Вопрос 128. Методы клонирования ДНК.

Вопрос №129

Клонирование генов.

Краткий ответ:

Клонирование генов – это процедура, включающая выделение и амплификацию отдельных генов в реципиентных клетках, про- или эукариотических. С информационной РНК, выделяемой из однотипных клеток организма, снимают ДНК-копии (кДНК), которые затем вводят в реципиентные клетки, и амплифицируют. Клонирование ДНК in vivo включает 4 этапов:

1) получение фрагментов ДНК, в том числе генов или их частей с помощью ферментов рестрикции;

2) рекомбинация фрагментов,

3) вставка фрагмента ДНК в вектор;

4) трансформация с помощью вектора организма хозяина;

5) скрининг на рекомбинантный вектор

6) отбор интересующих исследователя клонов.

Основная часть:

Реципиентные клетки – клетки, выбранные для клонирования гена, могут быть как про-, так и эукариотическими.

мРНК выделяют из клеток или тканей, в которых экспрессируется искомый ген.

Синтез ДНК - копийосуществляется ферментом РНК-зависимой ДНК-полимеразой. Чтобы этот фермент начал работать, требуется короткая одноцепочечная ДНК-затравка; для этой цели, как правило, используют oligo(dT). Затравочная ДНК самопроизвольно образует двухцепочечный комплекс с отрезком poly(dA).

Деполимеризацию исходной РНК-цепочки осуществляют путем щелочного гидролиза. Цепи ДНКустойчивы к обработке щелочью, а РНК полностью деполимеризуется. Получившаяся в результате ДНК является одноцепочечной.

Двухцепочечную (дц) кДНКполучают путем достраивания оц-кДНК до двухцепочечной формы, выполняемого ферментом ДНК-полимеразой I. Такую кДНК можно встраивать в вектор.

Существует два основных типа векторов: бактериальные плазмиды и бактериофаги.

Плазмиды— это встречающиеся в клетках внехромосомные элементы, представляющие собой замкнутые кольцевые молекулы дц-ДНК. Чтобы включить кДНК в плазмиду, замкнутое кольцо плазмиды надо «разомкнуть». Для этого плазмиды подвергают воздействию рестриктаз.

Рестриктаза- разрезает дц-ДНК по определенным нуклеотидным последовательностям, называемым участками рестрикции.

Сшивание (лигирование)— процедура, в ходе которой чужеродная ДНК встраивается между (или сшивается с двумя концами плазмидной ДНК с помощью фермента, называемого ДНК-лигазой.

Трансформацияпроисходит после того, как рекомбинантную плазмиду добавляют к бактерии-реципиенту: плазмида проникает внутрь бактерии и включается в ее жизненный цикл.

Скрининг («просеивание»)— это процедура, необходимость применения которой обусловлена тем, что в исходном препарате кДНК представлено много разных мРНК и лишь часть плазмид несет нужный нам ген.

Амплификация осуществляется благодаря тому, что в одной бактериальной клетке может синтезироваться много копий интересующей нас плазмиды, а также за счет получения большого количества клеток с такими плазмидами. После выделения и очистки плазмиды обрабатывают соответствующей рестриктазой, которая вырезает встроенные в них копии искомого гена. Амплифицированный таким образом ген можно использовать для дальнейших экспериментов в области генной инженерии.

Вопрос №130

Генетически модифицированные организмы.

Краткий обзор:

Генетически модифицированный организм (ГМО) - организм, генотип которого был искусственно изменён при помощи методов генной инженерии (растения, животные и микроорганизмы).

Генная инженерия - совокупность приёмов, методов и технологий получения рекомбинантных РНК и ДНК, выделения генов из организма, осуществления манипуляций с генами и введения их в другие организмы. В отличие от традиционной селекции, в ходе которой генотип подвергается изменениям лишь косвенно, генная инженерия позволяет непосредственно вмешиваться в генетический аппарат, применяя технику молекулярного клонирования.

Основным видом генетической модификации в настоящее время является использование трансгенов для создания трансгенных организмов.

Трансген — фрагмент ДНК, переносимый при помощи генно-инженерных манипуляций в геном определённого организма с целью модификации его свойств. Трансген может быть выделен из биологического объекта или синтезирован искусственно.

Трансге́ нный органи́ зм — живой организм, в геном которого искусственно введен ген, который не может быть приобретен при естественном скрещивании.

Основная часть:

Основные этапы создания ГМО:

1. Получение изолированного гена.

2. Введение гена в вектор для переноса в организм.

Вектор - молекула нуклеиновой кислоты, чаще всего ДНК, используемая в генетической инженерии для передачи генетического материала другой клетке. Чтобы встроить ген в вектор, используют ферменты — рестриктазы и лигазы. С помощью рестриктаз ген и вектор можно разрезать на кусочки. С помощью лигаз такие кусочки можно «склеивать», соединять в иной комбинации, конструируя новый ген или заключая его в вектор.

3. Перенос вектора с геном в модифицируемый организм.

4. Преобразование клеток организма.

5. Отбор генетически модифицированных организмов и устранение тех, которые не были успешно модифицированы.

Применение:

В медицине: при помощи трансгенной бактерии производится человеческий инсулин.

В фармацевтической промышленности: выпускается большое количество лекарственных средств на основе рекомбинантных белков человека

В сельском хозяйстве: для создания новых сортов растений, устойчивых к неблагоприятным условиям среды и вредителям, повышение урожайности.

А также: разрабатываются генетически модифицированные бактерии, способные производить экологически чистое топливо.

Генетически модифицированная пища - это продукты питания, полученные из генетически модифицированных организмов (ГМО). Большинство культивируемых генно-модифицированных организмов обладают устойчивостью к возбудителям болезней (к вирусам и грибам), насекомым-вредителям или к гербицидам.

131. Структура генома.

Краткий ответ:

Геном - вся совокупность молекул ДНК клетки (в случае ряда вирусов говорят о геномной РНК).

Существует ядерный геном, митохондриальный геном и геном пластид. Мы будем рассматривать только ядерный геном. Соматические клетки содержат диплоидный (2n) геном, половые - гаплоидный (n).

Размер генома

Полный ответ:

Геном - вся совокупность молекул ДНК клетки (в случае ряда вирусов говорят о геномной РНК).

Существует ядерный геном, митохондриальный геном и геном пластид. Соматические клетки содержат диплоидный (2n) геном, половые - гаплоидный (n).

Прямой корреляции между количеством ДНК и эволюционной продвинутостью организма нет.

Так, например, у малярийного плазмодия 0.06 пг ДНК в ядре, а у амебы 490 пг. Большое количество ДНК не обязательно приносит качественно новую информацию. Амеба пошла на увеличение количества ДНК для увеличения размеров ядра и самой клетки. Генов у нее меньше, чем у плазмодия, но они копированы много раз. У малярийного плазмодия генов больше, чем у амебы, а ДНК меньше для максимальной компактности. Малые размеры ядра и самого одноклеточного организма позволяют ему быть внутриклеточным паразитом.

" Избыточность" эукариотического генома

На ~ 10⁶ пар нуклеотидов у бактерий приходится ~5 тыс. генов. На ~10⁹ пар нуклеотидов у млекопитающих ~50 тыс. генов.

Минусы " избыточной" ДНК:

- увеличение времени синтеза ДНК;

- cложнее организовывать удвоение ДНК;

- высокая энергоемкость - на 1 нуклеотид для включения в цепь ДНК нужно затратить ~60 молекул АТФ.

Неопределенное следствие:

- благодаря зависимости размера ядра от количества ДНК происходит увеличение размеров клетки.

Плюсы " избыточной" ДНК:

- возникает возможность создания сложного регуляторного аппарата, позволяющего поднять организм на более высокий эволюционный уровень.

Причины избыточности:

1. Большой размер генов (за счет наличия интронов).

2. Присутствие повторенных последовательностей. Повторяются и гены, и некодирующие участки. У эукариот некоторые последовательности повторены сотни и тысячи раз.

3. Наличие большого числа некодирующих последовательностей, часть из которых выполняет регуляторную функцию при транскрипции, а часть - необходима для компактизации генома.