, то раствор ДНК необходимо перенести в новую пробирку.

Амплификация

Подготовить амплификационную смесь (по 45 мкл) в чистой от ДНК комнате. Образцы ДНК следует вносить в пробирки в отдельном помещении.

Микс на одну пробирку:

- 35 мкл PNM - поставляется в наборе

5 мкл 10-кратного полимеразного буфера для инкубации - не поставляется

х мкл раствора MgCl21) - не поставляется

1-2 единицы термостабильной ДНК-полимеразы (см. данные изготовителя) - не поставляется

у мкл воды для доведения объёма до 45 мкл (без учета объема фермента) - не поставляется

Добавить 5 мкл раствора ДНК (20-100 нг ДНК) для получения конечного объема 50 мкл (без учета объема фермента)

) В зависимости от используемой системы фермент/буфер, оптимальная концентрация MgCl2. может варьировать между 1.5 и 2.5 мМ.

Обратите внимание, что некоторые инкубационные буферы уже содержат MgCl2.

При испытательных изучениях наборов GenoType® Mycobacterium AS применялась HotStarTaq ДНК- полимераза от Qiagen. При

использовании этого фермента, на один образец необходимы следующие количества:

35 мкл PNM (поставляется в наборе)

5 мкл 10-кратного ПЦР буфера для HotStarTaq (содержит 15 мМ MgCl2) - не поставляется

2 мкл 25мМ раствора MgCl2 - не поставляется

0.2 мкл (1 Ед) HotStarTaq - не поставляется

3 мкл воды (для молекулярно-биологических исследований) - не поставляется

5 мкл раствора ДНК (вносить в отдельной чистой зоне)

Конечная концентрация MgCl2 в этой амплификационной смеси составляет 2.5 мM.

Определите количество образцов для амплификации (количество анализируемых проб + контрольные образцы). Проба контроля контаминации, например, содержит 5 мкл воды вместо раствора ДНК. Подготовить мастер-микс, содержащий все реактивы, за исключением раствора ДНК, и хорошо перемешать (не на вортексе). Аликвотировать по 45 мкл в каждую подготовленную ПЦР-пробирку.

Программа амплификации2):

15 мин 95°C 1 цикл

сек 95°C

мин 58°C

сек 95°C

сек 53°C 20 циклов

сек 70°C

мин 70°C 1 цикл

) Относительно Taq полимеразы, использованной для валидации: если применяется определённая hot start ДНК-полимераза, время, необходимое для первого этапа нужно сократить (см.указания производителя фермента).

Продукты амплификации могут храниться при температуре от +4 до -20°C.

Для проверки реакции амплификации, можно нанести 5 мкл каждого образца прямо на 2% агарозный гель без добавления буфера.

Длина ампликонов составляет примерно 230 пар оснований (Контроль Рода) и до 200 пар оснований (Универсальный

Контроль/видоспецифичный фрагмент) соответственно.

Гибридизация

Подготовка

Предварительно прогреть водяную баню с шейкером или TwinCubator® до 45°C. Максимально допустимое отклонение температуры ±1°C. Растворы HYB м STR нужно предварительно прогреть до 37-45°C. В реагентах не должно быть осадка (при этом обратите внимание, что раствор CON-D опалесцирует). При необходимости перемешать растворы. За исключением CON-C и SUB-C, довести остальные растворы до комнатной температуры. В подходящей пробирке разведите Концентрат Коньюгата (CON-C - оранжевый) и Концентрат Субстрата (SUB-C - жёлтый) в соотношении 1: 100 с соответствующим буфером (CON-C с CON-D, SUB-C с SUB-D) в необходимом количестве. Хорошо перемешайте и доведите до комнатной температуры. Из рассчёта на каждый стрип: добавьте 10 мкл концентрата к 1 мл соответствующего буфера. CON-C разводится перед каждым использованием. Разведенный SUB-C можно хранить 4 недели в защищенном от света месте при комнатной температуре.

Внесите по 20 мкл Денатурирующего Раствора (DEN, голубого цвета) в угол каждой ячейки.

. Добавьте в раствор по 20 мкл продукта амплификации, перемешайте пипетированием и инкубируйте 5 мин при комнатной температуре.

В это время пинцетом выньте стрипы из тубы и подпишите их карандащом под цветной полосой. Со стрипами работать только в перчатках!

. Осторожно добавьте в каждую ячейку 1 мл предварительно нагретого гибридизационного буфера (HYB, зеленого цвета).

Аккуратно покачивайте ванночку до получения гомогенного окрашивания.

Следите, чтобы раствор не попал в соседние ячейки.

. Поместите стрипы в ячейки.

Стрипы должны быть полностью погружены, а рабочая сторона (определяемая __________по цветной полосе на нижнем конце) должна быть лицом вверх. Если стрип перевернулся, его нужно поправить пинцетом. Во избежание контаминации тщательно мойте пинцет после каждого применения. Это важно и на всех последующих этапах теста.

. Поместите ванночку на водяную баню с шейкером/TwinCubator®и инкубируйте 30 мин при температуре 45°C.

Установите скорость встряхивания водяной бани так, чтобы жидкость постоянно перемешивалась, но не попадала в соседние ячейки.

Чтобы установить равномерное распределение температуры, ванночку погружают на 1/3 высоты.

. Полностью аспирируйте Гибридизационный Буфер.

К примеру, можно использовать пастеровскую пипетку, соединенную с вакуумным насосом.

. Добавьте 1 мл Раствора для Жесткой Промывки (STR, красного цвета) в каждый стрип и инкубируйте 15 мин при 45°C в водяной бане с шейкером/TwinCubator®.

. Далее работайте при комнатной температуре.

Полностью удалите раствор для жесткой промывки.

Вылейте моющий раствор в контейнер для отходов, а остатки жидкости удалите похлопыванием ванночки по фильтровальной бумаге. Таким же образом поступайте и при следующих этапах отмывки.

9. Отмойте каждый стрип в 1 мл Промывающего Раствора (RIN) в течение 1 мин на платформе шейкера/TwinCubator® (слейте RIN после инкубации).

. Добавьте по1 мл разведенного Конъюгата (см.выше) в каждый стрип и инкубируйте 30 мин на платформе шейкера/TwinCubator®.

. Удалите раствор и промойте каждый стрип дважды по 1 мин в 1 мл Промывающего Раствора (RIN) и один раз 1 мин примерно в 1 мл дистиллированной воды (используйте флакон для промывки) на платформе шейкера/TwinCubator®.

После последней промывки тщательно удалите все остатки воды.

. Добавьте 1 мл разведенного субстрата (см.выше) в каждый стрип и инкубируйте без встряхивания, защищая от света.

В зависимости от условий теста (например, температуры в комнате), время субстратной инкубации может варьировать от 3 до 20 мин. Слишком длительная инкубация может привести к избыточному развитию окраски фона, и, тем самым может способствовать неправильной интерпретации результатов.

. Остановите реакцию кратким двукратным промыванием дистиллированной водой.

14. Пинцетом удалите стрипы из ванночки и высушите их между двумя слоями фильтровальной бумаги.

 

5.2.4 Молекулярно-генетическое исследование для определения устойчивости комплекса Mycobacterium tuberculosis к Рифампицину и/или Изониазиду

Проведение исследования происходит идентично вышеупомянутому. Меняется только набор стрип.

Заключение

В настоящее время метод ПЦР-диагностики развивается семимильными шагами. Во всем мире совершенствуются, модифицируются и разрабатываются всевозможные модификации ПЦР-анализа. Каждый год на медицинский рынок поступает десятки новых разработок и тест-систем ПЦР-диагностики, предназначенных для выявления нуклеотидных последовательностей различных микроорганизмов - возбудителей инфекционных заболеваний. Новые разработки для проведения ДНК-исследований с каждым разом снижают себестоимость ПЦР-анализа, делая его доступным для широкого использования в диагностических и лечебных целях.

Необходимо помнить, что, во-первых, метод ПЦР должен применяться клиницистами осмысленно, и врач, решивший использовать ПЦР в своей, работе должен обладать определенными знаниями об особенностях и возможностях данного метода. Во-вторых, между клиницистом и ПЦР-лабораторией должна существовать тесная обратная связь, необходимая для анализа сложных случаев и выработки правильной диагностической стратегии. В-третьих, ПЦР-анализ не является панацеей в диагностике и не заменяет существующие методы исследований, а лишь дополняет их. И главное - ПЦР не может заменить интуицию и аналитическое мышление, которыми должен обладать врач, рассчитывающий на успех.

 

Список использованной литературы

1. Щербо С.Н. ПЦР в клинической лабораторной диагностике: реальности и перспективы //Справочник заведующего КДЛ 2006. №10 с. 45-48

. Тарасенко И.М. Правила организации работы КДЛ с патогенными биологическими агентами // Справочник заведующего КДЛ 2007. №6 с.37-40.

. Херсонская А.М. Современные методы клинической диагностики: ПЦР в режиме реального времени // Справочник заведующего КДЛ 2007. №11 с.31-36

. Чухловин.А.Б. Метод ПЦР в клинической лабораторной диагностике // Справочник заведующего КДЛ. 2008. №4 с.46-50

. Tuberculosis: A Comprehensive International Approach / ed. by. Reichman and E.S. Hershfield. - 2th ed., 2000, 182-183 с.

6. А.Г. Хоменко. Руководство по внутренним болезням «Туберкулез» Москва, 1996 г. 107-138с.

. Пилипчук Н.С. Особенности дифференциальной диагностики туберкулёза и некоторых пороков развития лёгких - Минск, 1974 г. 113-164с.

. Кошечкин В.А., Иванова З.А. Туберкулез. - Москва, 2007 г. 175-243с.

⇐ Предыдущая12345

Поделиться: