Физиологии и биохимии клетки

Основным прибором для непосредственного наблюдения клетки является микроскоп. Микроскоп – оптический прибор для получения сильно увеличенного изображения объекта и его структур, созданного отраженным светом.

Оптический микроскоп при использовании белого света позволяет наблюдать структуры, размером примерно 0,25 мкм, при использовании ультрафиолетовых лучей – 0,1 мкм, а инфракрасных – 0,4 мкм. Напомним, что размеры клетки животных колеблются, как правило, в пределах 3-30 мкм.

Микроскоп, в котором источником света служит пучок электронов, называют электронным. В электроном микроскопе изображение формируется в результате рассеяния электронов. Его разрешающая способность высока, она позволяет наблюдать частицы размером 0,001 мкм. Клетки и их компоненты прозрачны, поэтому для получения изображения образцы окрашивают или используют специальные методы повышения контрастности изображения (флуоресцентный, поляризационный и другие). С помощью оптического микроскопа наблюдают органеллы живых клеток (например, митохондрии), ядрышки и хромосомы клеточного ядра, ориентацию молекул в структурах клетки и так далее. Электронный микроскоп дает возможность непосредственно изучать биологические ультраструктуры.

Еще более тонким методом изучения строения клетки является рентгеноструктурный анализ, основанный на дифракции (“огибании препятствий”) рентгеновских лучей. По этому методу на исследуемый образец направляют пучок рентгеновских лучей и на фотопленке, помещенной за объектом, регистрируют полученную дифракционную картину. Этот метод дает возможность не только определять пространственное расположение молекул, но и точно измерять расстояние между ними и даже выявлять их внутримолекулярную организацию.

Широкое применение при изучении структуры клетки получили и спектроскопические методы – абсорбционная и флуоресцентная спектроскопия, дисперсия оптического вращения и круговой дихроизм, ядерный магнитный резонанс.

Абсорбционная спектроскопия основана на измерении степени поглощения света молекулами, которая зависит от их структуры и окружения. С помощью этого метода можно проводить измерение концентрации растворенных веществ, исследование химических реакций, идентификацию веществ. Измерение поглощения осуществляют с помощью спектрофотометра.

Для ряда молекул поглощение света сопровождается испусканием (флуоресценцией) света с большей длиной волны (то есть меньшей энергией). Спектры испускания также зависят от окружения молекул, поэтому регистрация и измерение таких спектров дает информацию о свойствах макромолекул и их взаимодействиях с другими молекулами. Прибор для измерения флуоресценции называют спектрофлуориметр и с помощью такого прибора изучают строение и структурные особенности белков и нуклеиновых кислот, определяют вязкость внутри живых клеток, проводят количественное определение ДНК и так далее.

Дисперсия оптического вращения и круговой дихроизм – методы, основанные на изучении взаимодействия оптически активных молекул с поляризованным светом. С помощью этих методов можно изучать структуру и пространственные изменения в ферментах, нуклеиновых кислотах и других биомолекулах, содержащих оптически активные центры.

Ядерный магнитный резонанс (ЯМР) – еще один спектроскопический метод, способный давать информацию о структуре веществ, взаимодействиях между молекулами и о молекулярном движении, в частности в белках и нуклеиновых кислотах. Ампулу с образцом помещают в магнитное поле и регистрируют резонансную частоту перехода атомных ядер и ее смещение, обусловленное окружением. Полученный спектр сравнивают с рассчитанным и с данными других методов исследований, и делают соответствующие выводы. Интерпретация результатов ЯМР-спектроскопии, в особенности применительно к молекулам большого размера, очень трудоемкая и непростая задача, которая под силу только специалистам – профессионалам в этой области.

Еще одним методом изучения клетки или ее части является авторадиография. Этот метод основан на поглощении радиоактивного изотопа клеткой и выявлении его внутриклеточной локализации. Полученные этим методом изображения изучают под микроскопом. Таким способом можно, например, подсчитывать число молекул ДНК, изучать влияние различных факторов на метаболизм клетки и так далее.

Очень важно отметить, что изучение структурной и химической организации клеток можно проводить только на специально подготовленных образцах. Для этого применяют целый ряд методов. Перед тем, как кратко охарактеризовать основные из них, следует выделить два основных пути исследования клеток. Первый – это наблюдение клеток в организме или в свежевыделенной из организма ткани, а второй – наблюдение клеток, убитых с помощью специальных методов, сохраняющих их морфологическую и химическую структуру. Такие специальные методы называют фиксацией.

К методам исследования живых клеток относятся культура ткани и микрургия.

Культура ткани позволяет наблюдать клетку в наиболее благоприятных условиях. Этот метод заключается в том, что мелкие кусочки тканей помещают в среду, в которой клетки способны к автономному росту и, поддерживая температуру, свойственную организму, наблюдают их развитие и рост. Таким способом изучают пищевые потребности клетки, влияние на них различных экспериментальных условий, а также получают чистые клеточные линии.

Микрургия заключается в том, что внутрь клетки вводят какой-либо микроинструмент (микропипетка, микроигла, микроэлектрод и другие), движения которого в поле зрения микроскопа регулируются специальным приспособлением. Таким методом можно рассекать клетки и извлекать некоторые их части, вводить в клетку различные вещества, измерять ее электрическую активность или пересаживать отдельные органеллы из одной клетки в другую.

Фиксация представляет собой такой способ умерщвления клетки, который обеспечивает сохранение ее прижизненной структуры и в известной степени химического состава. Фиксацию проводят специальными реагентами (например, смесь абсолютного спирта и ледяной уксусной кислоты), путем быстрого замораживания и последующего обезвоживания в вакууме (лиофилизация) и другими методами. Подготовленные образцы окрашивают, делают необходимые срезы и исследуют с помощью указанных выше методов и приборов.

 

⇐ Предыдущая78910111213141516Следующая ⇒

Поделиться: