Производство препаратов нормофлоры

Необходимым условием массового производства препаратов эубиотиков является сохранение их стабильности в течение длительного времени. Микрообрагинзмы, имея низкий уровень биологнической организации, сохраняют жизнеспособность практически при полной потере воды, при этом в них обратимо замедляются или прекращаются обменные процессы. Для увеличения сроков жизнеспособности бактерий показана сублимационная сушка, проходящая в условиях низкой температуры или глубокого вакуума.

К факторам, оказывающим влияние на выживаемость микроорганизмов в препаратах сухих эубиотиков при хранении, следует отнести:

Ø Регламентированное содержание остаточной влаги;

Ø Наличие защитных сред;

Ø Хранение сухих преепаратов в атмосфере не содержащей кислород.

 

В целях защиты эубиотиков от кислой среды желудка на таблетированные и капсулированные формы наносят ацидорезистентные покрытия или проводят иммобилизацию бактерий на сорбенте.

Производство должно быть организованно в соответствии с ГОСТ Р 52249-2004 «Правила производства и контроля качества лекарственных средств».

 

Общая схема технологического процесса производства пробиотиков

1. подготовка производственных помещений, оюорудования, посуды, персонала, вентиляционной системы- проводят в соответсвии с требованиями инструкций, регламентирующих условия работы со стерильными лекарственными средствами.

2. подготовка и стерилизация сред. Предварительные работы включают:

Ø Качественный набор нееобходимых для данной культуры веществ;

Ø Оценку влияния отдельных компонентов на выход целевого продукта;

Ø Нахождение оптимального соотношения составляющих и удешевление сред.

3. выращивание маточных (до шести пассажей) и производственных культур. Вначале выращивают маточную культуру из специального штамма пр теемпературе 37 ⁰С, используя различные питательные среды. Производственную культуру выращивают методом глубинного культивирования в реактторах, установленных всбоксах и оснащенных мегнитной мешалкой и паровой рубашкой.

4. розлив жидкого полуфабриката во флаконы. Розлив микробной суспензии в ампулы и флаконы проводят на аппаратах розлива и запайки ампул. Заполненные ампулы и флаконы поступают на сублимацию.

5. сублимационная сушка. Ампулы помещают в морозильные камеры под углом 750 ⁰. Содержимое ампул замораживают при температуре -400 ⁰С, выдерживают при этой температуре 18-24 ч подвергая сублимации.

6. укупорка. Ампулы с сухой микробной массой запаивают с газовой защитой.

7. маркировка, упаковка. Ампулы маркируют и упаковывают в пачки по 10 штук.

8. контроль качества готовой лекарственной формы.

 

Список использованной литературы:

1. Биотехнология. Ю.О. Сазыкин, С.Н. Орехов, И.И. Чакалева – М.: «Академия», 2007 г. – 215 с.

2. Егорова Т. А. Основы биотехнологии: Учеб. пособие для высш. пед. учеб заведений / Т.А.Егорова, С.М.Клунова, Е.А.Живухина. — М.: Издательский центр «Академия», 2003. — 208 с.

3. Катлинский А.В., Сазыкин Ю.О., Орехов С.Н., Чакалева И.И., Курс лекций по биотехнологии / ММА им. И.М. Сеченова, 2005 г. – 150 с.

4. Османов В.К., Лекции по биотехнологии/Ниж ГМА, 2008 г. – 250 с.

5. Основы фармацевтической биотехнологии, Т.П. Прищеп, В.С. Чучалин, К.Л. Зайков, Л.К. Михалева, Л.С. Белова – Ростов н/Д.: Феникс, 2006 г. – 180 с.

6. Тимощенко Л.В., Чубик М. В. Основы микробиологии и биотехнологии: учебное пособие /Л.В. Тимощенко, М.В. Чубик. – Томск: Изд-во Томского политехнического университета, 2009. – 194 с.

7. Фармацевтическая биотехнология: учеб. пособие / В.А. Быков (и другие) под общ. редакцией акад. РАМН и РАСНХ, профессора В.А. Быкова – Воронеж: издательство Воронеж. гос. ун-та, 2009. – 439 с.

Интернет ресурсы:

8. www.biotechnolog.ru

9. Биотехнология: генная инженерия, промышленная биотехнология, клеточная инженерия – учебное пособие: [электронный ресурс]. – Режим доступа: http: //www. biotechnolog.ru

10. Биоинформатика, геномика, протеомика. биософт, имейджинг: [Электронный ресурс]. – Режим доступа: http: //www.bioinFormatix.ru

11. Интернет журнал «Коммерческая биотехнология»: [Электронный ресурс]. – Режим доступа: http: //www.cbio.ru

12. Общество биотехнологов России им. Ю.А. Овчинникова: [Электронный ресурс]. – Режим доступа: http: //www.biorosinfo.ru Remedium.ru:

13. Профессионально о медицине и фармации [Электронный ресурс]. – Режим доступа: http: //www.remedium.ru

14. Новости GMP – Стандарт GMP – Фармацевтические производства и технологии [Электронный ресурс]. – Режим доступа http: //www.gmpnews.ru

15. Ассоциация Российских фармацевтических производителей [Электронный ресурс]. – Режим доступа http: //www.arfp.ru

Лекция №9

Тема лекции: Культуры клеток и тканей растений и животных. Условия и факторы влияющие на процесс культивирования клеток и тканей растений. Микроклональное размножение растений.

 

Цель лекции: Ознакомить студентов с возможностью использования культуры клеток и тканей растений, как перспективное напрявление в получении лекарственных средств. Изучить технологический режим выращивания растительных клеток и микроклональноее размножение растений.

 

 

План лекции

1. Краткая историческая справка по получению каллусной культуры. Возможности развития использования биотехнологии в получении культуры клеток и тканей растений при получении лекарственных средств;

2.Особенности культивирования изолированных клеток и тканей растений. Определение каллусной культуры (получение каллуса, особенности питательной среды, стадии получения биомассы, преимущества каллусных и суспензионных культур);

3. Факторы увеличения накопления вторичных метаболитов (питательные среды, значение регуляторов роста растений – ауксины, цитокинины, влияние предшественников на рост клеток, оптимизация технологических параметров – температура, рН, перемешивание в суспензионных культурах). Технологический режим выращивания растительных клеток.

4. Методы культивирования изолированных клеток и тканей

5. Методы культивирования изолированных клеток и тканей

Оснащение лекции: презентация

Место проведения: аудитория 525

 

1. Краткая историческая справка по получению изолированных клеток, тканей и органов растений. Возможности развития использования биотехнологии в получении культуры клеток и тканей растений при получении лекарственных средств

Нас окружает разноцветный, но не всегда, ароматный, но не везде и в тоже время всегда бесконечно разнообразный и удивительный в своих проявлениях и радостный, и печальный, постоянный и меняющийся мир, с поэтическим названием «флора». Этот мир одновременно и таит в себе, и предлагает нам свои щедрые дары для поддержания жизни, здоровья или в иное время просто настроения. Он успокаивает, лечит и дает силы каждый раз для нового дня. Такая связь предполагает и приглашает к доброму и бережному отношению к этому миру. Но с другой стороны мы хорошо знаем, что лекарственные растения играют значительную роль в фармацевтической промышленности и такие лекарственные препараты как настойки и экстракты составляют до 25% от общего объема востребованных лекарственных средств.

Известно около 20000 веществ, которые получаются только из растений и в этом плане мир растений эксплуатируется человеком настолько давно и упорно, что воспроизводство этих растений создает проблемы, т.е. оно не успевает за темпами своего уничтожения в нарушение гармонии нашей связи.

Таким образом, мы не можем отказаться от эксплуатации растительного мира для получения необходимых лекарственных средств, бизнес и конкуренция на лекарственном рынке мира вообще и на российском, в частности, бизнес есть бизнес, но делать это должны с разумной и максимальной бережностью, сохраняя наши природные богатства. И тут на помощь приходит биотехнлогия!

Поэтому все большее внимание в мире привлекает технология выращивания культур клеток растений in vitro с целью получения природных веществ различного применения и спектра действия.

Культура клеток, тканей и органов растений представляет собой части растений, выращиваемые в асептических условиях на искусст­венных питательных средах, и включает:

1. каллусные культуры на гелеобразной (твердой) питательной среде,

2. суспензионные культуры клеток в жидкой питательной среде,

3. культуру протопластов, изолированные органы растений.

В основе перспективного развития биотехнолгического направления в получении веществ растительного происхождения, помимо решения экологических проблем лежит:

Ø независимость от влияния климатических, сезонных и географических условий,

Ø уменьшение (освобождение для других нужд) площадей почвы в хозяйственном обороте страны (мы уходим от истощения почвы также или дополнительных экономических затрат),

Ø получение уже известных веществ, присущих интактному растению (например, никотин, кодеин, хинин, диосгенин и т.д.)

Ø синтез новых продуктов, веществ,

Ø использование культуры клеток для биотрансформации конечного продукта.

В нашей стране разработаны и внедрены в промышленное производство технологии получения БАВ из биомассы женьшеня и родиолы розовой. В Японии особенно широко выведен на поток процесс производства пигмента и антибиотического агента – шиконина с использованием культуры воробейника.

Промышленный способ выращивания изолированных культур дает возможность за короткий срок 30-45 суток получать значительный объем ценного лекарственного сырья.

Метод биотехнологии получения ЛС на основе культур клеток растений, начинается с процесса получения культуры каллусной ткани или каллуса.

Каллусная культура впервые была получена в 1902 году Хаберландом.

Первые попытки культивировать изолированные клетки и ткани растений были предприняты в конце XIX в. известными немецкими учеными Г. Габерландтом, X. Фёхтингом и С. Рехингером. Они пыта­лись выращивать in vitro небольшие кусочки тканей растений, помещая их на влажную поверхность фильтра в растворе сахарозы. По аналогии с культурами животного происхождения, где использовались питатель­ные среды природного происхождения (плазма крови, зародышевая жидкость), физиологи растений пытались выращивать клеточную мас­су, используя соки и экстракты растений. Первые опыты оказались не совсем удачными, поскольку транспорт и превращение питательных веществ у целого растения и изолированных растительных клеток су­щественно отличается. Лишь к началу 20-х гг. прошлого века ученые отказались от использования природных сред неопределенного состава в пользу синтетических сбалансированных сред. Основой послужили среды, используемые для выращивания целых растений.

Описанный период может считаться лишь предысторией метода культуры тканей и клеток растений. Настоящее развитие этого метода началось с работ Филиппа Уайта в США и Роже Готре во Франции. В результате их исследований в 30-х гг. XX столетия было установлено, что изолированные органы, ткани и клетки растений могут расти в культуре in vitro неограниченно долго при пассировании (пересадках) их на свежую питательную среду при определенных условиях. Многие ткани, введенные ими в культуру, существуют в пассированной культу­ре по настоящее время.

Культура клеток и тканей лекарственных растений - сравнительно молодая отрасль науки. Впервые культуру тканей лекарственного рас­тения, а именно барвинка розового, получил Уайт в 1945 г. В 1947 г. в лаборатории Готре была получена культура ткани белены черной и по­казана ее способность вырабатывать соответствующие алкалоиды. В конце 50-х гг. XX в. был разработан метод массового выращивания клеток и тканей глубинным способом в жидких питательных средах.

В СССР первые лаборатории по исследованию культур изолирован­ных тканей и клеток лекарственных растений были открыты на базе Института физиологии растений АН СССР под руководством член-корр. АН СССР Р.Г. Бутенко, в Ленинградском химико-фармацевтичес­ком институте, во Всесоюзном институте лекарственных растений и в Томском медицинском институте (ТМИ). В ТМИ лаборатория была ор­ганизована при кафедре фармакогнозии и ботаники под руководством профессора Л.Н. Березнеговской.

С культурами изолированных тканей и клеток работают по разным направлениям почти во всех странах Европы, в том числе и в России, а также Северной и Южной Америке, Азии, особенно в Китае, Индии, Японии.

Культура каллусной ткани состоит из сообщества клеток, выращиваемых на искусственной питательной среде. Что касается использования таких культур, то надо отметить, что до середины 50-х годов прошлого века использовали их как модельную систему для исследования физиологических и биохимических процессов, работая с изолированными клетками и органами растений. А в 60-х годах было доказано, что культуры клеток растений могут быть продуцентами и синтезировать на искусственных питательных средах различные вещества, присущие интактному растению. В этой связи мы можем обратиться к такому понятию как тотипотентность.

Тотипотентность – это способность любой клетки образовывать полноценное растение, что предопределено его генетическим и физиологическим потенциалом (или естественными возможностями), необходимым для образования вторичных метаболитов.

Стабильность по выходу продукта вторичных метаболитов связывают с двумя параметрами:

1. с дифференцировкой клеток,

2. со стадией культивирования

Например, дифференцированные корневые каллусы Atropa belladonna синтезируют тропановые алалоиды, а недифференцированные уже не способны к их синтезу. Но с другой стороны Rauwolfia serpentinа способна синтезировать индолиловые алкалоиды недифференцированными клетками с достаточно большим выходом метаболитов. Отсюда можно сделать вывод, что морфологическая специализация клеток не является основной предпосылкой БАВ, т.е. здесь нет прямой связи.

2. Особенности культивирования изолированных клеток и тканей растений. Определение каллусной культуры (получение каллуса, особенности питательной среды, стадии получения биомассы, преимущества каллусных и суспензионных культур)

Если еще раз обратиться к определению каллуса, то можно добавить к тому, что уже было сказано ранее. Каллус (от латинского callus-толстая кожа, мозоль), представляет ткань, которая образуется в местах повреждения органов растения и обычно возникающая при неорганизованной пролиферации клеток растения. Используется для получения изолированных тканей и клеток растения.

Можно вспомнить, что клетка in vitro – это морфофизиологическая, дифференцированная структурная живая система, основными составляющими которой являются клеточные стенки, ядро, протопласт, система вакуолей. Клетки отличаются по форме и размеру. Основа клеточной стенки – полисахарид, целлюлоза, вакуоли с клеточным соком, из воды и растворенных в ней солей и органических веществ; протопласт состоит из белков и структурно включает протоплазму с органоидами и, наконец, ядро для осуществления всех основных функций клетки.

Ядро клетки состоит из периолимфы, хроматина и одного или нескольких ядрышек.

Что касается основного способа деления клеток, то это митоз, который подразделяется на 4 фазы:

1. Профаза - строятся структурные элементы хромосом, оболочка ядра исчезает

2. Метафаза – меняется положение хромосом, они располагаются в виде метафазной пластинки, из которой ведется подсчет и морфологическое описание хромосом

3. Анафаза – расхождение хромосом к противоположным полюсам клетки и формирование двух полностью идентичных наборов хромосом

4. Телофаза – группа хромосом собранная на полюсах.

В процессе цитокинеза формируется клеточная оболочка, разделяющая материнскую клетку на 2 новые, идентичные одна другой клетки.

Что касается источников получения каллусов - изолированные культуры каллусов получают из различных органов растений (корни, побеги, листья) или из определенного типа клеток (эндосперма, пыльца).

Технология получения каллуса. Выбранный эксплантант, представляющий вырезанные маленькие кусочки (2-4 мм) растительной ткани, которые находятся в подходящем биологическом состоянии (молодые, здоровые), что необходимо для получения каллусных культур. Этот растительный материал тщательно моют, стерилизуют гипохлоридом натрия, 96% спиртом или 0, 1% сулемы, затем тщательно промывают дистиллированной водой и помещают на синтетическую агаризованную питательную среду. Сосуды закрывают ватно-марлевыми тампонами. Конечно, при этом необходимо соблюдать строгие правила антисептики (работают только в боксах). Для образования каллуса и роста ткани сосуды переносят в темное помещение, где строго поддерживают определенный режим. Это касается температуры и влажности. Известно, что для большинства культур эти параметры таковы: температура +24-26 ⁰С, а влажность 65-70%. Через 2-3 недели на раневой поверхности образуется первичный каллус.

Весьма существенным в вопросе обеспечения роста и синтеза продуктов вторичного метаболизма является подбор ингредиентов среды культивирования, что определяется конечной целью биотехнолога. Это:

1. формирование биомассы

2. синтез вторичных продуктов.

Технология получения биомассы:

1. Приготовление оборудования

2. Приготовление питательной среды

3. Стерилизация питательной среды

4. Посев ткани на питательную среду

5. Выращивание биомассы

6. Съем сырой биомассы и высушивание.

 

Что касается особенностей 2-ой стадии, то компоненты среды можно разделить на 6 групп, что будет отражать и ее приготовление:

1. макроэлементы

2. микроэлементы

3. источники железа

4. органические добавки – витамины

5. источники углерода

6. органические добавки – регуляторы роста растений – ауксины и цитокинины (играют роль пусковых механизмов).

Культивирование ведется на жидких и твердых питательных средах.

 

Факторы увеличения накопления вторичных метаболитов (питательные среды, значение регуляторов роста растений – ауксины, цитокинины, влияние предшественников на рост клеток, оптимизация технологических параметров – температура, рН, перемешивание в суспензионных культурах). Технологический режим выращивания растительных клеток.

Изолированные ткани и клетки растений могут успешно расти толь­ко при отсутствии конкуренции с микроорганизмами. Все работы по культивированию растительных объектов необходимо производить в асептических условиях. Если в состав питательной среды входят термо­лабильные вещества, их фильтруют через мембранные стерилизующие фильтры и добавляют в простерилизованную среду, охлажденную до 30-40 °С.

Изолированные фрагменты растения (экспланты), помещаемые на питательную среду, легко поражаются микроорганизмами, поэтому их также необходимо стерилизовать. Предварительно часть растения, из которой будет извлечен эксплант, промывают несколько раз водой очищенной. Затем растительный материал стерилизуют в растворах де­зинфицирующих веществ, несколько раз промывают водой и стерильным скальпелем удаляют наружные поврежденные слои клеток. Не­большие кусочки эксплантанта помещают на поверхность питательной среды с гелеобразующим компонентом. Клетки изолированных расти­тельных тканей могут делиться и давать начало длительно растущей недифференцированной массе, называемой каллусом.

В настоящее время изолированные клетки и ткани культивируют на многокомпонентных питательных средах, которые отличаются по сво­ему составу в зависимости от вида культуры. В состав всех питатель­ных сред обязательно входят необходимые растению макроэлементы. Лучшей формой азотного питания являются нитраты (калия или аммо­ния), в некоторых случаях дополнительно используются аминокислоты. Кроме азотистых соединений необходимы фосфор, сера, кальций, суль­фаты. Отсутствие в питательной среде микроэлементов уже в первом пассаже (пересадке) может уменьшить интенсивность роста тканей на 30-40%, а при последующих - гибель тканей. В зависимости от вида изолированной культуры могут в небольших количествах использо­ваться: железо, бор, цинк, марганец, медь, алюминий, никель, йод и др.

Для успешного роста культур необходимы также источники углеро­да, поскольку даже зеленеющие, выращиваемые на свету ткани неаутотрофны. Лучшим источником углеводного питания является сахароза, используемая обычно в концентрации 2-5%. Реже используется глюко­за или другие сахара.

Большинство тканей, культивируемых in vitro, способны к синтезу всех нужных для их жизнедеятельности витаминов, если все питатель­ные элементы присутствуют в средах. Однако большинство культур синтезируют витамины в субминимальных количествах, поэтому до­полнительное внесение витаминов в среду также способствует росту клеток, особенно это относится к витаминам группы В. Чаще исполь­зуют витамины В₁, В₂, В₆, а также кальция пантотенат, биотин, кислоты: аскорбиновую, никотиновую, фолиевую.

Первый фактор. Обязательными компонентами питательных сред должны быть фитогормоны.Регуляторы роста растений как мы уже говорили, являются пусковыми механизмами первичного и вторичного метаболизма, влияя таким образом на потенциал продуктивности культур клеток. В качестве регуляторов роста и синтеза продуктов вторичного метаболизма выступают

Ø ауксины (индолилтриуксусная кислота (ИУК), нафтилукссная кислота

(НУК) и 2, 4 дихлорфеноксиуксусная кислота (2, 4Д)

Ø цитокинины -6-бензиламинопурин (БАП), N-изоптен и 6-фурфуриламинопурин (кинетин)

Что касается цитокининов, то они по разному влияют на накопление вторичных метаболитов- одни не реагируют на внесение в среду кинетика, а другие культуры клеток при этом начинают образовывать например, алкалоиды (на примере культуры клеток в первом случае Datura tatula и во втором случае, Scopolia maxima) Таким образом, существование цитокининзависимых и цитокининнезависимых клеток, если связывать это с природой самого растения, зависит от изменений в фенотипе (внешних), а не в генотипе (внутренних) культуры клеток.

Второй фактор. Для синтеза вторичных метаболитов весьма существенным является внесение в питательную среду известных предшественников, стимулирующих определенные ферментативные пути метаболизма. Например, внесение всем известного фенилаланина в среду для культивирования клеток увеличивает выход диосгенина на 100%

Третий фактор. На рост и развитие растительных тканей и клеток in vitro большое влияние оказывают физические факторы: свет, температура, аэрация, влажность воздуха. Большинство изолированных культур выращивают­ся в темноте. При необходимости они могут расти и на свету, образовы­вая хлорофилл, но при этом проявляют низкую способность к фотосин­тезу. В некоторых случаях свет может использоваться как фактор, обес­печивающий морфогенез или активизирующий процесс синтеза биоло­гически активных веществ. Для освещения чаще используют люминес­центные лампы с интенсивностью светового потока 1000—1500 люкс. Оптимальная температура для успешного роста большинства куль­тур составляет 25-27 °С; для индукции их морфогенеза требуются более низкие температуры (18-25 °С). Влажность в помещении, где растут культуры, должна составлять 60-70%. Интенсивная аэрация требуется при культивировании клеток в больших объемах с использованием жидких питательных сред. Аэрацию биомассы клеток осуществляют барботированием стерильным воздухом. При выращивании клеток в малых объемах (колбах) аэрация достигается постоянным перемешива­нием суспензий клеток с помощью качалок различной конструкции.

Таким образом, если мы хотим иметь гарантию возможности получения любого продукта с фармакологической активностью, мы должны иметь в виду наиболее благоприятные условия на стадии роста и синтеза вторичных метаболитов для каждой культуры клеток растений (т.е. знать ее характер, капризы, требования, наконец саму природу на уровне фенотипа и генотипа).

Промышленное производство может эффективно работать, реализуя возможность накопления промышленного сырья путем выращивания клеток и тканей растений, используя каллусные и суспензионные культуры (помня, что суспензионные культуры получают из каллусных).

Преимуществами каллусных культур в технологии получения растительного сырья являются:

v надежность и стабильность по выходу биомассы и продуктов вторичного метаболизма

v возможность использования каллусной системы для иммобилизации и последующей биотрансформации

Недостаток: в необходимости применения ручного труда

Известно, что препараты женьшеня широко применяются в косметической, пищевой, медицинской промышленности.

Если сравнивать преимущества каллусных культур и суспензионных между собой, то оказывается, что выход продуктов вторичного метаболизма выше именно в каллусных культурах, но управление процессом культивирования легче осуществлять при работе в суспензионных культурах.

При производстве настоек женьшеня, плантационное выращивание этой культуры в количественном отношении по выходу панаксозидов имеет преимущество перед каллусным сырьем, но по токсичности, препараты, получаемые из каллусного сырья менее опасны.

Четвертый фактор. Рентабельность производства на примере женьшеня стала преобладать в технологии получения «бородатых корней», где по условиям роста и скопления клеток возникают субпопуляции с повышенной дифференцировкой – это самые продуктивные клетки по биоактивным веществам.

Перспективность новых технологий получения биомасс лекарственных растений, содержащих то или иное активное начало в виде каллусных и суспензионных культур заложена в их неоспоримых преимуществах, таких как:

1. стандартность накапливаемого сырья

2. хороший выход активного начала

3. сокращение сроков культивирования для накопления растительной биомассы (вместо месяцев и недель счет идет на дни и часы). В начале логарифмической фазы клетки малы и обладают плотной цитоплазмой, но в стационарной фазе вакуолизируются и сильно увеличиваются в размерах. Деление клеток идет путем митоза, время удвоения их биомассы варьирует от 25 до 100 часов. Очень важно, что из-за низкой интенсивности дыхания клеток потребность их в кислороде

снижена и нет проблем в обеспечении культуры системами интенсивной аэрации.

4. возможность промышленного производства биомасс экзотических растений, малодоступных для нашей страны, например, таких как раувольфия, диоскорея, унгерия и др.

5. использование разных технологических режимов, но предпочтительнее растительные клетки выращивать в периодическом режиме, хотя можно использовать и полунепрерывное и непрерывное культивирование, если нарастание биомассы коррелирует с синтезом вторичных метаболитов.

6. использование методов иммобилизации и биотрансформации для повышения выхода продуктов вторичного метаболизма применительно к растительным клеткам. Здесь логично представить некоторый комментарий по влиянию на синтез и накопление вторичных метаболитов и уровнем их агрегатного состояния, т.е. чем ближе клетки к целому растению, тем выше у них должны быть метаболические потенциалы.

Однако здесь необходимо различать механизмы накопления вторичных метаболитов. Они разные. Если имеется прямая связь – один механизм накопления, когда определяющим в росте клетки является действительно уровень агрегации, когда достаточная ее степень может быть достигнута в медленно растущих культурах.

В случае обратной связи включается другой механизм накопления вторичных метаболитов и в этом случае уже определяющим фактором является не агрегация, а кинетика скорости роста, когда первичные и вторичные пути метаболизма по разному конкурируют за предшественник в быстро и медленно растущих организмах.

Вывод. Иммобилизованные клетки с низкой скоростью роста, способны к интенсивной выработке метаболитов.

Одним из основных условий иммобилизации является:

- выделение метаболита в питательную среду

- свободное извлечение метаболита из питательной среды. (например, к таким клеткам относятся клетки, продуцирующие алкалоиды)

Способы иммобилизации

- клетки встраивают в альгинат кальция

- клетки встраивают в агарозные шарики

- клетки встраивают в трехмерные сетчатые структуры из нейлона, порошкового металла, полиуретана. (в частности такие системы используются для Digitalis lanata и др. стр.110.

Каковы преимущества иммобилизованных клеток по сравнению с суспензионными культурами? Это:

• многократное использование

• четкое отделение биомассы от продуктов метаболизма

• увеличение продолжительности культивирования на стадии продуцирования

• получение большого количества вторичных метаболитов.

Биотрансформация – это метод, использующий ферменты, локализованные в клетке растения и способные менять функциональные группы добавленных из вне химических соединений. Метод используется для повышения биологической активности конкретной химической структуры и проведения серий специфических химических реакций за счет включения одного или нескольких последовательно связанных ферментов. В качестве примера можно привести превращение дигитоксина в дигогсин клетками Digitalis lanata.

Недеференцированные культуры клеток Digitalis lanata сами не образуют сердечных гликозидов, но могут осуществлять реакции биотрансформации субстратов, добавленных в питательную среду. Биотрансформация дигитоксина в дигогсин идет за счет реакции 12-гидроксилирования, катализируемой ферментом, находящимся в клетках Digitalis lanata.

Итак, для дальнейшего развития этого направления получения лекарственных средств на основе клеток растений с использованием биотрансформации необходимо следующее:

1. селекция специализированных линий клеток

2. оптимизация условий культивирования

3. сокращения времени ферментации

4. увеличение срока работы клеток.

 

 

⇐ Предыдущая24252627282930313233Следующая ⇒

Поделиться: