Общее представление об эпигенетике

Эпигенетика (др.-греч. ἐπι- — приставка, обозначающая пребывание на чём-либо или помещение на что-либо) — в биологии, в частности в генетике — представляет собой изучение закономерностей эпигенетического наследования — изменения экспрессии генов или фенотипа клетки, вызванных механизмами, не затрагивающими последовательности ДНК. Эпигенетические изменения сохраняются в ряде митотических делений соматических клеток, а также могут передаваться следующим поколениям. Примерами эпигенетических изменений являются метилирование ДНК и деацетилирование гистонов.

 

В рамках эпигенетики исследуются такие процессы как: парамутация, генетический букмаркинг, геномный импринтинг, инактивация X-хромосомы, эффект положения, материнские эффекты, репрограммирование, а также другие механизмы регуляции экспрессии генов. В 2011 году было показано, что метилирование мРНК также играет роль в предрасположенности к диабету, что дало начало новой отрасли — РНК-эпигенетике[1].

Эпигенетическое наследование

В более общем смысле, предметом эпигенетики являются явления, связанные с развитием различных фенотипов клеток или организмов на основе одного генотипа.

В более узком смысле эпигенетика – раздел генетики, который изучает наследуемые изменения активности генов во время развития организма или деления клеток.

Эпигенетическое наследование – наследование паттерна экспрессии генов.

Генетические

• Как правило необратимые (мутации)

• Изменения первичной структуры ДНК

• Стабильно наследуемые

Эпигенетические

• Как правило обратимые

• Не затрагивают изменений первичной структуры ДНК

• Бывают долговременные и кратковременные

      Множество взаимосвязанных механизмов

Метилирование ДНК и его выявление

Метилирование ДНК

После завершения репликации происходит метилирование нуклеотидных остатков вновь образованных цепей ДНК. Метальные группы присоединяются ко всем остаткам аденина в последовательности - GATC -. Количество метилированных оснований равно примерно 1-8%. Модификация происходит при участии ферментов, использующих в качестве источника метальных групп S-аденозилметионин (SAM). Присоединение метальных групп к остаткам аденина и цитозина не нарушает комплементарности цепей (рис. 4-18).

 

Наличие метальных групп в цепях ДНК необходимо для формирования структуры хромосом, а также для регуляции транскрипции генов.

Рис. 4-18. Метилирование остатков аденина в последовательности - GATC -. В течение нескольких минут после репликации, пока не произошло метилирование, новая цепь ДНК отличается от матричной цепи.

Метилирование ( methylation) - это химическая модификация, катализируемая ферментом, реакция добавления метильных группп (CH3) на специфические сайты белков, ДНК и РНК.

Одна из форм метилирования, наиболее распространенная у млекопитающих, представляет собой превращение цитозина в 5-метилцитозин в последовательности CpG . Метилирование может предотвращать расщепление ДНК в сайте узнавания рестрикционного фермента . Например, рестриктаза Hpall расщепляет CCGG , но не Cm5CGG .

Реакция ДНК-метилирования катализируется ферментом ДНК-метилтрансферазой, который осуществляет перенос метильной группы с S-аденозилметионина на цитозин, стоящий перед гуанином. У человека и большинства млекопитающих ДНК-метилирование - естественная модификация ДНК, и воздействует только на основание цитозин (С), стоящий перед гуанином (G), т.е. метилирование происходит только в CpG-динуклеотидах.

У растений 5-метилцитозин можно обнаружить в динуклеотидах CG и тринуклеотидах CNG (Т-С, A или Т).

70-80% всех CpG-динуклеотидов в человеческом геноме метилированы. Однако в нормальной ткани метилирование происходит, прежде всего, в областях, где плотность CpG динуклеотидов низка, и большинство CpG - островков в норме полностью неметилированы. Но есть исключения из этого правила: метилированные промоторные области генов на инактивированной Х хромосоме, например, ген FMR1 (Li et al 1993 , Singer-Sam et al. 1993 ) и импринтированные гены. Так экспрессия таких генов как IGF2 , SNRPN , Znf-21 , Par-5 идет только с отцовской хромосомы, а WT1 , Mash2 , p57 - только с материнской.

Также профиль метилирования может меняться в течение жизни организма. Некоторые гены, экспрессирующиеся в эмбриональном периоде, перестают функционировать к моменту рождения особи. А для таких генов как ген E-CAD и ген DBCCR1 показано метилирование в нормальных тканях по мере старения организма.

Функция ДНК метилирования до сих пор не полностью ясна. За последние годы было предложено несколько версий роли ДНК метилирования: контроль экспрессии гена, контроль целостности хромосомы, контроль пререкомбинантных событий. Гипотезой о роли ДНК-метилирования в геноме является предположение о том, что это защитный механизм против встраивания в геном "паразитных" последовательностей типа ретровирусных элементов ( Issa, 1994 ). К структурам, обеспечивающим этот процесс, относятся: несколько ДНК-метилтансфераз, деметилазы, центры метилирования, которые инициируют метилирование, и вероятно, связаны с необычными третичными структурами ДНК. Эмбрионы мышей, несущие нонсенс мутацию в гене метилтрансферазы, не развиваются дальше 8-го сомита, но при этом наблюдается низкий, но постоянный уровень метилцитозина. Это может говорить о том, что имеются и другие гены, обеспечивающие метилирование.

Метилированные основания в ДНК обнаружены свыше 50 лет назад [ Hotchkiss, ea 1948 ]. ДНК прокариот содержит модифицированные основания N6-метиладенин и 5-метилцитозин , тогда как ДНК высших эукариот - в основном 5-метилцитозин [ Wyatt, ea 1951 , Shapiro, ea 1960 , Doscocil, ea 1965 , Vanyushin, ea 1970 , Vanyushin, ea 1968 ]. Метилирование остатков цитозина ДНК имеет место у бактерий, растений, животных, в том числе млекопитающих (включая человека), но отсутствует у дрожжей, нематод и дрозофилы [ Мазин ea 1984 , Мазин ea 1989 , Doerfler, ea 1983 , Bird, ea 1995 ].(Обнаружено, что в ДНК дрозофилы содержится 5-метилцитозин ( Growher, Н., Leismann. О.,, 2000 )

Метилирование осуществляется ферментативно в первые минуты после репликации ДНК, т.е. пострепликативно. Поскольку нуклеотидная последовательность ДНК при этом не меняется, метилирование по сути своей - событие эпигенетическое [ Baylin, ea 1998 ]. Оно, хотя и является стабильной и наследуемой модификацией, в принципе обратимо под воздействием деметилирующих агентов или ферментов и тем самым принципиально отличается от мутаций ДНК. В общебиологическом плане феномен метилирования является элементом системы распознавания "свой-чужой". Благодаря существующей в бактериях системе метилирования-рекогниции ( рестрикции-модификации ) клетки способны идентифицировать свой генетический материал и отличать его от инородных молекул, проникших в клетку тем или иным способом. Уничтожение последних позволяет поддерживать генетическую стабильность вида. Иногда один фермент имеет две активности - метилазную и эндонуклазную: в большинстве случаев определенный сайт ДНК распознается двумя ферментами, один из которых метилирует его, а другой расщепляет. В целом система функционирует таким образом, что метилазы "метят" специфические последовательности собственной ДНК, а чувствительные к метилированию рестрикционные эндонуклеазы узнают и расщепляют те из последовательностей. которые соответствующей метки не имеют. Так, бактериальная клетка защищает себя от вторжения чужеродных молекул. Например, ДНК проникшего в бактериальную клетку фага расщепляется в определенных сайтах специфическими эндонуклеазами, в то время как те же последовательности в собственной ДНК защищены от расщепления, поскольку метилированы [ Noyer-Weidner, ea 1993 ].

Роль метилирования ДНК как компонента клеточной "иммунной системы", предназначенной для уничтожения чужой или излишней ДНК (или подавления ее функций), сохраняется по-видимому, на протяжении эволюции, но конкретные механизмы реализации этой задачи могут быть существенно иными [ Bestor, ea 1990 ]. Например, клетки Neurospora элиминируют нежелательные повторяющиеся последовательности посредством интенсивного их метилирования, за которым следует накопление точковых мутаций из-за высокой мутабельности остатков 5-метилцитозина [ Selker, ea 1993 ]. Подобным же образом в клетках грызунов и человека интегрированные вирусные последовательности могут подвергаться метилированию и обусловленному им стабильному блоку транскрипции [ Doerfler, ea 1993 ]. Известно также, что инактивации тем же способом нередко подвергаются трансгены у мышей [ Sasaki, ea 1993 ].

В широком эволюционном плане переходы от прокариот к эукариотам и от беспозвоночных к позвоночным сопровождались, по-видимому, резким увеличением числа генов [ Bird, ea 1995]. Эти драматические изменения вызвали к жизни, видимо, и новые способы ограничения нежелательной активности "лишних" генов - формирование ядерной мембраны и нуклеосомную организацию хроматина в первом случае, функциональную переориентацию системы метилирования - во втором. Если у беспозвоночных она сводилась к подавлению активности потенциально опасных последовательностей ДНК (таких как вирусы и транспозоны), то у позвоночных ее назначение - еще и стабильная репрессия эндогенных генов (гены инактивированной хромосомы X, импринтированные гены, часть тканеспецифичных генов). Профиль метилирования, сильно влияющий на функциональное состояние гена, стабильно передается в ряду клеточных поколений. С этой точки зрения, для организмов с большой продолжительностью жизни и интенсивной тканевой регенерацией (позвоночные, растения) надежная система эпигенетической наследственности (типа метилирования ДНК) жизненно необходима. В противоположность этому у маленьких животных и животных с малой продолжительностью жизни, т.е. в ситуациях, когда значительное новообразование клеток отсутствует. такой необходимости нет. Предполагают, что именно этим обстоятельством объясняется отсутствие системы метилирования ДНК у нематод и дрозофилы [ Jablonka. ea 1995 ].

Рестрикционный анализ – классический метод анали- за метилирования, основанный на неспособности некото- рых рестрикционных ферментов разрезать метилированные последовательности ДНК. Пара ферментов HpaII–MspI рас- познает последовательность CCGG, но рестриктаза HpaII не способна разрезать ДНК, в которой метилирован вну- тренний С, что позволяет использовать эти ферменты для быстрого определения метилированных участков. Рестрик- ционный метод имеет несколько недостатков. Главный – не все CG расположены в последовательностях CCGG, что может привести к появлению ложноотрицательных резуль- татов. Для проведения рестрикции и последующего анализа необходимо не менее 0,5–1 мкг ДНК [26]. Полученные после рестрикции фрагменты можно анали- зировать несколькими способами: масс-спектрометрический анализ, саузерн-блотт, лигирование с мечеными нуклеотида- ми, полимеразно-цепная реакция (ПЦР) и др. 1.1. Масс-спектрометрический анализ. Для анализа ме- тилирования ДНК обычно используют специфическую ре стрикцию совместно с MALDI-TOF-масс-спектрометрией или электроспрей-ионизацией. Основным требованием для осуществления масс-спектрометрического анализа являет- ся высокая химическая чистота исследуемого соединения. Особенности анализатора налагают ограничение на раз- мер исследуемых молекул ДНК: средний предел измерений около 30 кДа (100 bp), нижняя граница не менее 600 Да [2]. Масс-спектрометрический анализ не удобен для применения в клинической практике, но в сочетании с рестрикционным анализом, гибридизацией и другими методами лег в основу высокопроизводительных систем для сканирования метили- рования геномной ДНК [16]. 1.2. Полимеразное лигирование с мечеными нуклеотида- ми. Меченые нуклеотиды (радиоактивные 3 H-dCTP/-dGTP, 32P-dCTP/-dGTP или флюоресцентно-меченые dCTP/dGTP) присоединяют по липким концам фрагментов, которые об- разуются после рестрикции (рис. 3). Метод позволяет опре- делить количество 5mC в образце ДНК. Долю метилирован- ного цитозина (в норме 80–90%) рассчитывают по формуле: [MspI] - [HpaII] ––––––––––––– %, [MspI] где [MspI] и [HpaII] – радиоактивность/флюоресценция об- разца после рестрикции соответствующей рестриктазой. 1.3. Саузерн-блотт позволяет определить общий статус метилирования CpG-островков интересующего региона, но требует довольно большого количества (не менее 5 мкг) геномной ДНК и не обладает большой чувствительностью. Количество гибридизованных фрагментов может быть до- вольно высоким. Для CG-богатых последовательностей, где рестрикционные фрагменты имеют длину 100–500 bp, для фореза применяют 1,2% агарозный гель, который до- вольно сложно использовать для блотта [9]. В то же время клеточные линии и особенно ткани поликлональны и содер- жат смешанные паттерны метилирования, поэтому анализ бандов довольно сложен. Тем не менее этот метод гораздо проще и быстрее, чем бисульфитная модификация [17]. 1.4. ПЦР-анализ – более чувствительный метод, позволя- ющий определить статус метилирования определенного ре гиона, сочетает реакцию рестрикции и ПЦР. После рестрикции проводят ПЦР с праймерами, фланкирующими рестрик- ционные сайты, амплификация проис- ходит только в том случае, если ДНК была метилирована и не подверглась разрезанию. Так же как и Саузерн-блотт, этот метод может определить метилиро- вание только в сайтах рестрикции ме- тилчувствительных ферментов. Более того, при полной рестрикции неметили- рованной ДНК ПЦР не происходит, что может привести к ложноположительно- му результату. Неполная рестрикция и присутствие малого количества метили- рованных аллелей дают сходные резуль- таты, и этот метод нельзя использовать для определения, на- пример, гиперметилирования онкосупрессоров, когда клетки с метилированными аллелями составляют лишь небольшую фракцию в популяции [18]. 2. Бисульфитная модификация ДНК. В одноцепочечной ДНК бисульфит натрия преимущественно деаминирует ци- тозин до урацила (и очень медленно деаминирует 5-метил- цитозин в тимин) (Shapiro et al., 1973). В 1992 г. Frommer и др. предложили использовать различие в реакционности би- сульфита для геномного секвенирования 5-метилцитозино- вых остатков. Проводят полную денатурацию геномной ДНК и обработку бисульфитом в условиях, при которых цитозин стехиометрически конвертируется в урацил (рис. 4), но 5-ме- тилцитозин не подвергается изменениям. Результатом би- сульфитной реакции становятся цепи ДНК, которые больше не комплементарны [18, 19]. Бисульфитная конверсия – очень мощный метод, который используют для определения метилирования ДНК не только простым секвенированием, но и в сочетании с ПЦР, SnuPE, MethyLight, олигонуклеотидными микроматрицами, HPLC, пиросеквенированием и др. [10]. 2.1. Бисульфитная ПЦР. При ПЦР-амплификации ре- гиона интереса в бисульфитобработанной ДНК весь ура- цил, ранее бывший цитозином, и тимин амплифицируются и считываются так же, как тимин, а 5-метилцитозин – как цитозин. После бисульфитной ПЦР ДНК можно клониро- вать и секвенировать – процесс длительный и технически довольно сложный. Без клонирования ПЦР-продуктов ме- тод даже менее чувствителен, чем Саузерн-блотт (должно быть метилировано не менее 25% аллелей) [15]. Метод бисульфитной ПЦР используют также в коммер- ческих наборах для определения метилирования. Quantative MethyLight (Epigenomics): детекцию метилированных и не- метилированных участков производят при помощи динуклео- тидов CG и TG, меченных разными флюорофорами (рис. 5, а) [5, 27]. В наборе HeavyMethyl (Epigenomics) специфиче- ский блокатор препятствует амплификации бисульфитмо- дифицированной ДНК, и амплификация происходит только при отсутствии метилирования. Детекция осуществляется по присоединению флюоресцентно-меченого CG рис. 5, б) [27]. 2.2. Метилспецифичная ПЦР (MSP) позволяет опреде- лить статус метилирования интересующей последователь- ности вне зависимости от количества метилированных CpG и не требует клонирования и использования метилчувстви- тельных рестриктаз. После обработки ДНК бисульфитом проводят амплификацию с праймерами, специфичными для метилированных и неметилированных участков ДНК. ПЦР- праймеры в этом случае нужно подобрать таким образом, чтобы они специфически связывались с только бисульфитмо- дифицированной цепью. Праймеры для каждой цепи будут отличаться в той позиции, где были CG оригинальной после- довательности (см. таблицу). Метод требует небольшого количества геномной ДНК. Отличается высокой чувствительностью (0,1% метилирован- ных аллелей), поэтому представляется весьма удобным для анализа клинических образцов [20]. 2.3. Single Nucleotide Primer Extension (SnuPE) – метод, который можно использовать для точного анализа метили- рования в определенной позиции ДНК. После бисульфитной обработки ДНК проводят отжиг праймеров, которые закан- чиваются непосредственно перед анализируемым сайтом. Затем осуществляют две реакции удлинения цепи – с радио- активным dCTP и радиоактивным dTTP (рис. 6). В этих реак- циях только один нуклеотид добавляется к праймерам. После окончания реакции продукты разгоняются в акриламидном геле, и анализируется радиоактивность меченых праймеров. Для этого метода также можно использовать флюоресцентно- меченые нуклеотиды [21]. 3. Иммунопреципитация ДНК. В этом методе исполь- зуют специфические антитела к белкам, способным се- лективно связывать метилцитозин, – таким как MeCP2 и MBD2 [6]. Метод относительно чувствительный и не требует рестрикции геномной ДНК или бисульфитной обработки. Данные, полученные методом иммунопреци- питации, проще анализировать и интерпретировать, чем, например, после бисульфитной конверсии. В то же время иммунопреципитация позволяет получить данные только об общем метилировании и не применима к изучению кон- кретного гена. 4. Микроматричный анализ метилирования ДНК. Кон- струирование микроматриц (micro-array) для анализа мети- лирования ДНК основывается на трех методах: рестрикции, аффинной очистке и бисульфитной конверсии. Микрома тричная методология позволяет проводить сканирование всей геномной ДНК. Коммерческие микроматрицы NimbleGen ("Roche") вы- пускают в нескольких вариантах, что позволяет проводить анализ метилирования отдельных хромосом человека. Микроматрицы NimbleGen включают все классифициро- ванные CpG-островки, в том числе и редко встречающиеся [22]. Affymetrix (Santa Clara) – несколько типов платформ для анализа метилирования. Они требуют очень малого количества (не более 100 нг) ДНК, что дает возможность использовать эти платформы для анализа метилирова- ния в эмбриогенезе и проводить анализ малых образцов [23].

 

⇐ Предыдущая567891011121314Следующая ⇒

Поделиться: