Для каких целей используют электрофорез ДНК?

Электрофорез – метод разделения макромолекул, различающихся по таким параметрам, как размеры (или молекулярная масса), пространственная конфигурация, вторичная структура и электрический заряд.

Электрофорез в агарозном геле является стандартным методом, используемым для разделения, идентификации и очистки фрагментов ДНК. Эта методика проста, быстро осуществляется, и способна разделять фрагменты ДНК, которые не могут быть разделены надлежащим образом с помощью других процедур. Более того, локализация ДНК в геле может быть определена путем окрашивания бромистым этидием, - флуоресцентным интеркалярным красителем, в низких концентрациях. В следующих разделах будут описаны физические принципы, компоненты (матрикс геля, буфер, буфер для нанесения и маркер), а также процедуры, применяемые для подготовки электрофореза в агарозном геле (Sambrook et al., 1989).

Гель-электрофорез– это метод, используемый для разделения нуклеиновых кислот и белков.

Этапы выделения нуклеиновых кислот

Методы выделения ДНК обычно включают следующие этапы:

1) лизис клеток;

2) осаждение белков;

3) центрифугирование для удаления денатури-рованных белков и фрагментов клеточных органелл;

4) осаждение ДНК из раствора этанолом и после центрифугирования растворение осадка в буферном растворе.

Вместе с ДНК частично выделяется и РНК, от которой избавляются с помощью фермента РНКазы. К способам лизиса клеток можно отнести: механическое разрушение (с помощью гипотонического раствора и/или с применением ультразвука), химическая обработка (лизис с помощью детергентов и хаотропных агентов) и ферментативное расщепление белков (протеинкиназа К) [4]. Осаждение белков. Экстракция растворителями часто используется для удаления примесей из нуклеиновых кислот. Например, комбинация растворителей: фенол и хлороформ часто используется для осаждения и удаления белков. Если содержание целевых нуклеиновых кислот небольшие, к смеси может быть добавлен инертный носитель (такой как гликоген) для того, чтобы увеличить эффективность преципитации. Другие методы осаждения нуклеиновых кислот включает селективную преципитацию с использованием высоких концентраций солей (“высаливание”), либо осаждение белков с использованием переменного рН [3]. Центрифугирование для удаления денатурированных белков и фрагментов клеточных органелл. Проводиться при 1500 rpm в течение 15 мин. Осаждение ДНК из раствора возможно с помощью этанола: 96% этанол; изопропанол; очистка 70% этанолом; который считается наиболее часто используемым методом концентрирования ДНК. Растворив полученный осадок в меньшем объеме буферного раствора, получают более концентрированный раствор ДНК. При переосаждении ДНК спиртом происходит ее дополнительная очистка. Этиловый спирт как водоотнимающее средство снижает растворимость нуклеиновых кислот (их солей) в воде. ДНК агрегирует в 70% этаноле в присутствии соли, нейтрализующей фосфатные группы. Преимуществами метода экстракции органическими растворителями являются: получение ДНК хорошего качества и высокой концентрации, выделенная ДНК очень стабильна и хорошо хранится в замороженном состоянии. А недостатками метода можно отметить: высокую токсичность, занимает много времени; не всегда удаляет ингибиторы; трудность автоматизации [4].

Довольно часто количественную и качественную оценку препарату выделенной ДНК в первом приближении дают при гель-электрофорезе, следующем, как правило, сразу за процедурой выделения. Для этого визуально сравнивают на соседних дорожках геля интенсивность свечения в ультрафиолете полученного образца с образцом известной концентрации

⇐ Предыдущая18192021222324252627Следующая ⇒

Поделиться: