Тестирование: Понимание лаборатории перспективы.

 

Downloaded from http://cid.oxfordjournals.org/ by guest on January 17, 2017

 

 

Цитомегаловирус (ЦМВ) является важной причиной заболеваемости и смертности у пациентов после трансплантации, и как правило, контролируется с помощью лабораторных Развитая количественных молекулярных анализов. Клиницисты, которые используют количественные Анализ ДНК ЦМВ должны быть осведомлены о ряде аспектов тестирования, которая поможет в принятии решений при

управление ЦМВ инфекции у своих пациентов. К ним относятся: (1) тип образца использовали (цельной крови или плазмы), (2) Предел обнаружения и предел количественного определения выбранной клинической лаборатории, (3) линейный диапазон Анализ, (4) воспроизводимость анализа в учреждении, и (5) широкая изменчивость вирусной нагрузки значения среди различных анализов. Биологические свойства ЦМВ, в том числе его изменчивости в пределах воинства и

период его полураспада, также являются важными факторами в клинических испытаниях для этого вируса.

ЦМВ тестирование вирусной нагрузки обычно используется, чтобы определить, когда начинать упреждающий терапии, диагностики активной формы заболевания, а также контролировать Ответ на терапию. Молекулярные анализы, которые используют

в режиме реального времени амплификации и детекции более широко

доступными и привлекательными из-за их широкой линейной

диапазон, низкие пределы обнаружения и количественной оценки, а также

снижение риска заражения, так как и амплификации

и процессы обнаружения происходят одновременно

в замкнутой системе.

Тем не менее, тестирование вирусной нагрузки ЦМВ

не так просто, и врачи, которые интерпретируют тест

Результаты для принятия клинических решений должны понимать,

эти ограничения.

Там на данный момент нет пищевых продуктов и медикаментов США

(FDA) Обсуждения лабораторные тесты для Количественное определение ДНК ЦМВ. Поэтому, ЦМВ вирусные Тесты нагрузки считаются лабораторные тесты разработаны

(LDTS), которые разработаны и проверены физическим лицом лаборатория стандарту laboratoryinspecting агентства [1]. Эта аналитическая проверка устанавливает индивидуальные особенности испытаний и в частности, определяет нижний и верхний пределы

Количественное (ПКО), точность, точность и линейный Диапазон испытания. Клиницисты используют результаты испытаний, чтобы помочь они понимают (1) вероятность того, что симптоматическое пациент имеет активное заболевание ЦМВ, (2) вероятность того,

что бессимптомное пациент будет развивать активное заболевание, (3) реакцию пациента на терапию, (4) риск рецидивов инфекции, и / или (5) в соответствующее время прекратить терапию. Без стандартизированного теста через лабораторий, каждая лаборатория, вместе со своими лечащими врачами, должны установить вирусные значения отсечки нагрузки, которые считаются значительными или, что коррелирует с заболеванием среди местного населения.

Эти значения обрезания будут варьироваться между учреждениями не только потому что нет никакой стандартизации для сравнения вирусной нагрузки значения, но и потому, что технические характеристики различные LDTS различаются.

          Соглашение вирусных значений нагрузки Многоцентровое исследование, проведенное с целью оценки изменчивости ЦМВ вирусной нагрузки через 33 лабораторий в Соединенных Штаты, Европа и Канада [2] показал, что изменчивость вирусные значения нагрузки для отдельных образцов колебалась от 2,0 log10 копий / мл до 4,3 log10 копий / мл.

Например, ДНК ЦМВ стоимость 100 000 копий / мл в лаборатории может быть сообщено

в количестве 100 копий / мл (3 log10 разницы) с различным LDT в другая лаборатория. Эти данные подтверждают тот факт, что врачи не могут сравнивать результаты испытаний от 2 лабораторий

не может клинически значимых отсечек разработаны с использованием 1 тест будет применяется к результатам из другого теста, если 2 испытания не имеют были тщательно сопоставлены и отношения между они хорошо понимают. Э то требует определения корреляции Между тестами, запустив значительное количество клинические образцы (40-50 экземпляров распределены по всему линейный диапазон теста) в обоих LDTS и развития математическое преобразование.

В ноябре 2010 года международный стандарт для ЦМВ состоит из стандартизированного количества ЦМВ был разработан и одобрен Всемирной организацией здравоохранения. Этот международный стандарт позволит лабораториям и производителям для оценки точности вирусных значений нагрузки и к откалибровать различные LTD-. После завершения этого процесса, которая находится на ранних стадиях, приведет к улучшению в согласование вирусной нагрузки значения между лабораториями при Результаты представлены в виде международных единиц (МЕ) на миллилитр а не в виде копий на миллилитр (как это делается для гепатита С

вирус). Лаборатории должны обеспечить клиницистов с преобразование между копий на миллилитр и МЕ на миллилитр и может выбрать, чтобы сообщить оба значения на начальном этапе, который будет позволяют врачам '' откалибровать '' свои собственные интерпретации

результаты испытаний в их клинических решений. Хотя наличие международного стандарта

улучшить межлабораторной результат соглашения теста, другой тест характеристики влияют на результаты таким образом, что образцы выполняются в

разные лаборатории могут по-прежнему имеют различные вирусные значения нагрузки.

Методы испытаний отличаются следующими способами: (1) нуклеиновую

кислотные методы экстракции, (2) выбор праймеров и

зонды, предназначенные для разных генов с переменным усилением

эффективности, и (3) химия испытания и измерительные приборы.

Основываясь на опыте работы с вирусом иммунодефицита человека. тип 1 тестирование РНК (ВИЧ-1), доступность и широкое распространение

Использование FDA утвержденных тестов будет способствовать дальнейшему улучшению межлабораторное

соглашение. В конечном счете, эти шаги в направлении стандартизации

позволит развитие значимого многоцентровое

клинические исследования для выявления вирусных значений нагрузки, которые предсказывают активный

заболевание, риск рецидива, и соответствующая продолжительность терапии.

Изменения в обеих группах пациентов и иммуносупрессивных

схемы лечения могут влиять на эти отсечек; то есть рекомендации

могут отличаться среди твердых и трансплантации стволовых клеток

получатели, получатели различных типов твердых трансплантации органов,

ВИЧ-инфицированных пациентов, а также тех, с другими расстройствами

в том числе иммуноопосредованную болезни и злокачественные новообразования.

Аналитические характеристики Производительность

В дополнение к проблемам, описанным выше, фактического выполнения теста

полагается на преаналитических (сбор образцов, транспортировка,

обработка), аналитические (тестирование), и postanalytical (отчетность,

интерпретация результатов) характеристик.

Количественное тестирование ЦМВ, как правило, проводили на цельной крови или плазме. Каждый тип образца имеет свои достоинства и недостатки. ДНК ЦМВ обнаруживается более

часто и вирусные значения нагрузки часто выше в целом в крови по сравнению с плазмой, поскольку оба бесклеточной и внутриклеточных Вирусы обнаружены в первом. Недавнее исследование показали, что вирусные значения нагрузки у большинства пациентов около 1

log10 (в 10 раз) выше, в цельной крови, по сравнению с плазмой [4]. Тем не менее, у некоторых пациентов разница была столь велика, как 2 log10 копий / мл (100-кратный), а иногда и плазменные вирусные была найдена нагрузка выше, чем цельной крови вирусной нагрузки [4].

Поскольку скрытая ДНК сохраняется в клеточной фракции крови, обнаружение ЦМВ в плазме, как полагают, более вероятно, отражают активную инфекцию [5]. Использование плазмы вместо

цельной крови в этих тестах требует быстрого разделения, чтобы сохранить ДНК от деградации с вытекающим фрагментации [6]. Недавнее исследование показало, что когда-то плазма отделяется от цельной крови, ДНК в плазме стабилен в течение 14 дней при температуре 4 ° С [7].

Клиницисты должны ознакомиться с сильными и ограничения тестирования различных типов образцов и использования один тип образца для наблюдения за пациентами в продольном направлении

 

4. Lisboa LF, Asberg A, Kumar D, et al. The clinical utility of whole

blood versus plasma cytomegalovirus viral load assays for monitoring

therapeutic response. Transplantation 2011; 91:231–6.

5. Richman DD, Whitley RJ, Hayden FG. Clinical virology. 3rd ed.

Washington, DC: ASM Press, 2009.

6. Razonable RR, Brown RA, Wilson J, et al. The clinical use of various

blood compartments for cytomegalovirus (CMV) DNA quantitation in

transplant recipients with CMV disease. Transplantation 2002; 73:

968–73.

 

После консультаций с врачами, было принято решение, чтобы значения отчета 100-300 копий / мл, как '' низких положительных результатов '', в то время как эти .300 копий / мл представлены в виде целого числа.

Хотя очень чувствительные молекулярные тесты часто играют важную роль для обнаружения возбудителей инфекционных заболеваний, это не может иметь место для тестов ДНК ЦМВ. Клиническая значимость низкие уровни ДНК ЦМВ (, 100-500 копий / мл) может быть трудно интерпретировать, особенно если образцы цельной крови испытания, потому что низкие уровни ДНК ЦМВ в цельной крови или лазма не всегда коррелируют с развитием болезнь. Некоторые исследования были проведены для определения Порог для лечения, в том числе естественной истории изучения ЦМВ у реципиентов после трансплантации печени [9]. Используя тест COBAS Amplicor Monitor (Roche Molecular Diagnostics), авторы показали, что значение вирусной нагрузки

2000-5000 копий / мл коррелируют с развитием конец органов болезни. Это значение отсечки зависит испытания и может быть выше или ниже для других LDTS. Исследования также

Показано, что как вирусная величина нагрузки и скорость изменения в вирусная нагрузка являются важными предикторами развития активное заболевание [10]. Чем быстрее скорость увеличения вирусной нагрузки значение, тем больше риск развития болезни ЦМВ. однажды

Тесты калибровать с международным стандартом, универсальный клинически значимых LOD и ниже ПКО могут быть идентифицированы.

На основании имеющихся в настоящее время данных и опыт, 250- 500 МЕ / мл может быть подходящим УД и / или нижний предел обнаружения. Учитывая, что большинство LDTS используют в режиме реального времени полимеразной цепной реакции технологии, линейный спектр тестов вирусной нагрузкой ЦМВ как правило, по меньшей мере, 6 log10; Например, тест может обнаружить из 2,0 log10 копий / мл (100 копий / мл) до 7,0 log10 копий / мл (10 миллионов копий / мл). Обзор ЦМВ вирусной нагрузки осуществляется в 2009 году на Эмори Медицинские лаборатории показали, что из примерно 8500 тестов вирусной нагрузки ДНК CMV проводили на образцах плазмы, 671 (7,9%) были положительными. Из них 394 (58,7%) было, 1000 копий / мл, 169 (25,2%) были между 1000 и 10 000 копий / мл, и 63 (9,4%) были от 10 000 до 100 000 копий / мл. Кроме того, 45 (6,7%) имели ДНК CMV вирусная нагрузка .100 000 копий / мл. Несмотря на то что низкие значения определение вирусной нагрузки являются общими, их клиническое значение не понятно. Очень высокие значения вирусной нагрузки являются редкостью, и, когда

они происходят, как правило, рассматривается у пациентов с иммуносупрессией с первичной ЦМВ-инфекции или у пациентов с очень тяжелой болезнь. Поскольку вирусные значения нагрузки выше, чем 10 миллионов человек, может быть присутствует у некоторых индивидуумов, верхний предел количественного определения теста должен быть в этом диапазоне.

Интерпретация важных различий в продольном вирусные значения нагрузки у каждого пациента требуется понимание точности или воспроизводимости теста. Как правило, изменчивость вирусной нагрузки является наибольшей вблизи нижний и верхний предел и самый низкий в среднем диапазоне из Анализ. В результате, небольшие изменения в низких значениях вирусной нагрузки являются незначительный; например, нет четкой разницы не существует между Результаты у пациентов, в которых значение вирусная нагрузка увеличилась с 200 копий / мл до 500 копий / мл, так как это Разница заключается в вариабельности анализа. Большинство полезные данные о клинически значимых изменений в вирусной значения нагрузки происходят из опыта с ВИЧ-1. Для этих FDA утвержденных тестов, изменчивость теста составляет от 0,1 log10 копий / мл до 0,2 log10 копий / мл, по сравнению с биологическая изменчивость наблюдается у хронически инфицированных Необработанные лиц, что составляет около 0,3 log10 копий / мл. Поэтому изменения в вирусной нагрузке log10 копий погрешность ± 0,5 / мл полагают, п едставляют биологически важные изменения в вирусной репликации. Хотя 0,5-log10 копий / мл значение было широко применяется для использования со многими другими вирусных патогенов, то не может быть точным для ЦМВ. Поскольку биологической вариации ЦМВ не известно, важные изменения в вирусной нагрузки ценности исторически были оценены только на основе теста изменчивость.

Дальнейшая работа с ВИЧ-1 показали, что УР тест должен был быть # 0,15 log10 копий / мл различить 5 раз изменения вирусных значений нагрузки [11]. ЦМВ LDTS изменчивость из анализа, как ожидается, будет не лучше, чем то, что рассматривается для FDA утвержденных ВИЧ-1 вирусной нагрузки, и это вполне может быть выше, особенно вблизи нижнего LOQ [12].                          Поэтому, при обнаружении значений уровня вирусной нагрузки ЦМВ из , 1000 копий / мл, изменения, 5 раза (0,7 log10) редко отражают клинически важные изменения в репликации вируса. Для Значения .1000 копий / мл, 3 раза (0,5 log 10) изменения в вирусной Нагрузка может быть значительным, хотя это может отличаться среди LDTS. Некоторые центры сообщают о вирусной нагрузки в виде копий / мл и как log10 копий / мл, поскольку врачи могут быть менее склонны overinterpret небольшие изменения вирусных значений нагрузки при экспрессии

в качестве log10 значений.

 

Базовый образец для вирусной нагрузки должны быть собраны в день инициируется лечение ЦМВ, даже если ЦМВ вирусный нагрузочное тестирование было проведено на несколько дней раньше. Быстрый рост в ЦМВ вирусной нагрузки может происходить в течение нескольких дней в у пациентов с необработанной заболевания, что делает его важно иметь вирусная значение нагрузки ЦМВ во время лечения. Если вирусная значения нагрузки превышает верхний LOQ, рекомендуется лаборатория разбавить образец, чтобы определить фактическое

вирусное значение нагрузки.

 После начала терапии, идеальный интервал для мониторинга еженедельно поскольку период полураспада ДНК ЦМВ в плазме составляет 3-8 дней [13]. Еще одна причина для использования этого Интервал является то, что он не является редкостью для вирусной ДНК CMV

нагрузки для повышения у пациента через несколько дней после начала терапии, и это может быть неверно истолкованы как неудачи лечения. Поскольку у пациентов с персистирующей ДНК в плазме или цельной кровь подвергаются повышенному риску рецидива [4, 13, 15-17], ток

руководящие принципы [14, 15] рекомендуют продолжая противовирусную терапию пока вирусные значения нагрузки не невозможно обнаружить. У некоторых пациентов постоянно низкие уровни ДНК ЦМВ в плазме или цельной крови и никогда не развивается болезнь CMV или рецидив. В этих людях, это более полезно следовать тенденции вирусной нагрузки

значения с течением времени, чем для оценки значимости того или иного вирусное значение нагрузки. Вирусные модели нагрузки, которые являются радужными лекарственной устойчивостью вируса, включают те, которые не уменьшаются после 2 недели адекватной терапии [14, 18], те, с плато скорость снижения вирусной нагрузки, а также те, которые имеют начальное падение, а затем последующее увеличение вирусной нагрузки в то время как на

терапия. Эти пациенты должны быть оценены на устойчивые Вирус секвенированием UL97 и / или UL54 (полимеразная) гены непосредственно из плазмы образца.

Тесты вирусной нагрузки ДНК CMV сконструированы таким образом, что они не делают перекрестно реагируют с другими вирусами герпеса. В иммунодефицитного Пациент, обнаружение 2-герпесвирусов, например, ЦМВ и вирус Эпштейна-Барр, отражает реактивации как вирусы и не из-за перекрестной реактивности.

 

Клиническая интерпретация

Тестирование вирусной нагрузки ДНК CMV является важным вспомогательным средством для оценки

риск заболевания, диагностики заболеваний и мониторинга ответа

к терапии. Интерпретация значений вирусной нагрузки ДНК CMV

может быть сложным, а также многочисленные вирусные и принимающие факторы должны

следует учитывать при оценке риска заболевания ЦМВ.

понимание эксплуатационных характеристик вируса

Испытательная нагрузка необходима для соответствующей интерпретации теста

 

Результаты. Ниже приведены некоторые клинические жемчуг относительно интерпретации

тестирования вирусной нагрузки ЦМВ:

 

1. Значения вирусной нагрузки ЦМВ не сопоставимы между LDTS;

при мониторинге пациентов, использовать один тестовый и тип образца

(Либо цельную кровь или плазма).

2. Наличие международного стандарта

улучшить соглашение между тестами и должны предусматривать

многоцентровых исследований, чтобы определить важные клинические отсечек

что предсказать риск развития болезни ЦМВ и / или

рецидивом заболевания. До принятия клинического среза от

другая лаборатория, крайне важно, чтобы в полной мере понять

Взаимосвязь вирусных значений нагрузки между 2-х лабораторий.

3. Если LOD и ниже ПКО для теста на вирусную нагрузку не согласны,

обсудить, как сообщают значения, которые больше, чем LOD и

меньше, чем нижний LOQ с вашей лаборатории.

4. Поймите, точность теста вирусной нагрузки, используемой в

Ваша лаборатория, в частности, на или вблизи нижней LOQ. тесты

имеют больше изменчивость вблизи нижней LOQ. Предположим, что

Изменение вирусной нагрузки должна превышать 3 раза (для значений в

СЧ-теста) до 5-кратного (для значений в нижнем диапазоне

теста), чтобы представить значимые изменения в вирусной

репликации.

5. Низкие значения определение вирусной нагрузки являются общими и их клиническое

Значение может быть трудно оценить. Факторы, которые необходимо рассмотреть

Интерпретируя эти результаты включают в себя тип образца, тип

трансплантата, степень подавления иммунитета, и донора /

Получатель CMV иммунного статуса, а также LOD и

Точность теста.

6. При мониторинге пациентов после трансплантации, тенденции

вирусная нагрузка может быть более полезным, чем любая другая вирусная нагрузка

значение, если вирусная нагрузка не очень высока (.10 000 копий / мл)

или пациент находится на очень высоком риске (например, донор / получателя

несоответствие). И скорость изменения вирусной нагрузки и тому

абсолютный уровень вирусной нагрузки играют важную роль в прогнозировании риска

развития болезни.

7. После того, как решение принято, чтобы начать лечение, вирусные

нагрузочное тестирование следует проводить на следующий день терапия началась,

даже если последнее значение доступно, так как вирусные уровни нагрузки

может быстро увеличиваться у пациентов с активным заболеванием.

точная начиная вирусная нагрузка имеет решающее значение при мониторинге

Ответ на терапию.

8. Последующие испытания вирусная нагрузка должна быть выполнена в

5- до 7-дневным интервалом потому, что период полураспада ДНК ЦМВ в

плазма находится в диапазоне от 3 до 8 дней [13]. Избегайте получения вирусного

значения нагрузки чаще, особенно после того, как очень рано

начало терапии, так как вирусные значения нагрузки могут увеличить

и быть неверно истолкованы как неудачи лечения. После начала

терапия, вирусная нагрузка, следует использовать для документирования

клиренс ЦМВ из плазмы или цельной крови.

В зависимости от исходной вирусной нагрузки, это может занять несколько недель или

дольше. Упорно повышенные CMV значения вирусной нагрузки или вирусной

значения нагрузки, которые увеличивают после первоначального спада являются

в связи с этим для устойчивого вируса [18]. Генотипическая сопротивление

тестирование может быть выполнено непосредственно с использованием образцов плазмы

когда вирусные нагрузки в МОО

 

 

⇐ Предыдущая12345678910Следующая ⇒

Поделиться: