Идентификация амино- и карбокси- концевых остатков.

Следующий шаг состоит в идентификации аминокислотного остатка, находящегося на конце полипептидной цепи, несущего свободную альфа-аминогруппу,т.е. на аминоконце ( NH2 - конце, или N-конце). Для этой цели Сэнгер предложил использовать реагент, <1-фтор-2,4-динитробензол>, который можно присоединить в качестве метки к аминоконцевому (N- концевому) остатку цепи, в результате чего образуется окрашенное в желтый цвет 2,4-динитрофенольное (ДНФ) производное полипептида. При кислотном гидролизе все пептидные связи в таком ДНФ-производном расщепляются, однако ковалентная связь между альфа-аминогруппой N-концевого остатка и 2,4-динитрофенильной группой остается незатронутой. Следовательно, N-концевой остаток будет представлен в гидролизате в виде 2,4-динитрофенильного производного. Это производное легко отделить от незамещенных свободных аминокислот и идентифицировать хроматографическим способом путем сравнения его с аутотентичными динитрофенильными производными различных аминокислот. Карбоксиконцевой (С- концевой) аминокислотный остаток тоже можно идентифицировать, используя тот или иной метод. Один из таких методов состоит в инкубировании полипептида с карбоксипептидазой, которая гидролизует только пептидную связь находящуюся на карбоксильном конце (С-конце) цепи. Определив, какая из аминокислот первой отщепилась от полипептида, при действии на него карбоксипептидазы, можно идентифицировать С-концевой остаток.

49. Определение аминоконцевого остатка ( NH 2 - конца, или N -конца). Метод Сэнгера

Метод Сэнгера — метод секвенирования (определения последовательности нуклеотидов) ДНК, также известен как метод обрыва цепи. Впервые этот метод секвенирования был предложен Фредериком Сэнгером в 1977 году[1], за что он был удостоен Нобелевской премии по химии в 1980 году.

В классическом варианте метода Сэнгера одна из цепочек анализируемой ДНК выступает в качестве матрицы для синтеза комплементарной цепочки ферментом ДНК-полимеразой. Реакцию с одной и той же матрицей проводят в четырёх разных пробирках, каждая из которых содержит:

 

праймер — небольшую одноцепочечную молекулу ДНК, комплементарную началу участка, который нужно отсеквенировать. Праймер необходим потому, что ДНК-полимеразы не могут начинать синтез цепи «с пустого места», они только присоединяют следующий нуклеотид к уже имеющейся 3'-гидроксильной группе предыдущего. Праймер, таким образом, представляет собой «затравку» при синтезе ДНК;

небольшое количество радиоактивно меченного дезоксинуклеотида (например, [32P]-дАТФ), который включается в состав ДНК во время синтеза и позволяет впоследствии визуализировать продукты реакции;

смесь трёх дезоксинуклеотидов в оптимальных для протекания реакции концентрациях, четвёртый дезоксинуклеотид в более низкой концентрации и дидезоксипроизводное четвёртого нуклеотида.

У дидезоксирибонуклеотидов отсутствует 3'-гидроксильная группа, поэтому после их включения в цепь дальнейший синтез обрывается. Таким образом, в каждой пробирке образуется набор фрагментов ДНК разной длины, которые заканчиваются одним и тем же нуклеотидом (в соответствии с добавленным дидезоксинуклеотидом). После завершения реакции содержимое пробирок разделяют электрофорезом в полиакриламидном геле в денатурирующих условиях и проводят радиоавтографию гелей. Продукты четырёх реакций формируют «секвенирующую лестницу», которая позволяет «прочитать» нуклеотидную последовательность фрагмента ДНК[2][1].

 

Метод Сэнгера позволяет также определять нуклеотидную последовательность РНК, но она предварительно должна быть «переписана» в форме ДНК с помощью обратной транскрипции.

50. Определение аминоконцевого остатка ( NH 2 - конца, или N -конца). Метод Эдмана

Метод Эдмана используется в качестве химической основы для определения первичной структуры белков и пептидов. Он реализован в специальном приборе – секвенаторе, работающем в автоматическом режиме и позволяющем определить последовательность аминокислот с N-конца пептида до 50–60 аминокислотных остатков.

 

51. Определение карбоксиконцевого (С- конца) аминокислотного остатка. Ферментативный метод.

Наиболее распространенный метод для проведения такого расщепления - это частичный ферментативный гидролиз пептида под воздействием ферментов.

Химические методы избирательного гидролиза основаны на применении таких химических реактивов, которые вызывают селективный распад пептидных связей, образованных определёнными аминокислотами, оставляя незатронутыми другие связи

-бромциан (по остаткам метионина)
-гидроксиамин (между аспаргиновой кислотой и глицином)
-N-бромсукцинамид (по остаткам триптофана).

52. Определение карбоксиконцевого (С- конца) аминокислотного остатка. Химический метод Акабори.

Метод Акабори 

Гидразин, вызывая распад чувствительных к нему пептидных связей полипептида, реагирует со всеми аминокислотами, за исключением С-концевой аминокислоты, поскольку ее карбоксильная группа не участвует в образовании пептидной связи. При этом образуется смесь аминоацил-гидразинов и свободной С-концевой аминокислоты. Последнюю после обработки всей смеси динитрофторбензола (ДНФБ) отделяют и идентифицируют хроматографически, для чего образовавшиеся динитрофенилпроизводные аминоацил-гидразинов предварительно экстрагируют уксусно-этиловым эфиром

⇐ Предыдущая17181920212223242526Следующая ⇒

Поделиться: