Теория взаимозаменяемости антибиотиков

В настоящее время есть 4 группы антибиотиков широкого спектра действия (β -лактамы, аминогликозиды, фторхинолоны тетрациклины). Если попробовать запретить применение одной группы (например, группы №1) антибиотиков, то резистентность к ним исчезает через 10 лет. После возобновления применения 1-ой группы, запрещают применение 2-ой группы и т.д.

Но сейчас нельзя исключить ни одной группы антибиотиков из практики лечения, так как достаточно активных и безопасных антибиотиков еще не хватает и требуется создавать новые и новые группы, но, со временем, наверное, можно применить такую схему чередования разных групп антибиотиков для повышения терапевтического эффекта.

Известно, что в разных частях бактериальной клетки транспептидаза пептидогликана как белок неодинакова, с другой стороны, все многочисленные антибиотики имеют одинаковый механизм действия на патогенный микроорганизм, поэтому в рекомендациях по применению антибиотиков различного характера имеется информация по взаимодействию их с пенициллинсвязывающими белками (ПБС). Эта рекомендация связана с иммунитетом человека, принимающего антибиотики. Если есть информация в рекомендациях по применению, что новый антибиотик связывается с ПБС-2, то это означает, что клетка микроорганизма будет активно лизироваться и освобождающиеся полисахариды в большом количестве будут поступать в кровь, что в свою очередь работает как пирогенный фактор и ведет к повышению температуры больного на короткое время. Такие антибиотики могут быть рекомендованы больным с невысоким уровнем иммунитета (например, это больные СПИДом). Если же есть информация о ПБС-3, то это означает, что в результате действия такого антибиотика бактериальная клетка только временно перестает делиться, оставаясь живой и после отмены этого антибиотика, она начинает снова свое размножение с большой активностью и с опасностью возникновения новой инфекции. Для людей с низким иммунитетом применение таких антибиотиков опасно. Реализуя в продаже тот или иной антибиотик, вы должны предупреждать врачей о таком факте.

Широкое и успешное использование антибиотиков в медицине привело к их использованию и в других областях, в том числе:

– в ветеринарии (с теми же целями, что и в медицине);

– для борьбы с некоторыми болезнями растений бактериального и грибкового происхождения;

– в качестве добавки к кормам животных, так как они ускоряют рост и увеличивают степень превращения кормов в мясо;

– в качестве консервантов скоропортящихся продуктов;

– для подавления бактериальной флоры при осуществлении различных процессов при производстве вакцин.

Наука об антибиотиках продолжает быстро развиваться. С одной стороны, продолжаются поиски новых, еще более эффективных препаратов биотехнологии, в том числе с иммуностимулирующим, противоопухолевым, противовирусным действием, с другой стороны, расширяются работы по химическому синтезу производных этих веществ и химической модификации природных антибиотиков.

Список использованной литературы:

1. Биотехнология. Ю.О. Сазыкин, С.Н. Орехов, И.И. Чакалева – М.: «Академия», 2007 г. – 215 с.

2. Егорова Т. А. Основы биотехнологии: Учеб. пособие для высш. пед. учеб заведений / Т.А.Егорова, С.М.Клунова, Е.А.Живухина. — М.: Издательский центр «Академия», 2003. — 208 с.

3. Катлинский А.В., Сазыкин Ю.О., Орехов С.Н., Чакалева И.И., Курс лекций по биотехнологии / ММА им. И.М. Сеченова, 2005 г. – 150 с.

4. Османов В.К., Лекции по биотехнологии/Ниж ГМА, 2008 г. – 250 с.

5. Основы фармацевтической биотехнологии, Т.П. Прищеп, В.С. Чучалин, К.Л. Зайков, Л.К. Михалева, Л.С. Белова – Ростов н/Д.: Феникс, 2006 г. – 180 с.

6. Тимощенко Л.В., Чубик М. В. Основы микробиологии и биотехнологии: учебное пособие /Л.В. Тимощенко, М.В. Чубик. – Томск: Изд-во Томского политехнического университета, 2009. – 194 с.

7. Фармацевтическая биотехнология: учеб. пособие / В.А. Быков (и другие) под общ. редакцией акад. РАМН и РАСНХ, профессора В.А. Быкова – Воронеж: издательство Воронеж. гос. ун-та, 2009. – 439 с.

Интернет ресурсы:

8. www.biotechnolog.ru

9. Биотехнология: генная инженерия, промышленная биотехнология, клеточная инженерия – учебное пособие: [электронный ресурс]. – Режим доступа: http: //www. biotechnolog.ru

10. Биоинформатика, геномика, протеомика. биософт, имейджинг: [Электронный ресурс]. – Режим доступа: http: //www.bioinFormatix.ru

11. Интернет журнал «Коммерческая биотехнология»: [Электронный ресурс]. – Режим доступа: http: //www.cbio.ru

12. Общество биотехнологов России им. Ю.А. Овчинникова: [Электронный ресурс]. – Режим доступа: http: //www.biorosinfo.ru Remedium.ru:

13. Профессионально о медицине и фармации [Электронный ресурс]. – Режим доступа: http: //www.remedium.ru

14. Новости GMP – Стандарт GMP – Фармацевтические производства и технологии [Электронный ресурс]. – Режим доступа http: //www.gmpnews.ru

15. Ассоциация Российских фармацевтических производителей [Электронный ресурс]. – Режим доступа http: //www.arfp.ru

Лекция №7

Тема лекции: Ферментные препараты и иммобилизация ферментов.

 

Цель лекции: ознакомить студентов с использованием ферментных препаратов в медицине. Изучить понятие иммобилизации, методы иммобилизации ферментов, микроорганизмов, животных и растительных клеток, а также преимущества иммобилизации и применение при создании лекарственных средств.

 

 

План лекции:

1. Ферменты

2. Применение ферментов

3. Источники ферментов

4. Технология культивирования микроорганизмов - продуцентов ферментов

4.1 Технология выделения и очистки ферментных препаратов

5. Инженерная энзимология, ее задачи

6. Иммобилизованные ферменты

6.1. Носители для иммобилизации ферментов

6.2. Методы иммобилизации ферментов

6.3. Иммобилизация клеток

6.4. Промышленные процессы с использованием иммобилизованных ферментов и клеток

6.5. Биосенсоры на основе иммобилизованных ферментов

6.6. Иммобилизованные ферменты в медицине

 

Оснащение лекции: презентация

Место проведения: аудитория 525

 

 

Ферменты

 

В основе современной инженерной энзимологии лежит применение иммобилизованных ферментов и ферментных систем. Вспомним природу самих ферментов.

Ферменты – это катализаторы биологического происхождения. Наиболее ценные свойства ферментов – это высокая активность и специфичность (селективность) действия. Живые организмы содержат сотни и тысячи ферментов, основная функция которых заключается в регуляции практически всех химических реакций, определяющих жизнедеятельность организма.

Приведем классификацию ферментативных реакций.

Это:

1. окисление и восстановление

2. перенос функциональных групп от одних молекул на другие

3. гидролиз

4. реакции с участием двойных связей

5. изомеризация, или структурные изменения в пределах одной молекулы

6. синтез сложных соединений (обычно с энергетическими затратами).

У ферментов сложное пространственное строение, включающее определенную комбинацию химических групп. Имеются сведения, что в природе обнаружено свыше трех тысяч разных специфических ферментов.

Однако, технологическое применение ферментов имеет ограничения по следующим причинам:

1. большая затрата труда на отделение от исходных агентов (как правило ферменты используются однократно)

2. неустойчивость (лабильность ферментов при хранении)

3. большая затрата труда на очистку ферментов, что определяет высокую стоимость их производства.

Сравнительно недавно (несколько десятков лет назад) четко определились пути преодоления этих трудностей. Эти пути связаны с получением иммобилизованных ферментов и иммобилизованных клеток микроорганизмов.

 

2. Применение ферментов

Ферменты сохраняют свои уникальные свойства (эффективность, специфичность действия) вне клеток, поэтому их традиционно ши­роко применяют в практике. Биологические катализаторы неток­сичны, работают в мягких условиях, используют доступное сырье (в том числе и отходы), в связи, с чем их применение в промышлен­ности выгодно с экономической и экологической точек зрения.

По объему производства ферменты занимают третье место после аминокислот и антибиотиков. Из более чем 2000 известных в настоя­щее время ферментов в промышленности используется около 30. Основная часть ферментов, поступающих на мировой рынок, прихо­дится на долю гидролаз, из которых 60 % составляют пептидогидролазы (в основном щелочные и нейтральные протеазы), исполь­зующиеся в качестве детергентов в производстве синтетических мою­щих средств, а 30 % — гликозидазы, применяющиеся в производ­стве кондитерских изделий, фруктовых и овощных соков. Фермен­ты находят применение в текстильной, кожевенной, целлюлозо- бумажной, медицинской, химической промышленности.

По прогнозам ученых, основным потребителем ферментов в ближайшем будущем остается пищевая промышленность. Главное место среди этих энзимов занимают глюкоизомераза и глюкоамилаза, применяющиеся для приготовления обогащенных фрукто­зой кукурузных сиропов и составляющие около 50 % рынка пи­щевых энзиматических препаратов.

Все большее развитие получают технологические процессы с участием сложных энзиматических систем, включающих коферменты. Так, созданы ферментные мембранные реакторы, катали­зирующие непрерывные процессы с регенерацией НАДН (вос­становительное аминирование кетокислот, восстановление а-кетокислот в а-гидроксикислоты). Разработаны системы разделения рацематов посредством стереоспецифического активного транс­порта. Например, мембрана, содержащая гексокиназу и фосфатазу, функционирует как насос, избирательно прокачивающий лишь D-глюкозу. Применение сопряженных ферментативных реакций с участием алкогольоксидазы и катал азы дрожжей Hansenulla polimorpha и формальдегиддисмутазы бактерии Pseudomonas putida позволило осуществить окисление метанола в муравьиную кислоту с выхо­дом 88 — 94%. В промышленности большое будущее имеют фер­менты, способные катализировать химические реакции в органи­ческой фазе, в частности липазы. Существенно, что каталитичес­кая активность панкреатической липазы свиньи сохраняется при концентрации воды в реакционной среде, составляющей всего 0, 015 %, и при температуре 100 ⁰С. Препараты липазы используют для синтеза оптически чистых сложных эфиров и феромонов, при­меняющихся в парфюмерии и медицине.

Для деградации и модификации антропогенных органических соединений, поступающих в окружающую среду, используют фер­менты разных классов и в том числе лакказу, лигниназу, тирозиназу, монооксигеназу, диоксигеназу и др. Перспективна для очи­стки сточных вод новая технология, основанная на использова­нии реакции пластеинообразования, открытой А.Я. Данилевским в 1886 г. Сущность работ Данилевского состоит в эксперименталь­ном доказательстве обращения протеолиза и возможности синтеза белковоподобных веществ (пластеинов) под действием ряда протеолитических ферментов. Сточные воды содержат аминокислоты и пептиды, концентрация которых возрастает в результате гидролиза белковых компонентов отходов под воздействием пептидогидролаз микроорганизмов. Данная технология, активно внедряющаяся во Франции, нацелена на производство в промышленных масштабах кормовых белков из аминокислот и пептидов сточных вод.

Ферменты широко используют в медицине, например в заме­стительной терапии в составе лечебных препаратов. Пероральное введение фенилаланин-аммиаклиазы снижает уровень фенилаланина в крови при фенилкетонурии. Протеолитические фермен­ты, амилазу и липазу применяют при заболеваниях желудочно-кишечного тракта и печени. В последние годы накопились данные об эффективности применения протеиназ в энзимотерапии злокачественных новообразований. Это объясняется большей проницае­мостью мембран раковых клеток для гидролитических ферментов в сравнении с нормальными клетками, благодаря чему опухоле­вые клетки быстро лизируются при введении смеси протеиназ (препарат «папайотин»), Протеолитические ферменты — плазмин и активирующие его стрептокиназу и урокиназу используют для растворения тромбов в кровеносных сосудах; коллагеназу — для рассасывания рубцовых образований; эластазу — для задержки раз­вития атеросклероза; лизоцим — для лечения конъюнктивитов; дезоксирибонуклеазу из стрептококка (стрептодорназа) — для ле­чения заболеваний верхних дыхательных путей и роговицы глаза.

Важнейшую область применения ферментов в медицине со­ставляет энзимодиагностика — тестирование патологии того или иного органа человека по уровню активности фермента или соот­ношению его множественных форм и изоферментов. Так, аспартатаминотрансфераза, изоцитратдегидрогеназа, лактатдегидрогеназа и альдолаза служат для выявления инфаркта миокарда; аланина- минотрансфераза, аспартатаминотрансфераза и лактатдегидроге­наза — для диагностики заболеваний печени; глутамилтрансфераза — для блокировки отторжения органов при их пересадке и т.д.

Таким образом, производство ферментных препаратов зани­мает одно из ведущих мест в современной биотехнологии и отно­сится к тем ее отраслям, объем продукции которых постоянно растет, а сфера применения неуклонно расширяется. По объему производства ферментов доминируют страны Западной Европы. Резкий рост этой индустрии наблюдается в США и Японии.

 

3. Источники ферментов

Ферменты присущи всем живым существам, однако для их выделения используют те природные объекты, в которых содер­жание искомого энзима составляет не менее 1 %. Для крупномас­штабного получения ферментов пригодны только некоторые рас­тительные организмы на определенной фазе их развития (пророс­шее зерно различных злаков и бобовых, латекс и сок зеленой массы ряда растений), а также отдельные ткани и органы живот­ных (поджелудочная железа, слизистая оболочка желудочно-кишечного тракта, сычуг крупного рогатого скота, семенники по­ловозрелых животных). Практически неограниченный источник ферментов — микроорганизмы (бактерии, грибы, дрожжи), содержащие набор большинства известных в настоящее время энзи­мов, количество которых можно повысить в десятки и сотни раз методами мутагенеза, селекции и индукции биосинтеза.

 

4. Технология культивирования микроорганизмов - продуцентов ферментов

В зависимости от источника технология получения фермент­ных препаратов имеет свои особенности. При извлечении фер­ментов из растительного сырья и животных тканей технология сводится к экстракции энзимов и очистке их от сопутствующих балластных веществ. Технология ферментных препаратов микроб­ного происхождения более сложная, так как дополнительно вклю­чает этапы культивирования микроорганизмов — продуцентов ферментов, в том числе этапы получения посевного материала и производственной культуры соответствующего микроорганизма.

Для производства посевного материала используют исходный штамм продуцентов, получаемый из лабораторных чистых культур, который выращивают разными способами на предварительно стери­лизованной твердой или жидкой питательной среде до определенного возраста. Посевной материал консервируют (высушиванием или хра­нением при низких температурах) вплоть до дальнейшего исполь­зования. Производственные культуры продуцента получают, выра­щивая посевной материал микроорганизмов как на поверхности твердых или жидких сред, так и в глубине жидких питательных сред.

Поверхностный метод выращивания продуцентов, предложенный И. Такамине еще в 1894 г., состоит в культивировании микроорга­низмов на поверхности увлажненных стерилизованных отрубей, «размещенных в кюветах, к которым иногда добавляют солодовые ростки, древесные опилки, свекловичный жом. Инкубацию микроорганизмов ведут в специальном термостатируемом цехе при постоянном контроле в нем температуры, влажности и подачи воздуха.

В последние 15 лет для выращивания продуцентов ферментов, чаще используют более экономный — глубинный метод культивирования (рис. 1). В промышленных условиях для этих целей применяют ферментеры из нержавеющей стали, снабженные приспособлениями для перемешивания и подачи в жидкую питательную среду стерильного воздуха. Сначала ферментер заполняют питательной средой, автоклавируют, а затем засевают чистой культурой, подаваемой из специального генератора. Для предотвращения инфекции в ферментере поддерживают повышенное давление наряду с оптимальными значениями рН, температуры, редокспотенциала и другими условиями культивирования.

Рис. 1. Принципиальная технологическая схема глубинного культивирования микроорганизмов (по А.А.Свитцову и др., 1986): 1-смеситель питательной среды; 2 — стерилизатор в непрерывном режиме потока питательной среды; 3, 4 — теплообменники; 5 — посевные аппараты; б, 10, 12 — фильтры для очистки воздуха; 7 — ферментер; 8, 9 — насосы; 11 — компрессор.

 

В настоящее время наиболее прогрессивным признан проточ­ный метод культивирования микроорганизмов, который обеспе­чивает непрерывную подачу в ферментер как питательной среды, так и посевного материала. Размножение микроорганизмов и био­синтез фермента регулируют при использовании этого метода по мере поступления питательной смеси в ферментер. Такой фер­ментер представляет собой вращающийся трубкообразный реак­тор, через один конец которого в него поступает питательная среда и культура микроорганизмов, а из другого — выводятся фермен­ты, продукты жизнедеятельности и бактериальная масса. Основ­ное достоинство метода — возможность длительное время под­держивать в автоматическом режиме рост культуры микроорга­низма. Например, культура ацетонобутиловых бактерий находи­лась в таком реакторе в состоянии непрерывного размножения в течение 200 суток (И.Д.Иерусалимский с сотр., 1986).

Важнейшим фактором эффективности технологии ферментных препаратов является качество питательной среды. Основное тре­бование к качеству питательной среды состоит в полноценности ее состава, обеспечивающей рост продуцента и биосинтез целево­го фермента. Микроорганизмы нуждаются прежде всего в соеди­нениях, содержащих углерод, азот, водород и кислород. К ним относятся органические вещества, соли аммония и вода. Кроме того, в состав питательной среды должны быть включены мине­ральные соединения, содержащие Mg, Са, Р, S, Fe, К и другие макро- и микроэлементы, витамины, ростовые вещества (биотин, инозит) и пр. Питательные среды в зависимости от состава делят­ся на синтетические и комплексные. Синтетическими считают те среды, которые состоят из определенного по качественному и коли­чественному составу набора индивидуальных веществ. В комплекс­ные среды входят различные природные продукты, часто отходы пищевых производств. К их числу относятся различные жмыхи, барда спиртовых заводов, картофельная мезга, кукурузный экст­ракт, меласса, отруби и прочие продукты. Благодаря использова­нию отходов комплексные питательные среды доступны, дешевы и обеспечивают безотходность биотехнологических производств.

 

4.1 Технология выделения и очистки ферментных препаратов

Выделение и очистка фермента как из культуры микроорга­низма (выращенного любым способом), так и из других природ­ных источников весьма трудоемкая и дорогостоящая процедура, поэтому, если фермент можно использовать в виде неочищенно­го препарата, его не очищают. В промышленности широко приме­няют коммерческие препараты ферментов, чистота которых со­ставляет всего 0, 1 % (т.е. 99, 9 % составляют примеси). К таким от­раслям относятся спиртовая, кожевенная, текстильная промыш­ленность, а также сельское хозяйство, производство бытовой хи­мии. Например, ферментный препарат, употребляемый в пивова­рении, представляет собой высушенную биомассу плесневых гри­бов. В большинстве отраслей пищевой промышленности, практи­ке научных исследований и особенно в медицине используют толь­ко очищенные препараты ферментов, частично или полностью освобожденные от балластных веществ и полностью охарактери­зованные в отношении их специфичности и физико-химических свойств. Исходным материалом для получения препаратов фер­ментов служат: биомасса продуцента, фильтрат культуральной жидкости, экстракт из культуры микроорганизма или из тканей и органов растений и животных, из которых готовят препараты раз­личной степени очистки.

Неочищенные ферментные препараты получают путем высуши­вания в мягком режиме культуры микроорганизмов вместе с остатка­ми питательной среды. Такие препараты получают и путем упарива­ния экстракта из культуры продуцента, выращенного поверхностным способом, или из фильтрата культуральной жидкости (в случае глубинного выращивания микроорганизмов). Распространен так­же метод ацетоновых порошков, состоящий в осаждении и быст­ром обезвоживании при температуре не выше -10°С тканей или вытяжек из них, содержащих ферменты. Технические препараты ферментов представляют собой либо высушенные до порошко­образного состояния продукты, либо жидкие концентраты, обычно характеризующиеся 50 %-м содержанием сухой массы веществ.

Для успешного выделения ферментов из клеточного содержи­мого необходимо очень тонкое измельчение исходного материала вплоть до разрушения субклеточных структур: лизосом, митохон­дрий, ядер и др., которые имеют в своем составе многие индиви­дуальные ферменты. Для этого используют специальные мельни­цы и гомогенизаторы, а также ультразвук, метод попеременного замораживания и оттаивания ткани. Для высвобождения фермен­тов из мембранных структур клетки к гомогенатам добавляют не­большие количества детергентов (твин, тритон Х-100) или обра­батывают их энзимами — лизоцимом, целлюлазой, лецитиназой С. Особое внимание при выделении ферментов уделяют проведению всех операций в условиях, исключающих денатурацию белка (ней­тральные значения рН, стабилизирующие добавки в виде белков, солей и специальных соединений).

Пример, иллюстрирующий получение частично очищенного пре­парата (ᵝ -галактозидазы из мутанта Е. coli, представлен на рис. 2. Схема очистки включает отделение клеток микроорганизма по выходе их из ферментера от культуральной жидкости посредством центрифугирования и последующее разрушение клеток в гомоге­низаторе высокого давления. Для освобождения белков от нуклеи­новых кислот полученный гомогенат обрабатывают сульфатом марганца до конечной концентрации этой соли в смеси, равной 0, 05 М. Осадок нуклеиновых кислот отделяется с помощью рота­ционной вакуум-фильтрации, а в образовавшийся фильтрат до­бавляют сульфат аммония до 45 % от его насыщения. Возникший осадок белков, содержащий ᵦ -галактозидазу, собирают с помо­щью центрифугирования или вакуум-фильтрации. Вся процедура очистки энзима от момента подачи бактерий в систему до момен­та получения осадка ᵝ -галактозидазы занимает всего 1 ч.

Рис. 2. Технологическая схема непрерывного получения Р-галактозидазы из клеток Е. coli ML308 (по P.P.Gray et al., 1972): 1 — стерилизатор среды; 2— ферментер; 3, 7 — центрифуги; 4 — гомогенизатор; 5 — теплообменник; 6 — смесительные камеры; 8 — ротационный вакуум-фильтр.

 

В зависимости от свойств выделяемого фермента и сопутствую­щих ему балластных веществ при получении очищенных препара­тов ферментов комбинируют различные приемы и методы, такие, как термическое фракционирование, осаждение органи­ческими растворителями, солями и тяжелыми металлами, фильт­рация на молекулярных ситах, ионообменная хроматография, элек­трофорез, изоэлектрофокусирование.

На заключительных этапах очистки часто используют аффин­ную хроматографию (биоспецифическая хроматография, хромато­графия по сродству), которая основана на способности фермен­тов избирательно связывать те или иные лиганды — субстраты, коферменты, конкурентные ингибиторы, аллостерические эффек­торы и т.п. Такое связывание весьма специфично, что позволяет выделить тот или иной энзим из множества других бел­ков. Например, из желудочного сока человека методом одноэтапной аффинной хроматографии выделена кислая липаза, исполь­зующаяся в заместительной терапии при заболеваниях печени.

Для синтеза аффинного сорбента, соответствующего специфич­ности данного фермента, лиганд (субстрат или его аналог) при­соединяют к инертной матрице (макропористые гидрофильные гели, синтетические полимеры, неорганические носители). Для уменьшения пространственных трудностей при взаимодействии фермента с матрицей лиганд присоединяют к носителю через про­межуточное звено (вставку, ножку, спейсер). Присоединение лигандов к поперечносшитой агарозе — сефарозе обычно проводят, активируя ее бромцианом (см. с. 91). Связывание с сефарозой, ак­тивированной бромцианом, л-амино-бензилянтарной кислотой, используемой в качестве лиганда, обеспечивает взаимодействие сорбента с каталитическим центром только карбоксипептидаз бла­годаря сходству лиганда с субстратами карбоксипептидазы:

 

 

—со—NH-CH-COOH НО-СО-СН-СН-СООН Матрица—О—С—NH II О С-концевой остаток Аффинный сорбент с лигандом. фенилаланина в субстрате Бензилянтарная кислота изостерична карбоксипептидазы структуре остатка фенилаланина

 

В процессе выделения повышается доля фермента в массе тоталь­ных белков, т.е. увеличивается его удельная активность.

В производственных условиях активность получаемого фермент­ного препарата оценивается количеством субстрата, преобразо­ванного 1 мг (1кг) препарата при оптимальных условиях за 1 мин, и измеряется в Е/мг, моль/мг или каталах/кг белка.

Очищенные ферментные препараты хранят при низкой темпе­ратуре (до -80 °С). Для стабилизации ферментов в их препараты добавляют коферменты и субстраты. Ферментные препараты для промышленного применения стабилизируют, добавляя глицерин, моносахариды, дисахариды (глюкоза, сахароза, лактоза), HS-coединения (цистеин, глутатион, меркаптоэтанол, дитиотреитол и др.), отдельные аминокислоты, желатину и другие белки-напол­нители.

Существенно, что из 2003 включенных в список известных в настоящее время ферментов более 1500 выделено и в той или иной степени очищено; это служит не только базой для изучения физи­ко-химических основ ферментативного катализа, но и фундамен­том для совершенствования химического производства и промыш­ленности.

 

5. Инженерная энзимология, ее задачи

Развитие прикладной энзимологии долгое время сдерживалось дороговизной чистых ферментных препаратов, неустойчивостью их при хранении и невозможностью многократного использова­ния. Принципиально новые перспективы открылись перед при­кладной энзимологией в 60-е годы XX в. в результате появления на стыке химии и биологии новой отрасли — инженерной энзи­мологии. Ее задачи заключаются в развитии прогрессивных мето­дов выделения ферментов, их стабилизации и иммобилизации; конструировании катализаторов с нужными свойствами и разра­ботке научных основ их применения.

В частности, методами белковой инженерии, сущность кото­рых состоит в изменении первичной структуры природной моле­кулы фермента посредством химической модификации самого; энзима или его гена, удается принципиально трансформировать структуру активного центра и его функцию, модулировать субстратную специфичность и физико-химические свойства фермен­та. Так, замена остатка глутамина-102 в молекуле лактатдегидрогеназы на аргинин превратила фермент в высокоактивную малатдегидрогеназу. Описанным способом получены термостабильные формы лизоцима Т-4 и субтилизина (каталитическая константа субтилизина изменена в 100 раз), созданы гибридные формы фер­ментной системы, ценной в иммуноферментном анализе, сочета­ющие в себе свойства Р-галактозидазы и Р-галактокиназы.

Многие проблемы технологии синтеза органических соедине­ний, пищевой и медицинской промышленности, мониторинга че­ловека и окружающей среды, защиты окружающей среды, энер­гетики не могут быть решены без использования методов совре­менной инженерной энзимологии.

Важным этапом развития инженерной энзимологии стала раз­работка способов получения и использования иммобилизованных ферментов.

 

6. Иммобилизованные ферменты

Иммобилизованными ферментами называются ферменты, ис­кусственно связанные с нерастворимым носителем, но сохраня­ющие свои каталитические свойства.

Еще в 1916 г. Дж. Нельсон и Е. Гриффин показали, что сахаро­за, сорбированная на угле, сохраняла свою каталитическую ак­тивность, но лишь в 1953 г. Н. Грубхофер и Д. Шлейт впервые осу­ществили ковалентные связывания амилазы, пепсина, РНКазы и карбоксипептидазы с нерастворимым носителем.

В 1971 г. на первой конференции по инженерной энзимологии был узаконен термин «иммобилизованные ферменты». Однако в понятие «иммобилизация» в настоящее время вкладывают более широкий смысл, чем связывание на нерастворимом носителе, а именно — полное или частичное ограничение свободы движения белковых молекул.

Иммобилизация – физическое разделение биообъекта (клетка, фермент) и растворителя, то есть биообъект закреплен на нерастворимом носителе, а субстрат и продукты свободно обмениваются между биообъектом и растворителем.

Биообъект может работать в этом случае многократно (неделя, месяц). Другими словами можно сказать, что иммобилизация ферментов – это перевод их в нерастворимое состояние с сохранением частичным или полным) каталитической активности.

Преимущества иммобилизации биообъекта:

1. многократность использования ферментов и живых клеток в наиболее продуктивной фазе

2. снижение количества отходов производства

3. повышение качества целевого продукта (он менее загрязнен), более простое выделение целевого продукта (особенно важно для производства инъекционных лекарственных препаратов, когда в продукте мало белка – нет пирогенности и аллергенности).

4. биотехнологический процесс становится более стандартным, более предсказуемым.

5. устойчивость к внешним воздействиям.

Для получения иммобилизованных ферментов обычно применяют следующие методы:

1. Ковалентное присоединение молекул ферментов к водонерастворимому носителю, в качестве которого используют как органические (природные и синтетические) полимеры, так и неорганические материалы. К природным материалам относятся целлюлоза, хитин, агароза, декстраны, бумага, ткани, полистирол, ионообменные смолы и так далее.

2. Захват фермента в сетку геля или полимера.

3. Ковалентная сшивка (сшивание) молекул фермента друг с другом или с инертными белками при помощи би- или полифункционального реагента.

4. Адсорбция фермента на водонерастворимых носителях (часто на ионитах)

5. Микрокапсулирование (захват раствора фермента в полупроницаемые капсулы размером 5-300 миллимикрон).

Такая ситуация приводит к совершенствованию технологических процессов.

В результате иммобилизации ферменты приобретают преимущества гетерогенных катализаторов – их можно удалять из реакционной смеси (и отделять от субстратов и продуктов ферментативной реакции) простой фильтрацией. Кроме того, появляется возможность перевода многих периодических ферментативных процессов на непрерывный режим, используя колонны или проточные аппараты с иммобилизованными

ферментами.

Иммобилизованные ферменты долговеч­ны и в тысячи и десятки тысяч раз стабильнее свободных энзимов. Так, происходящая при температуре 65°С термоинактивация лактатдегидрогеназы, иммобилизованной в 60%-м полиакриламидном геле, замедлена в 3600 раз по сравнению с нативным фер­ментом. Все перечисленное обеспечивает высокую экономичность, эффективность и конкурентоспособность технологий, использу­ющих иммобилизованные ферменты.

Ограничения метода иммобилизации:

• если целевой продукт не выходит в среду растворителя, а накапливается внутри клетки, то работать с иммобилизованным продуктом нет смысла.

• Ферменты тоже не всегда можно иммобилизовать, например, если у фермента есть кофермент, который с ним не прочно связан.

Кофермент можно вводить в среду, но это не всегда бывает возможно, в условиях производства.

Пути иммобилизации ферментов и целых клеток

1. Адсорбция на нерастворимом носителе (на окиси алюминия, угле, смолах, карбоксиметилцеллюлозе и др.)

Адсорбция имеет недостаток, так как связи (в основном ионные) могут быть недостаточно прочными и разрушаться под воздействием рН и других факторов, при этом биообъект снимается с носителя. В производстве используется редко.

2. Адсорбция на аффинном носителе (избирательная сорбция к определенной группе веществ)

3. Ковалентное связывание. Носитель активируют, например ПААГ активируют бромцианом или глутаровым альдегидом. Носитель не должен быть токсичным для биообъекта. Максимальная нагрузка носителя – это максимальное количество фермента, которое может быть иммобилизовано на определенном количестве носителя. Чем она больше, тем лучше.

4. Включение биообъекта в носитель или инкапсулирование Биообъект включается в ячейки геля, субстрат проникает в ячейки, а целевой продукт свободно выходит.

Сложности, возникающие при инкапсулировании.

Если биообъект – изолированный очищенный фермент, то для его включения в гель ячейки не должны быть слишком большими. Но, если ячейки слишком маленькие, то затруднен контакт с субстратом и необходимо подбирать условия, чтобы субстрат свободно проникал и свободно уходил целевой продукт. Если биообъект – клетки, то ячейки должны быть достаточно большими. Необходим достаточный доступ к клеткам кислорода и отведения углекислого газа. Связь с гелем не очень прочная и биообъект может вымываться.

Таблица 1.

 

Иммобилизация биообъекта

Биообъект	Технологическая операция
1.Очищенный фермент	Катализирует отдельную реакцию, одноступенчатая трансформация, биоконверсия.
2. Фермент сохраняется в клетке с Коферментом	Отдельная реакция
3. Фермент в пермеабилизированной клетке (в клетке, у которой повышена проницаемость	Отдельная реакция
4. Интактная клетка с полной функциональной активностью (клетка-продуцент)	Цепь реакций – полный биосинтез целевого продукта
5. Система, открытая для усложнения, клетка-фермент + и т.д.	Биосинтез продукта и его трансформация в одном биореакторе.

 

Рис.3. Аппаратное оформление

 

 

Путем микробиологического синтеза для медицинских целей получают следующие ферментные препараты:

• Солизим (липолитический фермент, гидролизующий жиры, применяется при желудочно-кишечных заболеваниях) α -амилаза (сахаролитический фермент), гидролизующий крахмал, который входит в состав лечебного препарата «Фестал», используется при недостаточной функции поджелудочной железы.

• Террилитин (протеолитический фермент), рекомендуется при лечении гнойных ран, ожогов, трофических язв.

• Стрептокиназа (фибринолитический фермент), используется при тромбозах β -галактозидаза (сахаролитический фермент) используется при лактазной недостаточности.

• Традиционные биотехнологии, основанные на переработке тканей животных представлены

• Трипсином, химотрипсином (протеолитические ферменты) используются для рассасывания рубцов и спаек.

• Урокиназой (протеолитический фермент) используется при лечении тромбозов

• Пепсином (протеолитический фермент), используется при расстройствах пищеварения.

 

6.1. Носители для иммобилизации ферментов

⇐ Предыдущая20212223242526272829Следующая ⇒

Поделиться: