Векторы: плазмидные, фаговые искусственные хромосомы

Как клонирующие векторы в генной инженерии используются плазмиды, вирусы и искусственные хромосомы. Самыми первыми векторами стали бактериальные плазмиды - внехромосомные автономно реплицирующиеся кольцевые молекулы ДНК. Следом для молекулярного клонирования стали использовать вирусы (фаги), которые в природе также могут захватывать и передавать ДНК от клетки к следующей клетке (трансдукция ДНК). Появились различного ряда гибридные векторы, например гибриды фагов с плазмидами - фагмиды (phagemid). Для клонирования больших фрагментов ДНК были сконструированы искусственные хромосомы.

Плазмидные векторы - кольцевые двухцепочечные молекулы ДНК, имеющие клонирующий лимит до ~10 тнп (тысяч пар нуклеотидов). Плазмиды найдены практически у всех исследованных бактерий, у некоторых до ~10 видов разных плазмид, каждая из них выполняет свои характерные функции. Плазмиды также обнаружены у некоторых эукариот, например, у дрожжей -три типа различных плазмид. Некоторые плазмиды можно рассматривать как молекулярных паразитов, но многие кодируют важные функции, например, устойчивость к антибиотикам, тяжелым металлам, способность усваивать определенные вещества. В одной клетке могут сосуществовать только плаз-миды, принадлежащие к разным группам совместимости. Каждая плазмида содержит сайт инициации репликации (ориджин, ori), специфичность которого определяет круг хозяев плазмиды, некоторые могут реплицироваться только в клетках одного вида, другие имеют широкий спектр хозяев. Размеры плазмид варьируют приблизительно от ~1 до 500 тпн. Каждая плазмида имеет постоянную определенную копийность в клетке - количество молекул на клетку. На основе плазмид сконструировано огромное количество различных векторов, поскольку единственным обязательным элементом плазмиды является небольшой сайт инициации репликации, с остальной последовательностью можно проводить любые манипуляции. Схема типичного плазмидного вектора рассмотрена более подробно далее (см. рис. 2.7). Основным недостатком плазмидных векторов является их малая емкость в отношении клонируемых фрагментов ДНК. Выраженное делетирование больших вставок чужеродной ДНК в плазмидах связано с тем, что селективное преимущество в бактериях получают плазмиды с минимальным временем репликации.

Искусственные хромосомы. Разработка векторов типа искусственных хромосом началась для решения задачи клонирования и стабильного наследования больших фрагментов ДНК, например, для физического картирования генома в проектах расшифровки геномов, для стабильной экспрессии обширных генных комплексов в трансгенных клетках, для внедрения таких комплексов и отдельных генов в клетку-мишень без нарушения ее хромосомных структур и т.д. Бактериальные искусственные хромосомы (bacterial artificial chromosomes - BAC) сконструированы на основе полового фактора F E. coli со строгим контролем репликации. Его генетическая система обеспечивает правильное распределение фактора F между делящимися клетками и поддерживает его копийность в 1-2 молекулы на клетку. BAC-векторы позволяют клонировать фрагменты ДНК в 75-300 тпн. Дрожжевые искусственные хромосомы (yeast artificial chromosomes -YAC) - линейная ДНК, которая имеет все необходимое для репликации в дрожжах: теломеры, несколько сайтов инициации репликации (репликонов), дрожжевую центромеру (рис. 2.6). Также дополнительно содержит селективный маркер для идентификации и поддержания популяции рекомбинантных клеток. Клонирующий лимит - 100-1 000 тпн. Бактериальные и дрожжевые искусственные хромосомы применяют для создания геномных библиотек. Причем, структурная стабильность протяженных вставок ДНК в BAC-системе существенно выше, чем в YAC-системе, чем обусловлено широкое использование BAC-системы при физическом картировании генома человека, по которому затем собиралась его полная последовательность.

Вирусные векторы. Рассмотрим основные из них. Бактериофаг лямбда имеет линейную молекулу ДНК с 48,5 тпн. Емкость клонирующих векторов была существенно повышена с разработкой векторов на основе фага лямбда. Центральную треть вирусного генома можно заменить чужеродной ДНК без нарушения жизненного цикла фага, клонирующий лимит от 8 до 24 тпн, что составляет половину генома лямбды дикого типа (рис. 2.4).

Механизм упаковки бактериофага в зрелые вирионы основан на включении ДНК строго определенного размера, что стабилизирует ДНК-вставки и позволяет легко освобождаться от нерекомбинантных молекул. Упаковку сконструированных in vitro молекул на основе фага лямбда производят в смеси бесклеточных экстрактов двух штаммов Е. coli, лизогенных по бактериофагам с разными дефектами. Объединение бесклеточных лизатов обоих штаммов Е. coli приводит к взаимной комплементации недостающих функций с помощью соответствующих белков дикого типа. Векторы на основе фага лямбда являются одними из самых распространенных для создания библиотек генов.

Космиды - кольцевые молекулы ДНК, объединяющие свойства фага и плазмиды, содержат ориджин репликации и соs-сайты фага лямбда. Сконструированы для клонирования больших фрагментов ДНК в 35-50 тпн. Для упаковки ДНК в фаговую головку вирусный аппарат фага лямбда требует только наличия соя-сайтов на расстоянии 36-51 тпн. Гибридные молекулы космиды с большими вставками в 35-50 тпн между соя-сайтами упаковываются in vitro в виде инфекционных вирионов при использовании экстрактов фагов дикого типа. Естественно, такие фаговые частицы нежизнеспособны, после инфекции космиды существуют в бактериальной клетке как плазмиды. Нитевидные бактериофаги - М13 (рис. 2.5), fd, f1 бактерии E. coli. Представляют собой одноцепочечную кольцевую ДНК, упакованную в белковую трубочку из одинаковых белковых субъединиц, двухцепочечная репликативная форма похожа на плазмиду. Вставки чужеродной ДНК до 1 тпн очень стабильны. Наиболее широко ранее использовались векторы на основе фага М13. До появления метода ПЦР, который позволяет секвенировать сразу двухцепочечные молекулы ДНК, одноцепочечные матрицы для секвенирования получали клонированием в М13-вектор.

⇐ Предыдущая14151617181920212223Следующая ⇒

Поделиться: