Основные группы ферментов бактерий

Способность расщеплять различные углеводы с образованием кислот, альдегидов и газообразных продуктов характерна для значительного количества бактерий. Разнообразие ферментативных реакций у отдельных родов и видов бактерий позволяет использовать это в дифференциально-диагностических целях для идентификации исследуемых культур.

Свойство одних бактерий расщеплять данный углевод и его отсутствие у сравниваемых бактерий иногда является основным признаком, пользуясь которым, возможно дифференцировать возбудитель заболевания.

Среды, используемые для определения сахаролитической активности бактерий состоят из трех основных компонентов:

1) основного субстрата собственно питательной среды

2) исследуемого углевода

3) индикатора, указывающего на наличие или отсутствие расщепления данного углевода.

Для обнаружения сахаролитических ферментов исследуемую культуру бактерий засевают в питательные среды Гисса, называемые также “пестрым рядом”.

“Пестрый ряд” Гисcа содержит 5 пробирок: с глюкозой, лактозой, манитом, мальтозой и сахарозой.

Метод определения активности протеолитических ферментов

Модификационный метод. Модификационный метод с применением субстрата казеина основан на определении скорости ферментативной реакции гидролиза субстрата под действием исследуемых протеолитических фермен-тов, содержащихся в материале, взятом на анализ. Скорость реакции определяют по количеству образовав-шихся аминокислот - тирозина (a-амино-b-оксифенилпропионовая кислота) и триптофана (a-амино-b-индолилпропионовая кислота), которые устанавливают колориметрической реакцией с реактивом Фолина. Этим методом определяют указанные аминокислоты как в сво-бодном, так и в связанном состоянии.
По количеству тирозина и триптофана, содержаще-муся в гидролизате, определяют количество превращен-ного белка в процессе ферментативной реакции (из расчета содержания в белке 6% тирозина и 1.8% трип-тофана). В основу расчета активности протеолитиче-ских ферментов положена зависимость степени гидроли-за белка от числа единиц активности фермента, вве-денных в ферментативную реакцию. На основе этой зависимости составляется график.
Поскольку в данном методе количество аминокис-лот, характеризующих количество превращаемого белка, определяется по интенсивности окраски реакционных сред - оптической плотности после реакции с реакти-вом, то в графике для простоты расчета вместо коли-чества превращенного белка ставится пропорциональная ему оптическая плотность раствора. При составлении графика по оси абсцисс откладывают число единиц фер-мента, введенное в ферментативную реакцию, а по оси ординат - оптическую плотность, полученную после ко-лориметрической реакции с реактивом Фолина.

К ферментам агрессии относятся:

1. Гиалуронидаза — расщепляет гиалуроновую кислоту соединительных тканей

2. Фибринолизин — растворяет сгустки фибрина, это фермент инвазивности, обеспечивающий проникновение микроорганизма в организм.

3. Лецитиназа — расщепляет лецитин, содержащийся в клеточной оболочке

4. Коагулаза — свертывает плазму крови.

5. Нуклеаза — разрушает ДНК, РНК.

Методы культивирования вирусов

 

Вирусы не способны культивироваться на питательных средах, т.к. являются внутриклеточными паразитами.

1. Метод культивирования в организме чувствительных экспериментальных лабораторных животных.

Ограничения:

1) не все вирусы человека размножаются в организме лабораторных животных;

2)в организме экспериментальных животных есть иммунная система, которая может оказывать влияние на размножение вирусов.

2. Культивирование вирусов в развивающихся куриных эмбрионах.

Куриные эмбрионы имеют двухслойную экто- и энтодермальную хорион-аллантоисную оболочку; желточный мешок построен из мезодермальных клеток. Т.о., куриный эмбрион содержит ткани любого происхождения.

Куриный эмбрион не обладает иммунологической активностью.

Дешевле по сравнению с лабораторными животными. После заражения куриных эмбрионов они погибают вследствие размножения вирусов. На оболочках эмбриона могут образовыватся бляшки – мелкие зернистые образования. Вирус накапливается в жидкости куриного эмбриона.

Но: в куриных эмбрионах размножаются не все вирусы человека.

3. Метод культивирования вирусов в культуре ткани

– для культивирования вирусов вне организма; используют эмбриональные, опухолевые клетки, которые активно размножаются в питательных средах для культуры тканей.

Типы культур тканей:

1) перевиваемые тканевые культуры – культуры обычно опухолевых клеток. Они стандартные. Их нужно постоянно поддерживать, они одинаковы во всех лабораториях мира;

2) первично-трипсинизированные тканевые культуры

культуры эмбриональных тканей, которые готовятся каждый раз по мере надобности: эмбриональную ткань измельчают, затем подвергают обработке трипсином (чтобы разрушить межклеточные связи), центрифугируют → отдельные клетки. Эти культуры ткани обладают хорошими ростовыми качествами, но они не стандартны.

 

Для поддерживания культур ткани служат специальные синтетические питательные среды.

Культивирование вирусов под агаровым покрытием (однослойные культуры тканей) дает возможность получить потомство отдельных вирионов.

11.Схема культурального метода исследования

Этап 1

А. Забор, транспортировка, хранение, предварительная обработка материала.Иногда до посева проводят селективную обработку материала с учетом свойств выделяемого микроорганизма. Например, перед исследованием мокроты или другого материала на присутствие кислотустойчивых микобактерий туберкулеза, материал обрабатывают растворами кислот или щелочей.

Б. Посев в среду обогащения(при необходимости).Его проводят, если в исследуемом материале содержится малое количество бактерий, например, при выделении гемокультуры. Для этого кровь, взятую на высоте лихорадки в большом объёме (8–10 мл у взрослых, 4–5 мл у детей) засевают в среду в соотношении 1: 10 (для преодоления действия бактерицидных факторов крови); посев инкубируют при температуре 37⁰С 18-24 ч.

В. Микроскопия исследуемого материала.Из исследуемого материала готовят мазок, окрашивают его по Граму или другим методом и микроскопируют. Оценивают присутствующую микрофлору, ее количество. В ходе дальнейших исследований должны быть выделены микроорганизмы, присутствовавшие в первичном мазке.

Г. Посев на питательные среды с целью получения изолированных колоний.Производят посев материала петлёй или шпателем методом механического разобщения на чашку с дифференциально-диагностической или селективной средой с целью получения изолированных колоний. После посева чашку перевора­чивают дном кверху (чтобы избежать размазывания колоний капельками конденсационной жидкости), подписывают и помещают в термостат при температуре 37⁰С на 18-24 ч.

Этап 2

А. Изучение морфотипов колоний на средах, их микроскопия.Просматривают чашки и отмечают оптимальную питательную среду, скорость роста, характер роста микроорганизмов. Для изучения выбираютизолированные колонии, расположенные по ходу штриха, ближе к центру. Если вырастает несколько типов колоний – каждый исследуется в отдельности. Оценивают признаки колоний (табл. 7). При необходимости чашки с посевамипросматривают через лупу или с помощью микроскопа с объективом малого увеличения и суженной диафрагмой. Изучают тинкториальные свойства отличающихся морфотипов колоний, для этого из части исследуемой колонии готовят мазок, окрашивают по Граму или другими методами, микроскопируют и определяют морфологию чистоту культуры.При необходимости ставят ориентировочную РА на стекле с поливалентными сыворотками.

Б. Накопление чистой культуры.Для накопления чистой культуры изолированные колонии всех морфотипов пересевают в отдельные пробирки со скошенным агаром или какой-либо другой питательной средой и инкубируют в термостате при +37⁰С (такая температура оптимальна для большинства микроорганизмов, но может быть и другой, например, для Campylobacterium spp. – +42⁰C, Candida spp. и Yersinia pestis – +25⁰C).

В качестве среды накопления для энтеробактерий обычно используют среду Клиглера.

Состав среды Клиглера: МПА, 0, 1% глюкозы, 1% лактозы, реактив на сероводород (сернокислое железо + тиосульфат натрия + сульфит натрия), индикатор феноловый красный. Изначальный цвет среды малиново-красный, среда «скошена» в пробирках: имеет столбик (2/3) и скошенную поверхность (1/3).

Посев в среду Клиглера производится штрихом по поверхности и уколом в столбик.

Этап 3.

А. Учет роста на среде накопления, оценка чистоты культурыв мазке по Граму.Отмечают характер роста выделенной чистой культуры. Визуально чистая культура характеризуется однородным ростом. При микроскопическом исследованииокрашенного мазка, приготовленного из такой культуры, в нём в разных полях зрения обнару­живаются морфологически и тинкториально однородные клетки. Однако в случае выраженного плеоморфизма, присущего неко­торым видам бактерий, в мазках из чистой культуры могут встречаться одновременно клетки с различной морфологией.

Если в качестве среды накопления использовали индикаторную среду Клиглера, то оценивают изменения ее цвета в столбике и скошенной части, по которым определяют биохимические свойства: ферментацию глюкозы, лактозы и продукцию сероводорода. При разложении лактозы желтеет скошенная часть среды, при разложении глюкозы – желтеет столбик. При образовании CO₂ в процессе разложения сахаров образуются газовые пузырьки или разрыв столбика. В случае продукции сероводорода отмечается почернение по ходу укола из-за превращении сульфата железа в сульфид железа.

Характер изменения цвета среды Клиглера (рис. 23) объясняется неодинаковой интенсивностью расщепления микроорганизмами азотистых веществ и образования щелочных продуктов в аэробных (на скошенной поверхности) и анаэробных (в столбике) условиях.

В аэробных условиях на скошенной поверхности происходит более интенсивное щелочеобразование, чем в столбике среды. Поэтому при разложении глюкозы, присутствующей в среде в небольшом количестве, образующаяся на скошенной поверхности кислота быстро нейтрализуется. В то же время при разложении лактозы, присутствующей в среде в высокой концентрации, щелочные продукты не способны нейтрализовать кислоту.

В анаэробных условиях в столбике щелочные продукты образуются в ничтожном количестве, поэтому здесь выявляется ферментация глюкозы.

Б. Окончательная идентификация чистой культуры(определение систематического положения выделенного микроорганизма до уровня вида или варианта) и определение спектра чувствительности выделенной культуры к антибиотикам.

Для идентификации чистой культуры на этом этапе изучают биохимические, генетические, серологические и биологические признаки.

 

⇐ Предыдущая123

Поделиться:

Популярное:

1. I. ОСНОВНЫЕ ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ ПОЛОЖЕНИЯ
2. I.2. Основные интерпретации катарсиса.
3. II. Основные принципы и правила служебного поведения государственных служащих
4. II. ЦЕЛИ, ОСНОВНЫЕ НАПРАВЛЕНИЯ ДЕЯТЕЛЬНОСТИ И ЗАДАЧИ ПРОФСОЮЗА
5. IV. Основные способы и средства защиты населения в чрезвычайных ситуациях.
6. V. ОСНОВНЫЕ ФАКТОРЫ РИСКА ВОЗНИКНОВЕНИЯ ЧРЕЗВЫЧАЙНЫХ СИТУАЦИЙ ПРИРОДНОГО И ТЕХНОГЕННОГО ХАРАКТЕРА.
7. V1: 2. Основные этапы становления и развития финансовой системы России
8. XI. Основные виды и жанры аниме
9. А. Основные принципы создания и деятельности союза
10. Административная юрисдикция. Понятие и основные черты.
11. Алгоритм А-3 Представление результатов работы группы (мастерской).
12. Анкета оценки эффективности группы