Методики проведения экспериментов

Методика счёта

 

Каждый опыт во всех предлагаемых методиках повторяют не менее 5 раз. Результаты обрабатываются статистически. При этом должно наблюдаться изменение функциональных и морфологических признаков не менее чем у 80% особей по результатам 5-ти измерений.

 

4.1. Методика проведения эксперимента по определению собственной активности (порога действия) и токсичности исследуемых веществ на клетках Paramecium caudatum

В остром опыте in vitro определяют дозозависимые эффекты, вызывающие у парамеций изменение признаков: функциональные (характер и геометрия движения) и морфологические (изменение формы и лизис) (табл. 1).

 

Таблица 1

Морфо-функциональные реакции культуры клеток Paramecium caudatum под воздействием веществ различной природы

№ п/п	Концентрация вещества	Описание изменений функциональных и морфологических признаков у Paramecium caudatum
1.	Пороговая	Парамеции замедляют или ускоряют движение, но не останавливаются. Клетки правильной эллипсовидной формы
2.	Изменяющая движение	Парамеции совершают круговые, хаотичные движения, но не останавливаются. Клетки правильной эллипсовидной формы
2.	Остановочная	Остановка движения парамеций. Клетки правильной эллипсовидной формы, расположены скоплениями, некоторые клетки округлены
3.	Изменяющая форму	Изменение формы парамеций. Клетки раздуты с чётко выраженным ободком, форма - сферическая
4.	Лизирующая (смертельная)	Лизис основного количества клеток, клеточные стенки размыты, содержимое клеток вылито

 

Ход работы:

На предметное стекло наносят несколько капель культуры по 0,05 мл (50 мкл), содержащей парамеции (не менее 5 особей в капле), одна капля (50 мкл) служит контролем, к остальным последовательно тангенциально прибавляют каплю (50 мкл) исследуемого базового раствора. Наблюдают 5-10 минут за изменением движения парамеций, отмечают характерные изменения в их движении: ускорение, замедление, круговые хаотические движения. В случае остановки или гибели парамеций опыты повторяют с серией разведений.

Определение обратимости или необратимости остановки: на предметное стекло помещается несколько капель культуры, одна капля служит контролем, к остальным последовательно добавляют исследуемое вещество в концентрации, вызывающей остановку, а затем тангенциально от 1 до 3 капель aq. dest.

Если движение парамеций восстанавливается, то остановка носила обратимый характер и зависит от повышения концентрации исследуемого вещества. При этом остановка считается обратимой, если движение восстанавливается до первоначального (в сравнении с контролем).

Фиксируются изменения: функциональные и структурные в зависимости от использованных концентраций. Данные заносятся в таблицу и на их основе строятся графики зависимости «доза – эффект» и делаются выводы о собственной биологической активности и токсичности.

При этом информативными являются следующие показатели:

- наименьшая концентрация исследуемого вещества, вызывающая ускорение или замедление движения парамеций - пороговая концентрация (Пк);

- концентрация, вызывающая необратимую остановку – остановочная концентрация (Ок);

- концентрация, приводящая к лизису - лизирующая (Лк).

О степени биологической активности судят по величине пороговой концентрации – чем меньше эта величина, тем выше активность. О клеточной токсичности судят по величине лизирующей концентрации – чем она меньше, тем токсичнее вещество. О степени нарастания токсичности судят по интервалу между остановочной и лизирующей концентрациями.

Широта активности - «терапевтический или физиологический диапазон» - интервал от пороговой концентрации до остановочной.

Широта токсичности - «токсический диапазон» - интервал от остановочной концентрации до лизирующей.

Эти показатели позволяют не только получить первоначальное представление об активности и токсичности исследуемого вещества, но и в дальнейшем проводить подбор доз при исследованиях, проводимых на более сложных биологических моделях.

 

4.2. Методика проведения эксперимента по анализу возможных механизмов остановки движения Paramecium caudatum под действием исследуемых веществ

Токсичные эффекты проявляются как в виде изменений скорости движения клеток и остановки, так и в виде структурных изменений в мембране – изменение формы, а затем и гибели клетки – лизиса.

Анализ механизмов остановки представляется ценным при изучении возможного механизма действия исследуемого вещества и облегчает дальнейшие исследования на более сложных биологических моделях (тканях, органах, «функциональных системах»).

⇐ Предыдущая1234Следующая ⇒

Поделиться: