Определение хромосомной локализации генов

Первым шагом на пути идентификации генов является построение генетических карт. На основе специфического рисунка окрашивания хромосом строя цитологические карты. При совмещении цитологической карты с картой генов образуется цитогенетическая карта.

Единицей измерения расстояния между генами являются сантиморган (1сМ = 1% рекомбинации). Генетические расстояния не всегда соответствуют физическому расстоянию, измеряемому в молекулах ДНК нуклеотидами или парами оснований, а также тысячами (килобазами – кб) и миллионами (мегабазами – мб) пар основание. Это происходит потому, что рекомбинация не носит случайного равномерного характера по всей длине хромосом. Есть участки, в которых кроссинговер происходит чаще, тогда как в других областях он может быть подавлен. Установлено, что при образовании сперматозоидов процесс рекомбинации идет менее интенсивно, чем при образовании яйцеклеток.

Если измерить суммарную длину генома в единицах рекомбинаций, то у женщин она составит около 3300 сМ, тогда как у мужчин только 3000 сМ. Это не означает, что у мужчин ДНК короче, а происходит за счет менее интенсивного процесса рекомбинаций в сперматогенезе по сравнению с овогенезом. Несмотря на возможные расхождения между генетическими и физиологическими расстояниями на отдельных участках хромосом, в целом можно сказать, что 1сМ соответствует 1 миллиону пар оснований (1 мб).

Первые карты генов были построены для дрозофилы. Мушка очень интенсивно и быстро размножается в лабораторных условиях. У нее большое количество хорошо различимых внешних признаков, при этом всего 4 пары хромосом, поэтому гены легко сопоставлять с хромосомами.

Затем генетические карты стали строиться для микроорганизмов. Хотя процесс построения карт генов человека долгие годы протекал очень тяжело. В середине 70-х годов (20 столетия) была известна принадлежность к аутосомам буквально нескольких генов и примерно 100 генов, находящихся в Х-хромосоме, т.к. рецессивные гены половой Х-хр у гемизиготных мальчиков.

В конце 20 столетия произошло очень много открытий не только в генетике, но и в смежных областях биологии. Первый успех картирования генома человека связан с достижениями в области клеточной биологии. Была разработана технология получения и культивирования межвидовых соматических гибридных клеток. Так, если совместно выращивать, а затем специальным образом обрабатывать клетки кожи человека и мыши, можно добиться их слияния. Такие соматические гибриды не только живут в искусственных условиях культивирования, но и размножаются. Поскольку в них слишком много хромосом, при делении некоторые хромосомы могут теряться. В 1 очередь теряются хромосомы человека, они менее устойчивые. Таким образом, создали клоны клеток, в каждом из которых содержалось по 1-ой хромосоме человека в окружении хромосом мыши. Находя у конкретного клона белки человека, можно утверждать, что гены, ответственные за производство этого белка, находятся именно в той хромосоме человека, которая присутствует в данном гибридном клоне. Так методом соматической гибридизации удалось картировать многие гены человека.

В силу того, что у человека детей в семьях мало, растут они долго и внуков приходится ждать > 20 лет, были созданы банки долго живущих клеточных культур, полученных от членов больших семей, насчитывающих в нескольких поколениях сотни родственников. С этими клетками стало возможно работать буквально как с микроорганизмами. Так удалось определить локусы генов, детерминирующих редкие наследственные заболевания.

Основной успех в построении карт генов человека пришел с внедрением молекулярных технологий. В начале 90-х годов была построена карта микросателлитных индексных маркеров, перекрывающих около 99 % всего генома. Около 80% данных последовательностей полиморфны (высоко изменчивы) по числу повторяющихся элементов в кластере. Так была определена цитогенетическая локализация более 5000 повторов, разбросанных случайным образом по всем хромосомам. Среднее расстояние между повторами составило 0,5 сМ (или около 500 тыс. нуклеотидов).

Карта микросателлитных индексных маркеров позволяет определять локализацию любого неизвестного гена, если получены клетки от членов семьи с наследственной передачей разных аллелей этого гена. В настоящее время картировано уже около 6500 генов человека и более 30000 ДНК-маркеров.

Основной вывод: основным методом построения карт генов является анализ наследования признаков в родословных.  

   

Тема 8.  ГЕНОМ ЧЕЛОВЕКА

Под геномом понимается полная генетическая система клет­ки, которая обеспечивает наследственную передачу в ряду по­колений всех ее свойств и признаков. ДНК выполня­ет ту же функцию. Поэтому очень часто выражения "геном" и "ДНК" употребляют как синонимы. Наследственная передача признаков ас­социируется в нашем сознании с генами. Но знаем, что гены занимают относительно небольшую часть генома, их ко­дирующие области составляют не более 3% молекулы ДНК че­ловека. Чем же представлена основная часть генома?

По разным оценкам от 35% до 50% генома человека занято по­следовательностями, многократно повторяющимися в молеку­ле ДНК. Большинство из них не входят в состав кодирующих областей генов. Некоторые повторяющиеся последовательнос­ти выполняют структурную роль. Эта роль очевидна для сателлитных повторов, составленных из относительно коротких мо­нотонных последовательностей, сгруппированных    в протяженные тандемные кластеры. Такие последовательности способствуют повышенной спирализации ДНК и могут служить своеобразными опорными точками в каркасе хромосом. Поэто­му неудивительно, что большое количество сателлитных повто­ров локализовано на концах и в центромерных районах хромо­сом, где гены практически отсутствуют. Локализация большого количества сателлитных повторов в этих районах необходима для правильной организации и поддержания хромосомы как еди­ной, целой структуры, а также для правильного расхождения хро­мосом при делении клетки. Но на этом функции сателлитных ДНК не ограничиваются. Так, менее понятной остается роль очень многочисленного класса микросателлитиых повторов, достаточно равномерно распределенных по всем хромосомам и составленных из 1-4 тандемно повторяющихся однотипных по­следовательностей нуклеотидов. Очень многие из них оказыва­ются высокополиморфными по числу повторяющихся элемен­тов в кластере. Это значит, что в гомологичных местах локализации микросателлитов у разных индивидуумов может содержаться разное число повторяющихся элементов. Большая часть подобной изменчивости носит нейтральный характер, то есть не приводит к развитию каких-то патологических процес­сов. Однако в тех случаях, когда нестабильные микросателлит-ные повторы локализованы в генах, увеличение (экспансия) ко­личества повторяющихся элементов в кластерах повторов может существенно нарушать работу этих генов и реализоваться в виде наследственных заболеваний, получивших название болезней экспансии. Высокий уровень полиморфизма многих нейтраль­ных микросателлитных повторов приводит к тому, что большин­ство населения оказывается по ним гетерозиготным. Это свойст­во полиморфных микросателлитных последовательностей в сочетании с их повсеместным распространением делает их наи­более удобными молекулярными маркерами, доступными для анализа практически любого гена.

Другой тип уже несгруппированных, более протяженных по­вторяющихся элементов составляют комплементарные последо­вательности, ориентированные в противоположных направлени­ях по отношению друг к другу. Их называют инвертированными или обращенными повторами. Такие последовательности способ­ны обеспечить приближение удаленных друг от друга участков молекулы ДНК, что может быть важно для выполнения многих ее нормальных физиологических функций.

Попутно отметим, что в геноме человека очень много регуляторных элементов, функции которых связаны с самовоспроиз­водством молекул ДНК, с координированной работой многих генов, составляющих так называемые "генные сети", и с рядом других процессов. Регуляторные элементы, как правило, также многократно повторяются в молекулах ДНК. Кроме того, у выс­ших, в том числе и у человека, более сложная по сравнению с ми­кроорганизмами система регуляции экспрессии самих генов. Это связано с необходимостью обеспечения избирательной работы разных генов в дифференцированных тканях многоклеточного организма. Поэтому у высших организмов существует еще одна дополнитель­ная ступень регуляции, определяющая готовность гена работать в определенной ткани. Регуляторные элементы этой системы (энхансеры), в отличие от основных регуляторов (промоторов), мо­гут располагаться на значительном расстоянии от гена и могут быть по-разному ориентированы по отношению к гену.

И, наконец, наиболее многочисленными являются умерен­ные или низкокопийные повторы, более протяженные по срав­нению с сателлитными ДНК и дисперсно разбросанные по ге­ному. Количество таких повторяющихся элементов может достигать в молекулах ДНК человека десятков тысяч, а иногда и сотен тысяч копий. Их роль еще менее понятна, но очевидно, что они выполняют скорее регуляторные, чем структурные функции. Некоторые виды этих повторов оказываются способ­ны выстраиваться из ДНК, существовать автономно от хромо­сом в виде небольших кольцевых молекул, а затем встраивать­ся в те же самые или в другие места хромосомной ДНК, меняя тем самым свою локализацию. Такие повторы относятся к числу мобильных элементов генома. Интересно, что способность к пере­мещению некоторых конкретных типов мобильных элементов ино­гда подчеркивается в их названиях, которые в переводе с англий­ского звучат как "бродяга" или "цыган". На концах мобильных элементов имеются определенные структурные особенности, обес­печивающие им возможность включаться в структуру ДНК. Кро­ме того, часто в самих этих элементах имеется генетическая ин­формация о ферменте, катализирующем процесс встраивания. Подобные элементы иногда называют мобильными диспергиро­ванными (дисперсно разбросанными по геному) генами - МДГ. К мобильным элементам можно отнести и последовательности некоторых вирусов, которые иногда могут встраиваться в моле­кулы ДНК человека и очень длительно присутствовать там в таком скрытом (литическом) виде. Общая площадь, занимае­мая в геноме человека мобильными элементами, превосходит суммарную площадь генов.

В связи с обнаружением в геноме человека и других видов живых существ большого количества последовательностей, спо­собных менять свою локализацию, было развито целое направле­ние в генетике, получившее название мобильная генетика. В со­ответствии с классическими представлениями все элементы генома имеют постоянную локализацию. Оказалось, что это по­ложение справедливо только в отношении так называемых структурных элементов, куда включаются и гены. Стабильное расположение генов на хромосомах позволяет строить цитогенетические карты, то есть располагать гены относительно цитоло­гически видимых маркеров хромосом. Но наряду с такими обя­зательными или, как говорят, облигатными элементами генома в молекулах ДНК человека имеется большое число факультатив­ных элементов, присутствие которых не является строго обяза­тельным, а их отсутствие не приводит к каким-то заболеваниям. Роль таких факультативных элементов особенно важна в эволю­ционных процессах, о чем мы будем говорить позднее.

Наряду с генами и повторяющимися последовательностя­ми в геноме человека присутствует очень много уникальных последовательностей, не связанных с кодирующими функция­ми. Среди них можно выделить класс псевдогенов, таких по­следовательностей, которые хотя и близки по своему нуклеотидному составу к определенным генам, но отличаются от них присутствием множества мутаций, не позволяющих им служить инструкциями для производства белков - в нашей аналогии это испорченные чертежи. Происхождение и назначение большин­ства уникальных некодирующих последовательностей совсем непонятно. Также непонятна роль интронов - протяженных некодирующих участков генов, которые переписываются в мо­лекулы преРНК на начальном этапе работы генов, а затем вы­резаются из этих молекул в процессе образования мРНК.

В связи с обнаружением в геноме человека большого количе­ства "избыточных" последовательностей, не связанных непосред­ственно с кодирующими, регуляторными, структурными или ины­ми функциями ДНК. Было высказано предположение, что эти последовательности являются "эгоистическими". В процессе эволюции они каким-то образом внедрились в геном человека и сосу­ществуют вместе с нами, не выполняя никаких функций. То есть, своеобразные геномные паразиты. Это предположение кажется вероятным только в отношении очень ограниченного числа последователь­ностей. Не исключено, что в настоящий момент исследователи еще не пони­мают истинного назначения и функций "эгоистических" ДНК и в последую­щем их роль станет более очевидной.

Наряду с существованием в геноме человека большого коли­чества компактной упаковки информации в облас­тях локализации генов. Во-первых, внутри интронных областей одних генов могут располагаться другие гены, прочитывающие­ся в противоположном направлении. Во-вторых, наряду с общим регулятором работы гена (пультом управления) в его интрон­ных областях могут присутствовать дополнительные промото­ры, каждый из которых способен запускать синтез преРНК с разных начальных точек. При этом с одного и того же гена могут образовываться белки разной длины, имеющие между собой сходство по конечным участкам, но различающиеся по началь­ным последовательностям. И, наконец, очень широко распрост­ранено явление альтернативного перехода от преРНК к мРНК, в процессе которого могут по-разному вырезаться последователь­ности, соответствующие интронам и экзонам. В результате об­разуются разные мРНК, отличающиеся друг от друга по набору экзонов. Последние два процесса носят ярко выраженный тканеспецифический характер. То есть в разных тканях один и тот же ген может по-разному прочитываться. В результате образу­ются тканеспецифические изоформы белков, хотя и имеющие между собой определенную гомологию, но значительно разли­чающиеся как по своей структуре, так и по исполняемым функ­циям. Таким образом, в одном и том же гене могут содержаться инструкции о структуре нескольких, а иногда даже нескольких десятков различных белков. Важным моментом является также то обстоятельство, что белки после синтеза могут подвергаться различным модификациям, существенно влияющим на их функ­ции. Все это вместе приводит к значительному разрыву между общим количеством генов и белков человека, и разнообразие белков может быть на порядок больше разнообразия генов.

Не так, как хромосомный геном, устроен геном митохондрий. Мы уже упоминали о том, что около 5% ДНК человека находит­ся в митохондриях - органеллах, ответственных за энергоснаб­жение клетки. Более 15 лет тому назад была расшифрована нуклеотидная последовательность этой молекулы. Оказалось, что митохондриальная ДНК состоит почти целиком из генов и регуляторных элементов. В ней нет повторяющихся и уникальных некодирующих последовательностей, так обильно представлен­ных в хромосомной ДНК человека. Кроме того, гены митохонд­рий не содержат интронов. Подобным образом устроен геном бактерий. И это сходство позволяет предполагать бактериаль­ное происхождение митохондрий. Конечно, митохондрии не су­ществуют сейчас в виде отдельных организмов и их ДНК полно­стью относится к элементам генома человека. Но к подобным же элементам относят ДНК некоторых вирусных и бактериальных сожителей клеток человека (цитосимбионтов), так как они мо­гут играть определенную роль в функционировании генома че­ловека. Конечно, это факультативные элементы, так как присут­ствие подобных микроорганизмов в клетках человека не является строго обязательным.

Возвращаясь к нашим аналогиям, геном можно представить себе как общий план развития организма. Причем этот план со­стоит не только из набора чертежей или генов, но и включает в себя систему обеспечения существования генов, их избиратель­ной координированной работы, копирования, перемещения из клетки в клетку и из одного организма в другой. Поэтому не­удивительно, что гены занимают относительно мало места в молекулах ДНК. Система обеспечения их жизнедеятельности должна быть более объемной, более громоздкой по сравнению с размерами самих генов. В частности, эта система должна вклю­чать повторяющиеся блоки, предназначенные для выполнения однотипных манипуляций с разными генами. И не исключе­но, что такими блоками являются некоторые виды повторяю­щихся последовательностей ДНК и регуляторных элементов.

Очевидно, что человек в определенном смысле является про­изводным своего генома. Но если это так, возникает вопрос, геном является частью человека или каждый из нас служит вре­менной формой для существования и размножения генома?

Кодирующие области ДНК составляют не бо­лее 3% генома. В генах может одновременно содержаться ин­формация о структуре нескольких белков. 35-50% генома занято повторяющимися последовательностями ДНК, выполняющими как структурные, так и регуляторные функции. Функциональ­ное назначение большей части генома остается неясным.

⇐ Предыдущая234567891011Следующая ⇒

Поделиться: