Проблемы регулирования пола у животных и пути ее решения

1) Метод разделения Х и У сперматозоидов по удельному весу (удельный вес Х больше У) – до конца не разработан, хотя имеются некоторые положительные результаты.

1.2) Метод разделения спермиев с помощью электрофареза, Шредер – на кроликах:

К А

10°С - ♂ 83% ♂ 17%

=

25°С - ♀ 20% ♀ 75%

/Это возможность подтверждена в дальнейшем М.С.Левиным и Г.С.Гордоном.

1.3) Метод иммунизации (Шредер). Путем иммунизации хряков и свиней против спермиев определенного типа, путем инъекции им спермы с анода или с катода. Сдвиг до 75%, но полного сдвига все же не получено.

2) Метод разделения спермы – находящийся в состоянии температурно – кислотного анабиоза (разработан Владимирской и Харченко): сперму под кислым аминокислотой гистидином до рН = 6, 0, при t= 18 – 21° и наливал и в пробирки закупорили;

♂ 31, 78%

♂ 57, 66% анабиоз, контроль 50, 88% = 50, 77%.

3) Б.Л.Асатуров на тутовом шелкопряде добился явлении гиногенеза (только самки) и андрогенеза (только самцы).

Тепловым шоком при методе задерживалось редукционные деления и образовывались диплоидные яйца с Zи W – хромосомами, развивавшееся ПАРТЕГЕНЕТИЧЕСКОЙ, то есть без оплодотворения. Таким образом получились только самки (ZW). Для получения только самцов (ZZ) Асатуров подогреванием или действием радиации разрушал поры яйцематки. При последующем оплодотворении в яйцематку проникал не один, а два сперматазоида с Z хромосомой, и получил зиготу ZZ.

5)При увеличении количества спермы в половы путях ♀ число ♂ в потомстве кур и свиней возрастало.

 

6)При добавке в рацион кроликов белков животного происхождение и подкормке кур метионином увеличивается удельный вес ♀

При избытке в рационе амикокислот метионина повышается удельный вес ♀

Аспаргина → ♂

(Г.В. Гаршутин. В.И.Михайлов)

7)При обработке петухов и хряков малыми дозами гормона метилстестостерона увеличился удельный вес ♂

8)При спаривании одновозрастных хряков и свиноматок было получено следующие количество потомков женского пола:

Возраст родителей: Удельн.вес потомства♀

До 1 года 45, 7%

2 года 50, 8%

3 года 50, 4%

4 года 49, 2%

5 года 37, 2%

6 года 41, 1%

Соотношение полов в популяциях обусловлен не только генетический.

Использование разделенного по полу семени в практике животноводства

Регуляция пола у сельскохозяйственных животных представляет значительный практический интерес, поскольку способствует ускорению генетического прогресса в селекционно-племенной работе. Ранее изучалась возможность разделения сперматозоидов, содержащих Х- или Y-хромосому следующими способами: осаждение, центрифугирование в градиенте, электрофорез, обработка специфическими антителами и т.д. (1-3). Однако на практике не было получено убедительных доказательств эффективности этих приемов.

В последние годы во многих странах мира для разделения спермы по полу используют метод проточной цитометрии, основанный на различном содержании ДНК в сперматозоидах (4-6). В 1979 году было установлено, что Х-хромосома млекопитающих содержит большее количество ДНК по сравнению с Y-хромосомой (7). Так, у быков это различие составляет 3, 8, у хряков - 3, 6, у баранов - 4, 2, у жеребцов - 3, 7 % (4, 8). При разделении сперматозоидов было предложено использовать специальный краситель для ДНК и аналитическую проточно-цитометрическую систему, которую дополнили приспособлением для направленной ориентации клеток в потоке, что способствует более четкому выявлению различий в их светоизлучении (9).

На основании результатов исследований, проведенных американскими учеными, была усовершенствована обычная аналитическая проточно-цитометрическая система и разработана Белтсвилская технология разделения спермы, которая состоит из нескольких операций (10, 11). В состав разбавленной спермы добавляют флуоресцентный витальный краситель Hoechst 33342 и инкубируют ее при 35 °С в течение 1 ч для лучшего проникновения красителя через мембранные структуры половых клеток. Затем сперма под давлением поступает в высокоскоростной проточный цитометр, где создаются условия ориентации головки сперматозоидов при пересечении лазерного луча. Лазерное излучение инициирует флуоресценцию красителя, которая улавливается мощным световым детектором и анализируется компьютером. После идентификации сперматозоидов, содержащих Х или Y-хромосому, специальный вибратор образует в растворе микрокапельки, куда попадают половые клетки. Каждая микрокапелька содержит один сперматозоид и заряжается положительно или отрицательно в зависимости от величины светоизлучения, обусловленной содержанием в половой клетке Х- или Y-хромосомы. Капельки с поврежденными или не идентифицированными сперматозоидами не заряжаются. В современных установках образуется 70-80 тыс. микрокапелек в секунду (12). После этого сперматозоиды проходят через электростатическое поле и разделяются на положительно, отрицательно или нейтрально заряженные частицы, которые поступают в разные емкости. Затем сперматозоиды центрифугируют для увеличения их концентрации и разбавляют специальной средой (13-15).

В первое время после разработки описанной технологии использовали стандартную скоростную систему с рабочим давлением в пределах 0, 84 кг/см2. При этом скорость разделения клеток составляла 350 тыс сперматозоидов в час (10). Позднее, когда технология была усовершенствована, в том числе за счет повышения давления в системе до 4, 22 кг/см2, стало возможным сортировать до 11 млн сперматозоидов в час и получать образцы, содержащие 90 % клеток с Х- или Y-хромосомой (8).

Были проведены углубленные исследования в области улучшения ориентации головки сперматозоидов относительно лазерного луча и оптического детектора (5, 14, 16). Вследствие плоской формы головки лишь 30 % клеток имеют правильную пространственную ориентацию при прохождении через лазерный луч, причем только половина из них содержит Х- или Y-половую хромосому. Из общего объема эякулята удается получить не более 15 % сперматозоидов с определенной половой хромосомой, что обусловливает высокую стоимость разделенного по полу семени. В настоящее время разделенная сперма быков может быть экономически выгодной производителю только если в дозе содержится пониженное число сперматозоидов (~ 2 млн подвижных клеток по сравнению с 10-15 млн сперматозоидов, применяемых при обычном осеменении крупного рогатого скота криоконсервированной спермой).

Во время разделения с помощью высокоскоростной проточной цитометрии сперматозоиды подвергаются действию таких неблагоприятных факторов как окрашивание, высокая степень разбавления семени, воздействие лазерного излучения и давления, электромагнитное влияние, центрифугирование (17-19), поэтому важна разработка условий для сохранения биологической полноценности половых клеток. В частности, для предохранения их от агглютинации в состав буферного раствора вводят 0, 1 % бычьего сывороточного альбумина, а после разделения сперматозоиды попадают в TEST-желточный буфер (20). Показано, что лучшая подвижность сперматозоидов после оттаивания сохраняется в случае центрифугирования половых клеток сразу после разделительного процесса и добавления глицерина в состав охлажденного до 4 °С семени незадолго до замораживания (21). Для проверки чистоты разделения образцов спермы на Х- и Y- фракции применяют полимеразную цепную реакцию (22), а также метод флуоресцентной гибридизации (23).

В 1988 году установлено, что разделенные с помощью проточной цитометрии сперматозоиды способны к образованию пронуклеуса при введении в ооциты хомячков (24). В том же году английскими исследователями были проведены первые опыты по использованию разделенной спермы для искусственного осеменения телок и крольчих (25). Две группы телок осеменяли с помощью цервикального введения фракции сперматозоидов с Х- или Y-хромосомой. В дозе содержалось 5 млн клеток. Оплодотворяемость животных оказалась очень низкой, и телки в основном абортировали между 4-м и 5-м мес беременности. Изучение половых органов у абортированных плодов показало, что в случае осеменения Х-фракцией 8 из 11 плодов были самками, при использовании Y-фракции 12 из 20 плодов - самцами. Низкие результаты оплодотворяемости были получены и у крольчих, однако в этом случае удалось получить живых крольчат, которые нормально развивались и в дальнейшем принесли здоровое потомство.

В опытах американских ученых по осеменению крольчих сперму самкам вводили внутриматочно. В группе, где использовали фракцию сперматозоидов с Х-хромосомой, получили 94 % самок, с Y-хромосомой - 81 % самцов (10). Внутритрубное введение свиньям разделенного по полу семени хряков позволило получить в потомстве 68 % самцов при оплодотворении спермой с Y-хромосомой и 74 % самок при использовании Х-фракции (20).

Позднее были проведены успешные эксперименты по оплодотворению яйцеклеток крупного рогатого скота разделенными сперматозоидами invitro (26). С помощью проточной цитометрии получали фракции спермы, содержащие до 79 % половых клеток с Х-хромосомой и до 70 % - с Y-хромосомой. Телкам пересаживали эмбрионы предполагаемого пола, в результате чего в первой группе родилось 3 телочки, во второй - 3 бычка. В последующих опытах удалось получить до 90 % телят мужского пола (27).

Также был проведен ряд экспериментов по изучению эффективности пересадки коровам эмбрионов, полученных invitro с помощью разделенного семени (28). Приживляемость эмбрионов у коров со спонтанным эструсом составила 16, 3, у коров с синхронизированным эструсом - 20, 0, у телок - 34, 2 %. Из 40 родившихся телят 37 были телочками.

В более поздних исследованиях изучали эффективность пересадок коровам заморожено-оттаянных эмбрионов, полученных invitro с использованием фракции Х-сперматозоидов (29). Приживляемость таких эмбрионов в опытной группе составила 40, 9 %, в контрольной, где использовались обычные эмбрионы, - 41, 9 %. Всего родилось 458 телят, из которых 96, 8 % были самками.

В связи с тем, что скорость разделения сперматозоидов при проточной цитометрии не позволяет получать достаточно семени для обычного искусственного оплодотворения крупного рогатого скота, была изучена возможность введения половых клеток непосредственно в рога матки (30, 31). Не разделенную сперму, содержащую 100-500 тыс. сперматозоидов, вводили в рог матки телок с помощью инструментов для эмбриопересадки. В некоторых группах результаты оплодотворяемости были довольно высокими. Затем для осеменения телок использовали разделенную фракцию не замороженной спермы, содержащей в дозе 100-200 тыс. сперматозоидов. Из 17 полученных телят 14 соответствовали предполагаемому полу (31). В другом опыте 35 телкам в рога матки вводили по 300 тыс. не замороженных разделенных сперматозоидов, содержащих преимущественно Х-хромосому, а контрольных животных осеменяли такой же дозой не разделенной спермы. Оплодотворяемость в опытной группе составила 42 %, в контроле - 54 %. В опытной группе было получено 80 % телочек (32). В экспериментах по осеменению пониженной дозой заморожено-оттаянных разделенных по полу сперматозоидов (1 млн клеток) оплодотворяемость составила 52 %. Эти показатели сопоставимы с результатами обычного искусственного осеменения коров криоконсервированной спермой, содержащей в дозе 15-20 млн половых клеток (33). При внутриматочном осеменении телок разделенной по полу криоконсервированной спермой (1; 1, 5 или 3 млн сперматозоидов в дозе) также удалось получить высокие показатели оплодотворяемости (43-54 %) (34).

В полевых испытаниях швейцарских ученых телкам и коровам опытных групп внутриматочно вводили по 2 млн подвижных заморожено-оттаянных сперматозоидов с Х-хромосомой. В контрольных группах животных осеменяли аналогичной дозой не разделенных половых клеток. В опытной и контрольной группах отелилось соответственно 29, 6 и 55, 6 % телок; 21, 9 и 23, 4 % коров. При этом в опытных группах родилось 85, 3 % самок, в контрольных - 58, 6 % (35).

Эстонские исследователи выясняли эффективность осеменения телок разделенной спермой при введении 2, 2 млн заморожено-оттаянных сперматозоидов в маточно-трубное сочленение, рога или тело матки (36). Оплодотворяемость телок во всех вариантах оказалась практически одинаковой и составила соответственно 37, 7; 42, 2 и 39, 6 %.

В Финляндии проводились испытания по осеменению коров голштинской породы криоконсервированной разделенной спермой (37). Во время спонтанной охоты 157 опытным коровам вводили внутриматочно 2 млн разделенных сперматозоидов, 149 контрольным коровам - 15 млн не разделенных сперматозоидов. В опытной группе отелилось 20 % коров и родилось 82 % телочек. В контроле эти показатели составили соответственно 45 и 49 %. Полученные результаты свидетельствуют о значительном снижении оплодотворяемости при использовании для осеменения пониженного числа сперматозоидов в дозе разделенной спермы.

В экспериментах итальянских ученых при введении телкам внутриматочнокриоконсервированной разделенной спермы, полученной от четырех быков (1 или 2 млн сперматозоидов), оплодотворяемость составила 51 %, в потомстве было 87 % самок. Кроме того, были выявлены достоверные различия в оплодотворяющей способности семени у разных быков. По мнению авторов, необходимо проводить тщательный отбор быков перед их использованием для получения разделенной по полу спермы (38).

В полевых испытаниях, проведенных в США на 211 фермах, оплодотворяемость телок голштинской породы Х-содержащей фракцией сперматозоидов достигала 47 %, телок джерсейской породы - 53 %. В потомстве получено 89 % самок (39). Кроме того, был установлен факт более высокой мертворожденности телят мужского пола при осеменении телок сперматозоидами с Х-хромосомой.

В специальных исследованиях изучали влияние процесса разделения спермы с помощью скоростной проточной цитометрии на состояние здоровья и развитие телят, а также на генетические изменения у потомства (40). Используя данные по 1169 и 793 телятам, полученным соответственно при оплодотворении коров разделенной и обычной спермой, анализировали продолжительность беременности, легкость отела, частоту абортов и мертворождений, живую массу телят при рождении и отъеме, смертность телят в неонатальный и более поздний период, а также различные анатомические аномалии. Достоверных различий в изучаемых показателях между двумя группами животных установлено не было. При использовании не разделенной спермы получили 49, 2 % бычков, Х-содержащей фракции сперматозоидов - 87, 8 % самок, Y-содержащей фракции - 92, 1 % самцов. Разделение спермы не оказывало влияния на раннюю эмбриональную смертность у телок (34).

Применение высокоскоростной проточной цитометрии для разделения сперматозоидов быков не оказывает отрицательного влияния на структурное состояние ДНК в клетках (41). Коммерческое использование разделенной по полу спермы в зарубежных странах началось с 2000 года и к настоящему времени в мире получено более 2 млн телят (42). В основном разделенную сперму быков используют для осеменения телок. В среднем в дозе содержится не менее 2 млн подвижных сперматозоидов. Предпринимаются попытки улучшить биологическую полноценность разделенной спермы в процессе ее криоконсервации. В частности, изучено защитное влияние на половые клетки быков антиоксидантов пирувата натрия и каталазы, добавление которых в состав синтетической среды улучшало подвижность и живучесть заморожено-оттаянных сперматозоидов (43). Совместное введение в состав среды для разделения сперматозоидов бычьего сывороточного альбумина и антиоксидантов значительно повышало живучесть и оплодотворяющую способность не замороженных половых клеток (44).

Основная трудность использования разделенной спермы в свиноводстве состоит в том, что в дозе должно содержаться большее число сперматозоидов по сравнению с дозой для крупного рогатого скота. Первые поросята от разделенного семени были получены после лапароскопического введения спермы непосредственно в яйцеводы свиней (20). Позднее яйцеклетки свиней оплодотворяли invitro c использованием фракции Х-сперматозоидов (45). Все потомки, родившиеся у свинок после пересадки им таких эмбрионов, оказались самками. В других экспериментах удалось получить потомство мужского пола при внутрицитоплазматическом введении разделенных не замороженных сперматозоидов хряка в яйцеклетки и дальнейшей их активации invitro (46).

С целью уменьшения числа сперматозоидов в дозе для осеменения свиней разработана методика глубокоматочного введения спермы через цервикальный канал с помощью гибкого катетера (47, 48). Оказалось, что для нормальной оплодотворяемости свиней достаточно ввести в верхушку рога матки 50-70 млн разделенных сперматозоидов (49, 50). Кроме того, предлагается вводить семя непосредственно в яйцеводы с помощью лапароскопа (51, 52). Использование этой методики позволило достичь высокой оплодотворяемости при дозе 0, 3; 0, 5 и 1 млн сперматозоидов. Анализ генетических изменений в лимфоцитах поросят, полученных от разделенного семени, не выявил мутагенного воздействия высокоскоростной проточной цитометрии на половые клетки (53). При двукратном осеменении свиней разделенной заморожено-оттаянной спермой в дозе 160 млн сперматозоидов отмечено значительное увеличение эмбриональной смертности по сравнению с контрольной группой, осемененной не разделенной спермой (54).

В овцеводстве и коневодстве также проводятся исследования эффективности применения разделенной по полу спермы. Австралийские ученые впервые получили потомство от разделенной спермы баранов в 1996 году (55). Овцам пересаживали эмбрионы, полученные invitro, с помощью внутриплазматического введения в яйцеклетки одиночных разделенных сперматозоидов. В 1997 году были проведены успешные эксперименты по искусственному осеменению овец разделенной спермой с использованием лапароскопа (56). Эффективность лапароскопического осеменения овец заморожено-оттаянной разделенной спермой была изучена в специальных опытах (57). Овцам опытных групп внутриматочно вводили 1, 5 и 15 млн заморожено-оттаянных разделенных сперматозоидов, контрольным животным - 50 млн не разделенных сперматозоидов. Оплодотворяемость в опыте составила соответственно 61, 5; 66, 1 и 66, 7 %; в контроле - 63, 2 %.

При введении разделенной не замороженной спермы в верхушку рога матки кобылам было получено 87 % потомков желаемого пола (58). По мнению ряда ученых, более перспективный способ осеменения кобыл разделенной спермой - гистероскопическое введение семени непосредственно в верхушку рога матки (59, 60). Более высокой оплодотворяемости кобыл от разделенного семени удалось достичь при введении 20 млн сперматозоидов в маточно-трубное сочленение (61). C использованием этой технологии получено потомство и от криоконсервированной разделенной спермы жеребцов (42).

Таким образом, технология разделения сперматозоидов по полу с использованием высокоскоростной проточной цитометрии представляет эффективный способ регуляции пола и в настоящее время находит применение в практике разведения не только крупного рогатого скота, но и других видов сельскохозяйственных животных. Дальнейшее совершенствование этой технологии позволит улучшить результативность разделения сперматозоидов и повысить эффективность искусственного осеменения животных.

7. Молекулярные основы наследственности.

- Нуклеиновые кислоты, их строение, функции и генезис.

- Основные этапы биосинтеза белков. Генетический код, его основные свойства.

-Тонкое строение гена. Регуляция экспрессии генов.

⇐ Предыдущая12345678Следующая ⇒

Поделиться: