Получение гена, кодирующего фермент

Необходимый ген, кодирующий фермент может быть получен несколькими способами:

· химическим синтезом,

· синтезом методом ПЦР (полимеразной цепной реакции),

· выделением из геномной ДНК,

· синтезом с мРНК.

Синтезировать химическим путем удается относительно небольшие фрагменты ДНК, кодирующие небольшое число аминокислот. С разработкой и внедрением ПЦР этот метод стал все более активно использоваться и для синтеза генов.

Получение гена из геномной ДНК производится с использованием сайт-специфических эндонуклеаз рестрикции, называемых рестриктазами. Эти ферменты сыграли огромную роль в развитии генной инженерии. Рестриктазы разрезают двойную спираль по специфическим последовательностям из 4-8 нуклеотидов. Они могут вносить тупой или ступенчатый разрез.

Под действием рестриктаз, вызывающих ступенчатые разрывы, на обоих концах фрагмента ДНК образуются короткие одноцепочечные участки. Их называют “липкими концами”. Они способны к комплементарному взаимодействию с другим концом, образовавшимся под действием одного и того же фермента. Это используется для встраивания гена в вектор. Необходимо отметить, что способ получения гена из геномной ДНК, путем разрезания всей геномной ДНК с помощью рестриктаз приводит к тому, что клонируется огромное количество фрагментов. Это ведет к большому объему работы на этапе клонирования.

Ген может быть получен с помощью синтеза фрагмента ДНК с матричной РНК с использованием обратной транскриптазы. Такие фрагменты называют кДНК (комплементарными ДНК). Этот способ обладает следующими преимуществами: фракция мРНК, выделяемая из клеток представляет собой копии только активных – экспрессирующихся генов, в то время как геномная ДНК содержит большой объем неэкспрессируемых последовательностей. Кроме того, кДНК лишены интронов. Это может быть очень актуальным при клонировании эукариотических генов в прокариотических системах.

Вставка гена в вектор

Ген вводится в специальные молекулы ДНК, которые обеспечивают функционирование гена в новой генно-инженерной системе. Генетические элементы, используемые для создания рекомбинантной ДНК и введения ее в клетку, называют векторами. В качестве векторов чаще всего используют вирусы и плазмиды.

Плазмидные векторы созданы на основе природных бактериальных плазмид. Они представляют собой небольшие кольцевые молекулы двухцепочечной ДНК. Такие векторы способны автономно реплицироваться благодаря наличию точки инициации репликации (ori). Плазмиды, которые используются в генной инженерии, содержат селективные маркеры. В качестве селективных маркеров часто используются гены устойчивости к антибиотикам. Обычно векторная молекула несет более одного селективного маркера. Благодаря таким маркерным генам на последующих этапах клетки, несущие рекомбинантную плазмиду, легко отделить от клеток, не имеющих такой рекДНК.

Вставка гена в вектор, т.е. создание рекДНК осуществляется стандартно с использованием рестриктаз. Векторная молекула, кроме oriи селективных маркеров должна нести уникальные сайты рестрикции для нескольких рестриктаз. Уникальный сайт рестрикции обеспечивает то, что при обработке соответствующей рестриктазой кольцевая молекула будет разрезана в одном строго определенном месте и превратится в линейную. При соединении клонируемого гена и вектора, обработанных одной и той же рестриктазой, эти молекулы могут соединяться в одно целое путем спаривания оснований «липких концов». Полученная молекула ДНК (вектор со встроенным геном) называется рекомбинантной (рекДНК). Соответственно, кодируемые рекомбинантными ДНК ферменты называютрекомбинантными ферментами, а клетки, экспрессирующие такие ферменты (или другие белки) – рекомбинантными клетками или рекомбинантными системами.

⇐ Предыдущая11121314151617181920Следующая ⇒

Поделиться: