Принцип постановки реакций ГА и РТГА.

1.Реакцию гемагглютинации (РГА) применяют для обнаружения гумагглютинирующих вирусов в культуральной жидкости зараженной культуры клеток либо хорионаллантоисной или амниотической жидкости куриного эмбриона. Концентрация вирусных частиц соответствует гемагглютинирующему титру (максимальное разведение вируссодержащей жидкости, вызывающее агглютинацию эритроцитов). РГА ставят в пробирках, на специальных полистироловых планшетах, в аппарате Такачи. Для постановки РГА к исследуемому материалу добавляют взвесь эритроцитов. В присутствие вирусов происходит агглютинация эритроцитов. Результаты реакции учитывают через

40 минут после оседания эритроцитов:

(+) - выраженная гемагглютинация-тонкая пленка склеившихся эритроцитов на дне пробирки, имеющая вид зонтика,

(-) – резко очерченный осадок эритроцитов.

РНГА- реакция, в которой антитела взаимодействуют с антигенами, предварительно адсорбированными на инертных частицах, в данном случае- на эритроцитах. Реакция основана на способности гемагглютинирующих вирусов склеивать эритроциты животных или человека. За агглютинацию отвечают поверхностные структуры вирусов-гемагглютинины гликопротеидной природы. Нагруженные антигеном эритроциты склеиваются в присутствии специфических антител к данному антигену и выпадают в осадок.

Постановка.

В лунках полистироловых планшетов готовят ряд последовательных разведений сыворотки. В предпоследнюю лунку вносят - 0, 5 мл заведомо положительной сыворотки и в последнюю 0, 5 мл физиологического раствора (контроли). Затем во все лунки добавляют по 0, 1 мл разведенного эритроцитарного диагностикума, встряхивают и помещают в термостат на 2 часа при 37, 20 или 4 градусах- в зависимости от свойств изучаемого вируса.

Учет. Положительный результат: эритроциты оседают на дне лунки в виде ровного слоя клеток со складчатым или зазубренным краем (перевернутый зонтик). Отрицательный результат- оседают в виде пуговки или колечка.

2.РТГА: Принцип реакции основан на способности АТ связывать различные вирусы и нейтрализовать их, лишая возможности агглютинировать эритроциты. Визуально этот эффект и проявляется в «торможении» гемагглютинации. РТГА применяют при диагностике вирусных инфекций для выявления специфических антигемагглютининов и идентификации различных вирусов по их гемагглютининам, проявляющим свойства Аг.

Феномен РТГА проявляется образованием компактного осадка эритроцитов вместо зонтика гемагглютинации.

Постановка.

Реакцию проводят на полистироловых пластинах и оценивают по отсутствию склеивания эритроцитов, добавленных к смеси вируса и специфической сыворотки. Для удаления неспецифических ингибиторов гемагглютинации сыворотку обрабатывают ацетоном или др. веществами. В полистироловых пластинках готовят двукратные разведения сыворотки в ИХН и к каждому разведению добавляют равное количество вируссодержащей жидкости. Смесь инкубируют 30-60 мин, при 0, 4, 20, 37 градусах, в зависимости от типа вируса. Затем добавляют равный объем 0.5% взвесь эритроцитов. Смесь инкубируют 45 мин.

Титр сыворотки- её наибольшее разведение, которое тормозит гемагглютинацию.

Учет. Положительный результат: компактный диск- пуговка- отсутствие гемагглютинации, отрицательный результат: зонтик гемагглютинации.

 

Использование РСК в диагностике вирусных инфекций.

См.фотку снизу схематично изобразила!

РСК в вирусологии используется для серодиагностики вирусных инфекций, а также для определения вирусспецифических антигенов в различных материалах, полученных от больных, т.е. для идентификации вирусов.

Для проведения РСК необходимо 2 системы: 1) АГ, АТ, комплемент, 2) эритроциты барана и гемолитическая сыворотка.

Специфическое взаимодействие АТ с АГ сопровождается связыванием комплемента. Гемолитическая система показывает фиксирован ли комплемент комплексом АГ-АТ. Разрушение эритроцитов гемолитической сывороткой происходит только в случае присоединения комплемента к гемолитической системе. Если АГ и АТ соответствуют друг другу, т.е. образовался иммунный комплекс, то комплемент связывается этим комплексом и гемолиза эритроцитов не происходит. Если же АТ и АГ не соответствуют друг другу, то не происходит образования иммунного комплекса, и, соответственно комплемент не связывается и оставаясь свободным он связывается с гемолитической системой, вызывая гемолиз эритроцитов.

Особенности РСК в вирусологии: осуществление связывания комплемента на холоде (+4гр.), а также включение дополнительного контроля с так называемым нормальным АГ (АГ из клеток, в котрых репродуцировался вирус)

Результат опыта оценивают, отмечая наличие или отсутствие гемолиза во всех пробирках. Реакцию считают положительной при полной задержке гемолиза, когда жидкость в пробирке бесцветна и эритроциты оседают на дно, отрицательной - при полном лизисе эритроцитов, когда жидкость интенсивно окрашена (" лаковая" кровь). Степень задержки гемолиза оценивают в зависимости от интенсивности окраски жидкости и величины осадка эритроцитов на дне (++++, +++, ++, +).

 

⇐ Предыдущая12345

Поделиться: