Архитектура Аудит Военная наука Иностранные языки Медицина Металлургия Метрология
Образование Политология Производство Психология Стандартизация Технологии


МИКРОСКОПИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ ЖИВЫХ (НАТИВНЫХ) И ОКРАШЕННЫХ МИКРОБОВ.



Метод микроскопии с иммерсионной системой – предельная разрешающая способность иммерсионного микроскопа 0, 2 мкм; разрешающая способность – это минимальная площадь между двумя точками, при которой они восприним-ся раздельно. Иммерсионная микроскопия увеличивает разрешающую способность микроскопа. Техника:

Метод фазово-контрастной микроскопии - дает возможность увидеть прозрачные объекты, они приобретают высокую контрастность изображения, которая м.б позитивной или негативной. Используют обычный микроскоп + дополнительное фазово-контрастное устройство. Техника: 1) в световом микроскопе устанавливают необходимые объектив и окуляр; 2) меняют обычный конденсор на фазово-контрастный с диафрагмой в положении «О»; 3) на предметный столик помещают препарат и фокусируют его; 4) регулируют освещение до получения четкого изображения нитей лампы на диафрагме конденсора, после чего диафрагму конденсора полностью открывают; 5) заменяют окуляр вспомогательным микроскопом, положение тубуса остается прежним, и перемещением окуляра фокусируют фазовое кольцо объектива; 6) движением револьвера подбирают соответствующую объективу диафрагму и, наблюдая во вспомогательный микроскоп, совмещают при помощи центрировочных винтов изображения колец фазовой пластинки (темное) и кольцевой диафрагмы (светлое); 7) вспомогательный микроскоп заменяют окуляром и рассматривают препарат, к-рым чаще всего является тонкий нефиксированный и неокрашенный мазок взвеси бактерий на предметном стекле или агаровая пластинка с ростом микробов.

В затемненном поле - для изучения подвижности (спирохет), готовят пр-ты в виде «висячей» капли, «раздавленной» капли и рассматривают при опущенном конденсоре. Темнопольная микроскопия – используется для изучения подвижности м/о; основана на явлении дифракции света при сильном боковом освещении взвешанных в жидкости мельчайших частиц (эффект Тиндаля). Эффект достигается с пом. параболоид – конденсора. Исп-ся метод «раздавленной» капли.

 

Простые методы окраски – фиксированный мазок окрасить каким-либо красителем, например, фуксином водным (1-2 мин) или мителеновым синим (3-5 мин), промыть водой, высушить, микроскопировать.

Сложные методы окраски – последовательно наносить на пр-т определенные красители, различающиеся по хим-му составу и цвету; протравы (например в методе Циля-Нильсена протрава: фенол в составе фуксина), спирты, кислоту и др. – это позволяет выявить определенные структуры клеток и дифференцировать одни виды м/о от др.

Окраска по методу Грама является самым универсальным из сложных методов окраски. Окраска положена в основу дифференциации бактерий и отражает способность клеток воспринимать и удерживать внутри клетки красящий комплекс генцианового фиолетового и йода либо терять его после обработки спиртом. Способность бактерий удерживать комплекс генцианвиолет с йодом зависит от стр. клеточной стенки, имеющей существенные различия у гр. «-» и гр. «+» бактерий. Выделяют грамположительные (Bacillus, Clostridium, Staphylococcus, Streptococcus, Lactobacillus, Sarcina, etc.) и грамотрицательные (Escherichia, Pseudomonas, Erwinia, Neisseria, Rickettsia, etc.) формы бактерий.

Окраска кислотоустойчивых бактерий по методу Циля-Нильсена – для дифференцирования кислотоустойчивых бактерий от некислотоустойчивых. Отражает особенности некоторых микобактерий и нокардий. Эти бактерии не окрашиваются обычными методами, однако если при окрашивании используются фенол, детергенты или нагревание, то окрашенные клетки получить удается. В этом случае окраска клеток сохраняется даже при последующем обесцвечивании в смеси кислота-спирт. Кислотоустойчивость обусловлена большим содержанием в клетке сложных липидов, в частности, миколовых кислот.

Метод Романовского-Гимзе – выявление нуклеоида бактерий.

Метод Гинса – Бурри (метод негативного контрастирования). Для выявления капсул у чистых культур капсульных бактерий.

Метод Ожешки – для окраски спор бактерий и основан на их кислотоустойчивости.

Окраска гранул волютина по Нейссеру – для выявления цитоплазматических включений волютина.

ФИЗИОЛОГИЯ М/О. ХИМ-ИЙ СОСТАВ. ФАКТОРЫ ВНЕШНЕЙ СРЕДЫ, ВЛИЯЮЩИЕ НА МИКРОБНЫЕ КЛ-КИ.

АНТИБИОТИКИ.

А/б – это специфические пр-ты жизнедеятельности м/о или их модификации, обладающие высокой физиологической активностью к определенным группам м/о; они задерживают их рост, жизнедеятельность. Обладают высокой биоактивностью, а также высокой избирательностью антимикробного эффекта.

История открытия а/б. Открыты в 1920 г Флемингом; в 40-х годах Флори и Чейн получили чистый а/б; в 43 г в СССР и США было налажено производство пенициллина. Природные а/б получают биосинтетическим путем. М/о выращивают в жидкой питательной среде. Полусинтетические а/б – это измененные хим-ие структуры природного а/б – этим удается расширить антимикробный спектр.

Классификация а/б.

По происхождению:

· а/б бактерий – грамитидин, полимексин;

· из актиномицет – тетрациклин, стрептомицин;

· из грибов – пенициллин, цефалоспорин;

· из растений – омицин, рафанин.

По спектру антимикробной активности:

· действующие на G+ бактерии (стафилококки, стрептококки);

· действующие на G- (гонококк, менингококк);

· а/б на G- и G+ (аминогликозиды – гентамицин, кана-, сизо-, нео-);

· а/б широкого спектра д-я (рикетсии, хламидии, спирохеты, простейшие);

· хенолоны;

· действующие на грибы (нистатин, леворин, ПАСК, рифампицин);

· противоопухолевые а/б (рубомицин).

Молекулярный мех-м д-я а/б: 1) нарушение синтеза КС – циклосерин блокирует ферменты, превращающие L-аланин в D-аланин; пенициллин ингибирует процесс сшивок межпептидных связей, пептидогликана (муреина), вследствие блока фермента транспептидазы. Все пенициллины обладают ядром, которое состоит из четырехчленного бета-лактамного кольца, соединенного с пятичленным тиозелединовым кольцом и отличается др. от др. радикалом в боковой цепи. 2) ингибиторы ЦПМ: а) а/б, нарушающие структуру ЦПМ – полимексины; б) а/б, переносчики специфических ионов, вызывают аномальное накопление ионов внутри клетки, но обладают низкой специфичностью, т.е. действуют и на мембраны клеток макроорганизма – местная терапия (нистатин); 3) ингибиторы синтеза белка: а) действующие на 30S субъединицы рибосом, б) действующие на 50S (левомицетин, макролиды); 4) ингибиторы репликации нуклеиновых кислот: а) рубомицин – блокирует матричные ДНК в системах ДНК-полимераз и ДНК-зависимых РНК-полимераз; б) блеомицин – разрыв полинуклеидной цепи; в) новобиоцинар – синтез ДНК, вследствие угнетения ДНК-полимеразы и блокирования синтеза РНК; г) хинолоны (стафилококк, гонококк, анаэробы, клостридии) – ципробай, циклофлоксацин – их точка приложения ДНК-пираза, которая вызывает суперспирализацию ДНК.

Резистентность м/о: 1) природная устойчивость – опред-ся св-вами данного вида м/о и а/б (микоплазма и пенициллин); 2) приобретенная уст-ть – может быть первичной и вторичной (она возникает, когда чувствит-ть к данному а/б в популяции м/о обнаруживаются устойчивые варианты, эта устойчивость осована на мутации генома); 3) трансмиссивная лекарственная устойчивость детерминируется R-плазмидой. Причины резистентности: уменьшение проницаемости клеточной мембраны; увеличение содержания фермента, ингибирующего данный а/б; полное исчезновение мишений (L-формы бактерий); модификация чувствительного к данному а/б участка (ацетилирование, фосфорилирование); понижение потребности клетки в продукте.

 

БАКТЕРИОФАГИ (б/ф).

История – в 1917 г д”Эрелль открыл феномен бактериофагии. Б\ф представляет собой вирус бактерий, который размножается внутри бактериальной клетки вследствие чего она лизируется и в окружающую среду выходят частицы – потомки вируса.

Структура фага – большинство имеет сперматозоидную форму. Они состоят из головки (нуклеиновая кислота) и отростка. Размеры от 20 до 200 нм. Наиболее изучены фаги коли-дизентерийной группы (они составляют Т-группу, включают 7 представителей).

Хим-ий состав. Состоят из нуклеиновой к-ты и белка. Большинство содержат ДНК, в составе которого находятся необычные азотистые основания – 5-оксиметилцитозин, 5-метилурацил. Касид головки построен из полипептидных субъединиц, располагающихся в головке по кубическому типу симметрии, а в отростке – по спиральному. Внутри головки имеется внутренний белок.

Взаимод-е с бактериальной клеткой. Процесс протекает по типу продуктивной инф-ции и заканчивается лизисом клетки. По хар-ру взаимод-я фаги делятся на вирулентные и умеренные. Стадии у вирулентного взаимод-я: 1) адсорбция, 2) проникновение, 3) биосинтез фаговой и нуклеиновой к-ты и белков капсида, 4) морфогенез фага, 5) выход фаговых частиц. Фаговая конверсия – это приобретение клеткой в рез-те внедрения вирусной ДНК, новых св-в (пример: дифтерийная палочка не патогенна, т.к. не имеет токсигенов и соответственно не продуцирует дифтерийный токсин). Токсигены попадают в клетку по средствам фага. Умеренные фаги присутствуют в клетке в скрытом виде – профаг – такой тип взаимод-я назыв-ся лизогения.

Обнаружение и титрование фага: для получения вирулентного фага готовят фильтрат, пропуская исходный мат-л через бак. фильтры, затем засевают вместе с соответствующей бак. культурой в бульон и инкубируют при 37 град.С в течении 18-24 часов. После лизиса в культуре оставшиеся бактериальные клетки удалят центрифугированием. Наличие фага определяется качественными и количественными методами. Метод агаровых слоев Грация: одна фаговая частица – одна негативная колония, метод позволяет количественно определить: негативная колония содержит фаголизат, т.е. разрушается бактериальная клетка и фаговые частицы. В практике фаги применяют для: 1) фаготипирования бактерий, т.е. определение фаготипа по лизису штаммов бактерий одного и того же вида типа специфическими фагами (проводится для энтеробактерий и ставится с эпидемической целью). Бактерии, идущие из одного источника имеют одинаковый фаготип, записывают чувствительные ячейки: 7/82/74; 2) для фагодифференцирования бактериальных культур с целью установления их видовой принадлежности; 3) для фагодиагностики; 4) для фагопрофилактики.

Выделение фага из окружающей среды. Негативные колонии. Индикация: исследуемый мат-л вносят в пробирку с МПБ, добавляют бактерии к которым хотят получить бактериофаг. Инкубация 37 град.С, затем путем центрифугирования или фильтрации, содержимое пробирки освобождают от бактерий. Фильтрат засеивают на чашки с агаром с бактериями, инкубация при 37 град.С. На фоне роста бактериальной культуры наблюдаются стерильные пятна негативные колонии фага. Вирулентные фаги дают полностью прозрачные негативные колонии; умеренные фаги – колонии с прозрачной периферией и мутным центром (рост лизогенных бактерий). Выделение фага – мат-л со стерильного пятна петлей переносят в пробирку с МПБ + чувствительная бактериальная культ-ра. Инкубация и получение прозрачного фаголизата, освобождение от бактерий (центрифугирование + хлороформ).

 


Поделиться:



Последнее изменение этой страницы: 2017-03-17; Просмотров: 458; Нарушение авторского права страницы


lektsia.com 2007 - 2024 год. Все материалы представленные на сайте исключительно с целью ознакомления читателями и не преследуют коммерческих целей или нарушение авторских прав! (0.022 с.)
Главная | Случайная страница | Обратная связь