Качественный и количественный анализ

⇐ ПредыдущаяСтр 7 из 22Следующая ⇒

Качественный анализ предполагает сбор всей необходимой информации о пробе для идентификации ее компонентов. По общему виду хроматограммы можно сразу сделать вывод о сложности анализируемой смеси. Времена удерживания компонентов смеси позволяют провести их классификацию в соответствии с летучестью. Специфические детекторы, в первую очередь масс-спектрометр, дают информацию о составе и структуре компонентов анализируемой пробы. Качество этих данных определяется эффективностью разделения, поэтому внедрение в лабораторную практику капиллярных колонок существенно повысило ценность газовой хроматографии как метода качественного анализа.

Современная высокоэффективная газовая хроматография характеризуется чрезвычайно высокой воспроизводимостью определения времен удерживания. Это обусловлено прежде всего природой самих колонок. В насадочных колонках со временем насадка уплотняется, а следовательно, изменяется газопроницаемость колонки. Этого недостатка лишены кварцевые капиллярные колонки, которые имеют низкую теплоемкость, поэтому они быстро нагреваются и охлаждаются. Как правило, неподвижные фазы в кварцевых колонках иммобилизованы, что препятствует перераспределению фазы и снижает ее унос из колонки. Улучшенные характеристики капиллярных колонок стали стимулом для улучшения качества самих хроматографов в первую очередь в узлах термического и пневматического управления. Результатом стало появление более совершенных хроматографических систем.

Высокая воспроизводимость времен удерживания в современной газовой хроматографии для идентификации пиков позволяет использовать индексы удерживания Ковача, по предложению которого в качестве стандартного вещества сравнения используется нормальный углеводород. Каждому нормальному углеводороду присвоен индекс удерживания, равный числу атомов углерода в его молекуле умноженной на 100. Индексы удерживания для других соединений получают путем логарифмической интерполяции исправленных времен удерживания по уравнению:

, (1.29)

где N - число атомов углерода в молекуле н-алкана с меньшей молекулярной массой; n - разность чисел атомов углерода у двух н-алканов, между которыми расположено определяемое соединение.

Для того чтобы провести такую интерполяцию, необходимо знать времена удерживания стандартных соединений, которые часто определяют путем анализа смеси, содержащей только нормальные углеводороды. Проведение логарифмической, а не линейной интерполяции объясняется тем, что в условиях изотермической газовой хроматографии исправленные времена удерживания возрастают экспоненциально с ростом числа атомов углерода в молекуле.

По этой причине при анализе смесей, содержащих компоненты с широким диапазоном температур кипения, используют программирование температуры. При линейном программировании температуры времена удерживания компонентов гомологического ряда увеличиваются линейно с ростом числа атомов углерода. Идея использования для идентификации веществ индексов удерживания в сочетании с программированием температуры была предложена Ван ден Дулом и Кратцем. Расчет индексов удерживания упрощен, так как проводится линейная интерполяция, и можно использовать неисправленные времена удерживания

, (1.30)

где T, T₍_N₎и T₍_N₊_n₎- температуры удерживания определяемого компонента и двух н-алканов, между которыми находится определяемый компонент.

Система индексов удерживания Ковача (в изотермических условиях) имеет следующие преимущество: индексы удерживания зависят от типа неподвижной фазы и температуры. Это облегчает сопоставление величин удерживания, найденных в различных лабораториях. Напротив, сопоставление индексов удерживания определенных в условиях программирования температуры, требует обязательного точного соблюдения параметров эксперимента: размеров колонки, типа газа-носителя, его объемной скорости и профиля программирования температуры.

С помощью уже известных индексов удерживания можно провести идентификацию соединений. Составлены специальные библиотеки табличных данных по индексам удерживания. Так, например, создана база данных индексов удерживания 2000 соединений, полученных с использованием четырех неподвижных фаз [Sprouse J.F., Varano A.1984. Amer. Lab., 16, 54-68.]. Эта база данных специально предназначена для работы с пакетами программ, осуществляющих расчеты и автоматический поиск в базе данных.

Аналогичный принцип лежит в основе использования гибридных методов, сочетающих капиллярную газовую хроматографию и масс-спектрометрию или ИК-спектрометрию. Данные, получаемые при сочетании нескольких методов, более надежны, чем те, которые основаны на применении одного метода.

Количественный анализ с использованием капиллярных колонок по точности не уступает анализу на насадочных колонках. Применение капиллярных колонок позволяет улучшить разделение, уменьшить продолжительность анализа и достигнуть более высокой чувствительности. Однако результаты анализа зависят от выбранного метода ввода пробы, который в свою очередь определяется типом анализируемой пробы и имеющимся в наличии оборудованием. Прямой ввод пробы используется для колонок, внутренний диаметр которых составляет не менее 0, 5 мм. Применение колонок меньшего диаметра обуславливает использование более совершенных систем ввода пробы. Ввод пробы без деления потока используется при определении следовых количеств; при определении макрокомпонентов применяют ввод пробы с делением потока. Непосредственный ввод пробы в колонку универсален и особенно удобен при определении соединений низкой летучести.

Оптимальное проведение анализа при введении пробы с делением потока, характеризуется понятием “линейности”. Линейность - это линейная зависимость сигнала системы от концентрации или количества введенного вещества. Критерий линейности предполагает следующее:

1. Относительный размер пика, полученный при вводе пробы с делением потока, должен быть идентичен размеру пика, полученному без деления потока или рассчитанному.

2. Площадь пика компонента смеси должна быть пропорциональна концентрации последнего, а также объему введенной пробы.

3. Площадь пика должна быть обратно пропорциональна коэффициенту деления потока.

Желательно, чтобы линейность выполнялась при проведении количественного анализа, однако на практике достигнуть этого удается не всегда.

Определение следовых количеств методом капиллярной хроматографии основано на введении пробы без деления потока или непосредственным вводе в колонку. При вводе пробы без деления потока испарение ее должно произойти практически мгновенно, однако и в этом случае данные могут искажаться за счет различий в молекулярной массе определяемых веществ. Ввод пробы непосредственно в колонку, осуществляемый при относительно низких температурах, позволяет получать более правильные и воспроизводимые данные. Кроме того, в этом случае можно определять термически неустойчивые соединения, которые разлагаются в нагреваемом узле ввода пробы. Ввод пробы без деления потока обладает одним преимуществом по сравнению с непосредственным вводом: в первом случае тяжелые не испарившиеся компоненты остаются в легко очищаемом узле ввода, во втором - накапливаются в колонке.

Необходимо также внимательно отнестись к выбору детектора. В большинстве случаев предпочтение отдают пламенно-ионизационному детектору, поскольку он характеризуется высокой чувствительностью и линейностью сигнала в широком интервале концентраций. При определении следовых количеств желательно использовать селективные детекторы - электроннозахватный и пламенно-фотометрический. При тщательной оптимизации условий анализа эти детекторы обеспечивают очень высокую чувствительность определения. Однако при использовании этих детекторов, как правило, имеет место нелинейность сигнала, поэтому для получения точных результатов необходимо проводить многоуровневую градуировку.

Гибридные методы

Хромато-масс-спектроскопия (ХМС) - гибридный метод анализа, сочетающий капиллярную газовую хроматографию и масс-спектрометрию.

Масс-спектрометры используются в качестве детекторов в газовой хроматографии уже около 30 лет. За это время повысилось качество масс-спектрометров и появилась возможность получать надежные и воспроизводимые аналитические данные. При этом стоимость выпускаемых серийно масс-спектрометров существенно уменьшилась.

Современный хромато-масс-спектрометр позволяет проводить анализ сложной смеси из нескольких десятков компонентов в течение 30 мин. За такое короткое время химик-аналитик получает полную количественную и качественную информацию об анализируемой смеси. ХМС позволяет охарактеризовать полученный в результате анализа газохроматографический пик соответствующим масс-спектром, который затем может быть сопоставлен с масс-спектром из библиотеки спектров, хранящихся в базе данных. Система обработки данных позволяет сравнить стандартный спектр известного соединения с неизвестным спектром. В качестве дополнительной информации о структуре выдаются данные о коэффициенте корреляции между библиотечным спектром и спектром анализируемого соединения.

Возможности ХМС обусловлены сочетанием разделительной способности капиллярной газовой хроматографии, идентификации анализируемых соединений по специфичным масс-спектрам и количественной оценки по площадям пиков. По сравнению с другими детекторами масс-спектрометр более универсален и позволяет детектировать любые органические соединения с высокой чувствительностью.

Масс-спектрометрия это метод анализа вещества путем определения отношения массы к заряду m/z и относительного количества ионов, получаемых при ионизации исследуемого вещества или уже присутствующих в изучаемой смеси. Совокупность значений m/z и относительных величин токов этих ионов, представленная в виде графика или таблицы, называется масс-спектром вещества.

На рис. 16 представлен масс-спектр ацетона, полученный при ионизации электронным ударом. В масс-спектре имеются три основных полосы, соответствующие образованию молекулярного иона (m/z=58), основным пиком (m/z=43) и пиком метильной группы (m/z=15).

Рис. 16. Масс-спектр ацетона, полученный путем ионизации электронным ударом, с пиком молекулярного иона (m/z 58), основным пиком (m/z 43) и пиком метильной группы (m/z 15).

Для разделения ионов исследуемого вещества по величине m/z, измерения этих величин и токов разделенных ионов используют масс-спектрометр, который состоит из 5 основных частей: 1) устройства ввода пробы, выходящей из разделительной колонки хроматографа; 2) ионного источника: 3) анализатора масс; 4) детектора: 5) системы управления и обработки данных (рис. 17). 2 - 4 блоки прибора находятся под глубоким вакуумом.

Вакуум в газохроматографической колонке не создается, поэтому стыковка газового хроматографа с масс-спектрометром представляет собой сложную задачу из-за различия давлений, которые требуются для успешного функционирования каждого из приборов. Было разработано несколько устройств для ввода пробы, позволяющих переходить от высокого давления на выходе из хроматографической колонки к низкому давлению масс-спектрометра и обеспечивающих минимальные потери анализируемых веществ.

Рис. 17. Схема массспектрометра с ионным источником электронного удара, квадрупольным анализатором масс, электронным умножителем непрерывного динодного типа

В качестве ГХ - МС интерфейсов использовали главным образом 1) мембраны из силиконовой резины, 2) эффузионные трубки и 3) молекулярный струйный сепаратор. В настоящее время чаще всего используется струйный сепаратор, принцип действия которого основан на законе сохранения количества движения. В сепараторе молекулы гелия отделяются от более тяжелых молекул анализируемой смеси (рис. 18). Выходное отверстие сопла имеет очень маленький диаметр, поэтому скорость газового потока, выходящего из колонки ГХ, близка к сверхзвуковой. Анализируемое вещество, обладающее большим количеством движения, проходит расстояние между двумя соплами, а наиболее легкие молекулы гелия отклоняются от прямолинейного движения и откачиваются насосом.

Струйные сепараторы успешно используются для стыковки насадочных и капиллярных кварцевых колонок большого диаметра (> 0, 5 мм) с масс-спектрометром. Капиллярные колонки меньшего диаметра имеют низкую объемную скорость газового потока, что упрощает ее стыковку с масс-спектрометром.


Рис. 18. Схема молекулярного струйного сепаратора: · - молекулы сорбата, o - гелий	Рис. 19. Схема открытого ввода с делителем потока для подсоединения капиллярных колонок к масс-спектрометрам.

В настоящее время кварцевые колонки подсоединяют к масс-спектрометру либо напрямую, либо посредством открытого ввода с делителем потока. Непосредственное подсоединение капиллярной колонки к ионному источнику это простейший вариант стыковки ГХ - МС, который используется для капиллярных колонок с диаметром, не превышающим 0, 2 мм. Применение колонок с большим диаметром требует высокопроизводительных систем создания вакуума.

При использовании открытого ввода с делителем потока в масс спектрометр попадает только определенная часть потока. Вакуум в газохроматографической колонке не создается, и ее разрешающая способность остается неизменной. Это устройство было разработано специально для колонок с диаметром не превышающим 0, 35 мм. На рис. 19 представлена схема открытого ввода с делением потока и показаны направления газовых потоков. Дополнительный поток газа-носителя проходит коаксиально выходу из колонки и создает гидравлическое соединение. Поток газа на продувку способствует тому, что вспомогательный газ компенсирует любые отклонения в потоке, выходящем из колонки.

Для получения ионов в масс-спектро-метрах наиболее часто используются ионизация посредством электронного удара, схема которого представлена на рис. 20. Современные библиотеки масс-спектров содержат более 120000 спектров, полученных с ионизацией электронным ударом. Самой обширной библиотекой данных является коллекция масс-спектров EPA/NIH, которая используется для

Рис. 20. Схема ионного источника электронного удара.

сопоставления и идентификации спектров при анализе лекарственных средств и объектов окружающей среды.

Для разделения ионов, образовавшихся в ионизаторе, используются анализаторы масс пяти основных типов: 1) магнитные, 2) электростатические, 3) времяпролетные, 4) ионно-циклотронного резонанса и 5) квадрупольные. Наибольшее распространение получили магнитные и квадрупольные анализаторы. С помощью именно этих анализаторов получена большая часть масс-спектров, составляющих библиотеки.

Разделение ионов по массам в наиболее популярном квадрупольном анализаторе осуществляется за счет различного поведения ионов в поле постоянного и высокочастотного тока (рис. 21). Масс-спектр получают при прохождении иона через поле и регистрации тока ионов при попадании детектор.

Рис. 21. Схема квадрупольного масс-анализатора: 1 - высокочастотный генератор; 2 - генератор постоянного напряжения; 3 - генератор развертки; 4 и 5 - источник и детектор ионов.

Квадрупольный масс-анализаторпредставляет собой квадрупольныйконденсатор, к парам параллельных стержней которого приложены постоянное напряжение V и переменное высокочастотное V₀_×coswt (w - частота, t - время); их суммы для каждой пары равны по величине и противоположны по знаку. Ионы, вылетевшие из ионного источника, движутся к камере анализатора вдоль оси z, параллельной продольным осям стержней, по сложным спиралевидным траекториям, совершая поперечные колебания вдоль осей x и y. При фиксированных значениях частоты и амплитуды переменного напряжения ионы с определенными значениями m/z проходят через квадрупольный конденсатор и попадают в детектор, у ионов с др. значениями m/z амплитуда поперечных колебаний достигает такой величины, что они ударяются о стержни и разряжаются на них. Развертка масс-спектра производится путем изменения постоянного и переменного напряжений или частоты.

В масс-спектрометрах наибольшее распространение в качестве детекторов получили электронные умножители дискретного динодного и непрерывного динодного типов. Оба этих устройства обеспечивают высокие значения усиления (10⁷), что позволяет детектировать чрезвычайно малые ионизационные токи (порядка фемтоампер). Возможность детектирования малых токов определяет очень высокую чувствительность масс-спектрометров как детекторов для ГХ. Большинство квадрупольных масс-спектрометров обеспечивает детектирование пиктограммовых (10^-12) количеств летучих веществ.

Возможность получать с помощью ХМС количественную информацию об анализируемом объекте достигается двумя путями, Во-первых, можно определить сумму всех сигналов ионного тока и получить зависимость ионного тока от времени. Во-вторых, можно выделить любой ионный ток для выбранного фрагмента и получить дополнительные зависимости. Эти зависимости называют соответственно общим ионным током и профилем тока выбранного иона. На практике чаще используют сигнал общего ионного тока. Полученные сигналы могут быть обработаны как ГХ-сигналы, имеющие определенные времена удерживания и интегральные площади. Так же, как и в ГХ, можно по измеренным площадям сигналов количественно охарактеризовать исследуемый объект с высокой степенью точности и воспроизводимости. На рис. 22. В качестве примера приведены профиль общего ионного тока для стандартной лекарственной смеси и выделенные ионные профили молекулярных ионов каждого соединения.

Рис. 22. Профиль общего ионного тока для стандартной лекарственной смеси кофеина, метадона, кокаина, кодеина, моноацетилморфина и героина и выделенные ионные профили молекулярных ионов каждого соединения.

Возможности применения ХМС для анализа органических веществ практически неограниченны. Этот метод с одинаковым успехом используется как в исследовательских работах, так и при проведении рутинных определений качества веществ и контроля содержания токсичных веществ в объектах окружающей среды. При этом продолжительность анализа составляет всего несколько минут, что делает хромато-масс-спектроскопию на сегодняшний день наиболее эффективным аналитическим методом.

Кроме ХМС в исследовательской практике используется также сочетание высокоэффективной газовой хроматографии с инфракрасной (ИК) спектроскопией, которое представляет собой мощное для получения специфической информации о молекулах анализируемых веществ. Под действием ИК-излучения возбуждаются деформационные и валентные колебания молекул вещества. Эти колебания являются характеристическими для функциональных групп анализируемой молекулы. Проводя интерпретацию спектров вручную или используя библиотеки спектров, можно идентифицировать хроматографируемые соединения по их ИК-спектрам.

Приборы для ИК-спектроскопии выпускаются промышленностью уже более 50 лет. В первых ИК-спектроскопах использовалось светорассеивание, а для разделения ИК-излучения на узкие полосы в них применяли призмы или дифракционные решетки. Затем последовательно облучали анализируемый образец полученными узкими полосами. Такой способ позволял осуществлять сравнительно медленное механическое сканирование. В современных ИК-спектрометрах с преобразованием Фурье вместо призмы или решетки использется интерферометр. В результате практически мгновенно происходит сканирование по всему ИК-диапазону. Это дало возможность подключать ИК-спектрометры непосредственно к капиллярным газовым хроматографам.

ИК-спектроскоп незаменим при идентификации соединений, имеющих сходное строение. Сочетание ИК-спектроскопии и масс-спектрометрии позволяет получить об анализируемом соединении дополняющие друг друга сведения и провести качественный анализ с высокой степенью надежности. Это можно продемонстрировать на примере определения амфетамина и метамфетамина. Масс-спектры этих веществ практически одинаковы, однако ИК-спектры сильно отличаются.

Следует отметить сходство хроматограмм общего сигнала, полученных при ИК-детектировании, и хроматограмм общего ионного тока при МС-детектировании.

В заключение необходимо остановиться на различиях в терминах “гибридная хроматография” и “многомерная хроматография”. Иногда гибридные методы, такие как ГХ-МС и ГХ-ИК, относят к многомерным методам, даже если разделение проводится с помощью одной колонки. В этих методах используется многомерное детектирование, т.е. они многомерны с точки зрения получаемой информации. Однако их не следует считать многомерными с точки зрения хроматографирования, если оно осуществляется с помощью одной колонки.

В многомерной газовой хроматографии (МГХ) для проведения разделения, которое невозможно осуществить с помощью одной колонки, используют две или несколько соединенных колонок. Многомерная хроматография - это процесс, в котором проба проходит последовательно несколько стадий разделения. На каждой из них происходит разделение всей пробы или ее части, поступившей с предыдущей стадии, а используемые колонки различаются по селективности и (или) емкости.

Применение МГХ позволяет оптимизировать избирательность системы, при этом за минимальное время удается достичь максимального разделения компонентов пробы, содержащихся в ней в различных количествах.

⇐ Предыдущая 2 3 4 5 678 9 10 11 Следующая ⇒