Разработка алгоритма для изучения биологической активности веществ различной природы на модели in vitro - PARAMECIUM CAUDATUM

Объекты исследования

Исследуемые вещества различной природы (например: токсины бактерий и антисыворотки к ним; лекарственные средства; суммарные и моно препараты растительного, животного происхождения).

2.1 Приготовление базовых растворов

При подготовке объекта исследования учитывают растворимость исследуемого вещества согласно ГФ XI издания [6].

Для водорастворимых веществ химической или биологической природы готовят основной 1% раствор в количестве 10 мл и определяют рН с помощью рН-метра или набора индикаторов, рН должен быть в пределах, обеспечивающих нормальную жизнедеятельность парамеций.

Для веществ нерастворимых в воде готовят 1% суспензию: с целью получения тонко измельчённых веществ при растирании применяется дистиллированная вода в количестве 1/2 от массы измельчённого лекарственного вещества (правило Б.В. Дерягина).

Для жирорастворимых веществ готовят 10% эмульсию. В качестве эмульгатора целесообразно использовать желатозу. Желатоза является индифферентной по отношению к клеткам парамеций, не изменяет их функциональных и структурных характеристик.

Для веществ, растворимых в спирте, готовят спиртовые растворы. При этом необходимо учитывать, что 6% этиловый спирт вызывает остановку движения парамеций, а 10% - лизис.

2.2 Приготовление разведений

Из базовых растворов готовят серии рабочих разведений: токсины бактерий разводят в среде Л-Л, титруют методом двукратного разведения; для фармакологических средств путём последовательного десятикратного разбавления дистиллированной водой или в среде Л-Л от 3 до 5 и более порядков.

Для веществ бактериальной природы концентрацию препарата выражают по количеству белка или по весовому количеству.

Концентрация препарата
%	10	1	0,1	0,01	0,001	0,0001	0,00001
г/мл	1,0×10^-1	1,0×10^-2	1,0×10^-3	1,0×10^-4	1,0×10^-5	1,0×10^-6	1,0×10^-7

Модельные токсиканты

Для изучения защитных свойств веществ различной природы применяют модельные токсиканты – индикаторные повреждающие агенты - вещества, относящиеся к клеточным ядам (токсиканты), или их комбинация, создающие по данным литературы определенную патологическую модель повреждения мембраны клетки.

Например: этиловый спирт и формальдегид повреждают белковую часть биомембраны, а пероксид водорода инициирует ПОЛ (перекисное окисление липидов) мембраны.

3.1. Приготовление разведений модельных токсикантов

3.1.1 Разведение этилового спирта:

А) по алкогометрическим таблицам

Концентрация спирта, %	1		2		3		4		5		6		7		8		9		10		И		11
V мл 96% спирта		од		0,2		0,3		0,4		0,5		0,6		0,7		0,8		0,9		1,0		1,1		1,2
V мл Н₂О		9,9		9,8		9,7		9,6,		9,5		9,4		9,3		9,2		9,1,		9,0		8,9		8,8

3.1.2 Разведение перекиси водорода:

Из раствора пероксида водорода 3% готовим разведения с шагом в 0,5% до концентрации 1,0×10^-2 , а затем последовательные десятикратные.

3.1.3 Разведение формалина:

На основе исходного раствора формалина (концентрация 36,5-37,5% формальдегида) готовим серию растворов с концентрацией от 1,0×10^-1 до 1,0×10^-9 г/мл.

Примечание:

- растворы пероксида водорода и формальдегида готовят ех tempore;

- для каждого разведения у каждого токсиканта используется индивидуальная пипетка.

3.1.4 Разведение сульфата меди ( II ):

Исходный концентрат сульфата меди (10 мг/дм³) в дистиллированной воде хранят не более недели. Перед самым определением, готовят серии рабочих разведений путём последовательного десятикратного разбавления: до 1 мг/дм³ дистиллированной водой, а от 0,1 мг/дм³ и меньше – в среде Л-Л.

Ход работы:

На предметное стекло наносят несколько капель культуры по 0,05 мл (50 мкл), содержащей парамеции (не менее 5 особей в капле), одна капля (50 мкл) служит контролем, к остальным последовательно тангенциально прибавляют каплю (50 мкл) исследуемого базового раствора. Наблюдают 5-10 минут за изменением движения парамеций, отмечают характерные изменения в их движении: ускорение, замедление, круговые хаотические движения. В случае остановки или гибели парамеций опыты повторяют с серией разведений.

Определение обратимости или необратимости остановки: на предметное стекло помещается несколько капель культуры, одна капля служит контролем, к остальным последовательно добавляют исследуемое вещество в концентрации, вызывающей остановку, а затем тангенциально от 1 до 3 капель aq. dest.

Если движение парамеций восстанавливается, то остановка носила обратимый характер и зависит от повышения концентрации исследуемого вещества. При этом остановка считается обратимой, если движение восстанавливается до первоначального (в сравнении с контролем).

Фиксируются изменения: функциональные и структурные в зависимости от использованных концентраций. Данные заносятся в таблицу и на их основе строятся графики зависимости «доза – эффект» и делаются выводы о собственной биологической активности и токсичности.

При этом информативными являются следующие показатели:

- наименьшая концентрация исследуемого вещества, вызывающая ускорение или замедление движения парамеций - пороговая концентрация (Пк);

- концентрация, вызывающая необратимую остановку – остановочная концентрация (Ок);

- концентрация, приводящая к лизису - лизирующая (Лк).

О степени биологической активности судят по величине пороговой концентрации – чем меньше эта величина, тем выше активность. О клеточной токсичности судят по величине лизирующей концентрации – чем она меньше, тем токсичнее вещество. О степени нарастания токсичности судят по интервалу между остановочной и лизирующей концентрациями.

Эти показатели позволяют не только получить первоначальное представление об активности и токсичности исследуемого вещества, но и в дальнейшем проводить подбор доз при исследованиях, проводимых на более сложных биологических моделях.

4.2. Методика проведения эксперимента по анализу возможных механизмов остановки движения Paramecium caudatum под действием исследуемых веществ

Токсичные эффекты проявляются как в виде изменений скорости движения клеток и остановки, так и в виде структурных изменений в мембране – изменение формы, а затем и гибели клетки – лизиса.

Анализ механизмов остановки представляется ценным при изучении возможного механизма действия исследуемого вещества и облегчает дальнейшие исследования на более сложных биологических моделях (тканях, органах, «функциональных системах»).

Для дифференциации и анализа возможных механизмов остановки движения парамеций под влиянием исследуемых веществ, используются различные группы веществ, восстанавливающие движение (реактиваторы), с заведомо известным механизмом функционального (фармакологического) действия. Это позволяет предположить возможный механизм токсического действия исследуемого вещества и подобрать соответствующие антагонисты, устраняющие остановку.

Алгоритм исследования:

1. Определение остановочной концентрации исследуемого вещества или состава по результатам пяти измерений.

2. Определение пороговой концентрации веществ, используемых для восстановления активности (по методике, п.4.1).

3. Выявление реактиватора. К капле парамеций, находящихся в состоянии остановки, добавляют тангенциально соответствующую каплю, содержащую пороговую концентрацию предполагаемого реактиватора.

При разработке интегральной модели повреждения биомембран используются комбинации повреждающих агентов в пороговых, остановочных и лизирующих концентрациях. При этом наблюдается усиление биологической активности и токсичности.

Разработка алгоритма для изучения биологической активности веществ различной природы на модели in vitro - PARAMECIUM CAUDATUM

При разработке методов биологической оценки активности веществ различной природы прослеживается тенденция перехода от опытов на теплокровных животных (крысы, мыши, кролики и др.) к опытам с клеточными культурами и одноклеточными организмами. Актуальность исследований по расширению спектра моделей для оценки биологической активности веществ особенно возросла после принятия Международной конвенции по защите животных и гуманному отношению с ними.

В настоящее время культуры клеток широко используются в вирусологии, онкологии, фармации, иммунологии и бактериологии при оценке токсичности лекарственных средств, пищевых добавок, промышленных отходов, бактериальных токсинов.

По сравнению с исследованиями in vivo, использование в качестве объектов культуры клеток имеет ряд преимуществ, основными из которых являются:

- высокая стандартность, так как культуры представляют собой генетически однородную популяцию клеток, растущих в постоянных условиях;

- высокая чувствительность клеточных культур к изменениям условий существования при воздействии химических и других факторов;

- возможность оценки жизнеспособности клеток на протяжении всего эксперимента.

Наряду с монослойными перевиваемыми кленовыми культурами макроорганизмов представляет интерес культура микроорганизмов эукариот - инфузорий различных видов.

Инфузории хорошо изучены биологами, среди них отсутствуют патогенные формы. Режимы культивирования в лабораторных условиях, обеспечивающие стандартизацию культуры не требуют дорогостоящих питательных сред и добавок к ним, а так же особых условий стерильности.

Выбор инфузории как биологической модели обусловлен тем, что они сочетают в себе морфологические признаки эукариотической клетки, а на внешнюю среду реагируют как самостоятельный организм, поэтому они могут служить моделью для изучения биологической активности веществ различной природы.

Предлагаемая методика даёт качественную и количественную оценки биологической активности веществ различной природы, выявляя зависимость «доза-эффект», позволяет:

1. определить:

- широту активности «физиологический диапазон» (интервал доз от пороговой до остановочной), широту токсичности «токсический диапазон» (интервал доз от остановочной до лизирующей);

- степень биологической активности и токсичности различных веществ (ранжирование);

2. проводить:

- подбор доз для проведения биологических исследований на более сложных биологических моделях;

- скрининговые исследования по выявлению протективной активности веществ к токсикантам;

- индивидуальные и сравнительные фармако- и токсикокинетические исследования;

3. создавать различные патологические модели для выявления и анализа возможного механизма действия веществ;

4. давать веществам оценку экологической безопасности;

5. выявлять характер и длительность фармакологического действия;

6. подбирать оптимальные комбинации лекарственных средств;

7. моделировать рациональные методы лечения;

8. использовать как оценочный тест при биотехнологических исследованиях и при анализе лекарственных форм.

Это значительно облегчает дальнейшие исследования на более сложных биологических моделях и позволяет не только уменьшать время таких исследований, но и значительно снижает их стоимость.

Таким образом, Paramecium caudatum могут эффективно использоваться как модель in vitro для изучения биологических свойств веществ различной природы и в качестве стандартного тест-объекта для контроля за уровнем токсичности выпускаемых медицинских иммунобиологических препаратов.

АЛГОРИТМ ИССЛЕДОВАНИЯ

биологической активности веществ различной природы in vitro на модели PARAMECIUM CAUDATUM

1.4.1 Питательные среды

А. Среда для культивирования Paramecium caudatum, разбавления и отмывания - среда Л.К. Лозина-Лозинского (Л-Л) жидкая синтетическая:

NaCL -0,01%

KCL -0,001%

CaCL₂-0,001%

MgCL₂ или MgSO₄-0,001%

NaHCO₃-0,002%

Вода очищенная (дистиллированная) до 1 литра;

Настой банановый: вымытая кожура одного банана настаивается 45 минут в 300 мл дистиллированной воды;

1.4.2 Культивирование

Парамеции содержатся в комнатных условиях, оптимальная температура - 20±5°С, в широкогорлой посуде, заполненной на 5 см слоем средой Л-Л. Ежедневно контролируется показатель рН среды, который должен быть близок к оптимальному, т.е. =7,0. В качестве корма используют воздушно-сухие дрожжи из расчёта 1 мг на 1 мл среды или бактерии, дрожжи и их смесь, выращенные стерильно на твёрдых средах.

Для контроля за развитием культуры отбирают ежедневно пробу, в которой определяют количество клеток по п. 1.4.5. Отсутствие прироста клеток в популяции свидетельствует о наступлении стационарной фазы роста, ежедневный контроль позволяет определять её начало, которая обычно наступает на 2-3 сутки, при этом плотность культуры будет составлять 2000±1000 клеток/см³.

1.4.5 Определение концентрации клеток парамеций

В общем случае концентрацию клеток парамеций определяют подсчётом клеток под микроскопом по общепринятым в микробиологической практике методикам с помощью измерительных сеток, счётных камер и т.п. Подсчитанное количество клеток пересчитывают на единицу объёма среды и выражают как концентрацию (клеток/см³).

Например: исходную взвесь инфузорий взболтать, отобрать с помощью пипетки 1,0 см³ взвеси, к которой добавить 9,0 см³ 1% раствора NaCL. Не дожидаясь полного обездвиживания парамеций (примерно через 2-5 мин) из разбавленной взвеси отбирают 0,5-1,0 см и распределяют этот объём в виде 6-10 крупных капель на сухом стекле. С помощью микроскопа подсчитывают парамеции во всех каплях. Полученный результат пересчитывают на 1 исходной взвеси. Если 1,0 см обездвиженных парамеций распределены в 6 каплях, в которых было сосчитано 29, 38, 32, 28, 35 клеток - всего 193, то в 1,0 см³ разбавленной взвеси содержится 193 клетки, а в 1,0 см³ исходной взвеси следовательно будет содержаться 1930 клеток парамеций.

1.4.6 Определение исходного состояния биологической модели - определение чувствительности:

Выращенную культуру парамеций по п. 1.4.2. отмывают от продуктов метаболизма и корма, доводят концентрацию до рабочего значения и проводят проверку готовности культуры к исследованиям.

Для исследований используют культуру в начале стационарной фазы развития

В качестве свойств биомодели нормируются следующие показатели:

- реакция ускорения движения парамеций с 0,05% раствором NaCl;

- реакция замедления движения парамеций с 0,05% раствором КС1.

На предметное стекло наносят три капли среды по 0,05 мл, содержащие парамеции (количество особей в каждой капле не менее 5), одна капля служит контролем, а ко второй тангенциально (сбоку) прибавляют каплю соответствующего объёма (0,05 мл) 0,05% раствора натрия хлорида - наблюдается заметное ускорение движения в сравнении с контролем. К третьей капле аналогично прибавляем каплю 0,05% раствора калия хлорида и наблюдаем замедление движения парамеций по сравнению с контролем.

- порог чувствительности к модельному токсиканту – CuSO₄x5H₂O - 0,01 мг/дм³;

- диапазон реагирования на модельный токсикант находится в пределах - 0,01-1,0 мг/дм³;