Причины размывания хроматографических зон в ВЭЖХ

⇐ ПредыдущаяСтр 8 из 22Следующая ⇒

В ВЭЖХ, как и в газовой хроматографии, мерой интенсивности процессов размывания является высота эквивалентной теоретической тарелки (Н). Величина Н, согласно диффузионно-массообменной теории, определяется рядом частных процессов, каждый из которых вносит свой вклад в суммарную величину ВЭТТ. Изучение зависимости Н от скорости потока элюента U- важный инструмент анализа кинетико-динамических свойств хроматографических систем. Эта зависимость для ВЭЖХ также может быть выражена уравнением Ван-Деемтера, которое в упрощенной форме выглядит следующим образом:

. (2.1)

Однако в жидкостной хроматографии есть некоторые особенности.

Слагаемое А, как и в газовой хроматографии, соответствует вкладу в ВЭТТ неоднородности потока подвижной фазы, так называемой вихревой диффузии. Этому процессу отвечает составляющая ВЕТТ

, (2.2)

где d - размер частиц сорбента; l - фактор заполнения. Чем меньше размеры частиц, чем более однородны частицы сорбента по форме и размерам и чем более равномерно они упакованы, тем меньше А. Для качественно заполненных колонокв настоящее время достижимо значение А=1.

Второй член уравнения обусловлен только продольной диффузией молекул сорбата в жидкой фазе характеризует соответствующий вклад этого явления в высоту тарелки - H_{D, M}

, (2.3)

где D_{M, M} - коэффициент диффузии в подвижной (М) фазе; g - коэффициент извилистости, который учитывает затрудненность диффузии в подвижной фазе, расположенной между зернами сорбента (для обычных колонок g » 0, 6).

Влиянием второго члена уравнения Ван-Деемтера в жидкостной хроматографии можно пренебречь, если диаметр частиц равен 10 мкм, а линейная скорость превышает 2 мм/с.

Третье слагаемое C характеризует в целом кинетику массопередачи. Для пористых сорбентов НФ включает и тот объем элюента, который заключен в порах внутри частиц сорбента. Для современных сорбентов S_уд= 200 - 600 м²/г, объем пор составляет 0.2–0.9 мл на 1 мл упакованного слоя. Объем элюента между частицами (внешняя пористость) - примерно 0.4 мл. Элюент в порах практически неподвижен, т.к. диаметр пор в 100 - 200 раз меньше диаметра каналов между частицами. Поэтому даже в сквозных порах скорость движения элюента в 10000 - 40000 раз меньше, чем между частицами, но зато пути диффузии меньше. Массообмен между подвижной и неподвижной фазами для несорбирующихся веществ происходит за счет истинной диффузии, а для сорбирующихся веществ следует также учитывать массообмен между неподвижным элюентом и поверхностью твердого сорбента.

В жидкостной хроматографии, в отличие от газовой, продольная диффузия молекул сорбата в подвижной фазе сопоставима с диффузией в неподвижной фазе, т.е. величина D_{M, M} сопоставима с коэффициентом молекулярной диффузии в неподвижной фазе – D_{M, S}. Поэтому обычно в ВЭЖХ значения H_{D, M} не слишком отличаются от H_{D, S} – вклада в ВЕТТ продольной диффузии в неподвижной фазе.

В неподвижной фазе молекулы разделяемых соединений проводят время

, (2.4)

где k’ - коэффициент емкости. Величина t_S для разных веществ различна. Для неподвижной фазы, как и для подвижной, на основании уравнения Эйнштейна может быть получено

. (2.5)

Произведение Cu в уравнении Ван-Деемтера, также как и в газовой хроматографии, определяется конечной скоростью массопередачи. Для адсорбционной хроматографии составляющая ВЭТТ, связанная с конечной скоростью процессов адсорбции↔ десорбции, оценивается соотношением

, (2.6)

где К_А - константа скорости адсорбции.

Кроме того в ВЭЖХ кроме массопередачи в неподвижной фазе существенное влияние на размывание хроматографических пиков оказывает также кинетика массопередачи в подвижной фазе (например, кинетика процесса десольватации « сольватации молекул сорбата). Этот процесс также можно связать с диффузией молекул в подвижной фазе между частицами сорбента. Длину диффузионного пробега можно считать пропорциональной диаметру частиц сорбента, а соответствующий вклад в ВЭТТ составит

, (2.7)

где – коэффициент пропорциональности.

Наконец, важное значение имеет неравновесность процесса внутри застойных зон в набивной колонке. Связанное с этим увеличение ВЭТТ связано с размерами частиц сорбента и определяется выражением

, (2.8)

где – коэффициент, учитывающий константу сорбционного равновесия и геометрию насадки.

Каждый из рассмотренных процессов вносит свой вклад в суммарную величину ВЭТТ, согласно уравнению

H = H_H+ H_{D, M}+ H_{D, S}+ H_{K, A}+ H_{K, M}+ H_{S, S} (2.9)

Таким образом, перечисленные составляющие ВЭТТ представляют собой функцию линейной скорости потока подвижной фазы, а уравнение, связывающее H и u, по форме является уравнением Ван-Деемтера (2.1), в котором член А, как и для газовой хроматографии, соответствует вкладу неоднородности потока подвижной фазы (“вихревая диффузия”). В случае ЖХ член B/u представляет собой сумму слагаемых, связанных с продольной диффузией в подвижной и неподвижной фазах (H_{D, M} и H_{D,, S}), а член Cu - сумму слагаемых, учитывающих кинетику массопередачи в различных фазах (H_{K, A}, H_{K, M}, H_{S, S}). Значение С зависит исключительно от внутренних свойств сорбента: размера и формы пор, однородности их по размерам и форме и др. Для хорошего сорбента С = 0.03 – 0.07. Иначе говоря, при стабильном воспроизводстве методик заполнения решающим фактором в получении высокоэффективных колонок является качество сорбента.

Для полной характеристики качества колонок необходимо определить N в широком диапазоне линейных скоростей подвижной фазы, построить эмпирическую зависимость H от и и рассчитать коэффициенты A, В и C, используя типовые компьютерные программы.

На рис. 2.1 изображена кривая Ван-Деемтера, имеющая в общем случае вид гиперболы. В левой ее части, при малых линейных скоростях потока элюента, основной вклад в размывание хроматографических зон вносят процессы продольной диффузии. В средней части графика располагается область, соответствующая минимальному значению ВЭТТ и оптимальной величине линейной скорости потока. Эта область скоростей, в которой основной вклад в размывание пиков вносит “вихревая диффузия”, наиболее благоприятна для разделения, поскольку достигается максимальная эффективность колонки, а возможные незначительные изменения скорости потока существенно не ухудшают разделения. При дальнейшем увеличении скорости потока возрастает роль сопротивления массопередачи и ВЭТТ снова возрастает.

Рнс. 2.1. Графическое изображение уравнения Ван-Деемтера и вкладов отдельны х его членов в размывание зон

Анализ уравнений (2.2) – (2.9) позволяет выявить влияние некоторых факторов на эффективность работы колонок. Так, из (2.2) ясно, что для снижения Н необходимо использовать частицы сорбента меньшего размера. Кроме того, в члены, описывающие сопротивление массопередаче, размер частиц входит во второй степени, поэтому целесообразность уменьшения d для снижения величины H не вызывает сомнений. Однако использовать этот путь увеличения эффективности можно лишь до определенного предела, который диктуется техническими соображениями. Двухкратное уменьшение диаметра зерна приводит к четырехкратному увеличению давления для получения прежней скорости элюирования, согласно соотношению

, (2.10)

где r - параметр сопротивления потоку, DP - перепад давления, u- линейная скорость потока.

При повышенных давлениях резко возрастает стоимость и сложность оборудования. Поэтому размер частиц сорбента в настоящее время и, видимо, в будущем сохранится в пределах 3 - 10 мкм.

С целью сокращения продолжительности разделения на практике чаще всего используются линейные скорости потока, превышающие значение u_опт., а для оценки влияния u на Н при этих условиях часто пользуются упрощенной формой уравнения Ван Деемтера:

Н=А+Си (2.11)

В этой области кривой Ван-Деемтера, согласно уравнениям (2.7) и (2.8), положительное влияние на эффективность оказывает увеличение коэффициента диффузии в подвижной фазе. Поэтому, если позволяют чисто химические соображения, следует предпочитать подвижные фазы, обладающие меньшей вязкостью.

Сорбенты

Становление ВЭЖХ в значительной мере связано с созданием новых поколений сорбентов с хорошими кинетическими характеристиками и разнообразными термодинамическими свойствами.

В классической колоночной хроматографии, как правило, используются сорбенты с частицами диаметром 30-200 мкм. На основе таких материалов можно получать колонки эффективностью до нескольких тысяч теоретических тарелок на 1 м длины. Уже такой эффективности достаточно было бы для решения множества аналитических и препаративных задач. Однако главный недостаток крупнозернистых сорбентов — большая длина пути диффузии внутри зерен. Поэтому потенциальная эффективность таких колонок если и реализуется, то лишь при малых линейных скоростях подвижной фазы. В классической колоночной хроматографии используются разнообразные по химической природе типы сорбентов, но лишь некоторые из них оказались пригодными в качестве основы для разработки материалов ВЭЖХ. Наиболее популярен из них силикагель. Другие типы материалов (окись алюминия, углеродные сорбенты) в течение последних десятилетий используются все реже. Современные материалы для ВЭЖХ имеют параметры, оптимизированные с точки зрения кинетики процесса. Их свойства и методы получения детально рассмотрены в специальной литературе, поэтому ограничиваемся лишь той информацией, которая нужна хроматографисту-практику в первую очередь.

Основной путь улучшения кинетических характеристик сорбентов — уменьшение толщины активного слоя. Достичь этого в принципе можно двумя путями. Первый из них основан на применении так называемых пелликулярных, или поверхностно-пористых сорбентов. Их частицы состоят из непористого ядра и активного поверхностного слоя (рис. 2, а). Сорбенты этого типа получили наибольшее распространение в 60—70-е годы прошлого столетия. Они удобны в работе, и их упаковка не требует специальной техники или навыков. Колонкам, заполненным поверхностно-пористыми сорбентами, присуще небольшое сопротивление потоку, что было особенно важно в начальный период развития ВЭЖХ, когда насосы еще не достигли своего совершенства. Недостаток этих сорбентов — в низкой сорбционной емкости колонок, так как лишь часть объема, занятого сорбентом, участвует в хроматографическом процессе.

Уменьшить толщину активного слоя можно и другим способом — уменьшением диаметра частиц обычного сорбента, пронизанного порами на всю его толщину. Сорбенты такого типа называются объемно-пористыми, обычно размер их частиц 3—10 мкм (рис. 2.6). Естественно, такие материалы создают значительно большее сопротивление потоку подвижной фазы в колонке, и рабочее давление последней значительно выше, чем при использовании пелликулярных сорбентов. Этот недостаток был особенно ощутим в первые годы развития ВЭЖХ, что заставило конструкторов создавать насосы для работы при давлениях 400 — 800 атм. Однако с течением времени значительно улучшилась однородность сорбентов по размеру частиц и оказалось, что такие давления вовсе не нужны. Современные колонки ВЭЖХ, заполненные сорбентами этого типа, работают, как правило, при давлениях 50—150 атм.

Рис. 2.2. Схематическое изображение частиц пелликулярных (а) и объемно-

-пористых (б, в) сорбентов.

При использовании объемно-пористых сорбентов объем активной неподвижной фазы максимален, благодаря чему ВЭЖХ приобрела не только аналитическое, но и препаративное значение.

Технология упаковки колонок объемно-пористыми сорбентами постепенно совершенствовалась, и к настоящему времени эффективность колонок, выпускаемых лучшими фирмами, почти достигла теоретического предела. Современные колонки, заполненные объемно-пористыми сорбентами, превосходят таковые со старыми пелликулярными материалами как по скорости разделения и эффективности, так и большинству других показателей. В результате пелликулярные сорбенты почти вытеснены из аналитической практики и применяются сейчас только для заполнения вспомогательных колонок (форколонок), позволяющих продлить срок службы основных.

В адсорбционной ВЭЖХосновной полярной неподвижной фазой является селикагель. Хроматография на силикагеле – нормально-фазовая хроматография, в которой неподвижная фаза более полярна, чем подвижная. Для формирования ПФ в этом варианте хроматографии в качестве растворителей применяют неполярные алифатические утлеводороды или дихлорметан, а в качестве модифицирующих добавок - спирты, простые ациклические и циклические зфиры, сложные эфиры, галогеналканы.

Полезные свойства силикагеля определяются возможностью получения материалов с заданным размером частиц, различными размерами пор сорбентов, разной удельной поверхностью и высокой механической прочностью. Поверхность селикагеля также можно модифицировать или покрыть пропитывающей средой.

Ведущие фирмы-производители выпускают десятки сортов силикагеля, пригодного для решения разнообразных задач разделения. Однако выбор элюента в ЖАХ играет более значимую роль, чем выбор неподвижной фазы. Меняя природу ПФ, можно в широких пределах изменять объемы удерживания и селективность разделения на одних и тех же адсорбентах.

Силикагель SiО₂∙ хH₂О имеет аморфную структуру, его внутренняя поверхность энергетически неоднородна из-за наличия нескольких типов силанольных ОН-групп (рис. 2.3). Кроме ОН-гpyпп, в адсорбционных процессах участвуют и поверхностные силоксановые группы ≡ Si-O-Si≡. Присутствующая в силикагеле вода удерживается в нем в результате взаимодействия с поверхностными силанольными группами и за счет капиллярной конденсации.

Рнс. 2.3. Различные типы гидроксильных групп на поверхности селикагеля: а) свободная ОН-группа; б) связанная ОН-группа; в) геминальная ОН-группа; г) реакционноспособная ОН-группа

Сорбция разделяемых соединений определяется их способностью взаимодействовать с поверхностными силанольными (º Si—ОН) и силоксановымн ( º Si—О—Si º ) группами. ЖАХ основана на конкурентном взаимодействии полярных групп вещества и молекул растворителя с активными центрами адсорбента на его внутренней поверхности. Поверхность селикагеля, находящегося в равновесии с подвижной фазой, всегда покрыта более или менее прочно связанным адсорбционным слоем. Если подвижная фаза содержит два или более компонентов, то состав адсорбционного слоя отличается от состава в объеме подвижной фазы. Адсорбция молекулы сорбата может происходить с вытеснением одной или нескольких молекул адсорбированного слоя или без него. Главную роль в процессах взаимодействия молекул сорбата с адсорбционными слоями и поверхностью твердого адсорбента играют ион-дипольные и диполь-дипольные взаимодействия. Селективность разделения в ЖАХ определяется не только межмолекулярным взаимодействием молекул данного сорбата, но и межмолекулярными взаимодействиями молекул ПФ как с адсорбентом, так и с молекулами сорбата, находящимися как на поверхности адсорбента, так и в адсорбционном слое и в объеме элюента.

Наблюдаются следующие закономерности при адсорбции полярных веществ на силикагеле. Удерживание возрастает: а) с увеличением полярности сорбата; б) с уменьшением числа атомов углерода в его молекуле; в) по мере уплощения молекулы и при увеличении числа π -эдектронов (для полиядерных соединений). Удерживание уменьшается; а) с увеличением степени экранирования полярных групп сорбата орто-заместителями; б) при увеличении полярности подвижной фазы; в) по мере дегидроксилирования поверхности адсорбента.

Полярность сорбата определяется числом и характером полярных функциональных групп. Ниже приведены рады функциональных групп органических веществ, расположенных в порядке возрастания адсорбируемости на силикагеле:

-СН₂- < -СН₃ < -СН=СН- < -S-R < -O-R < NO₂ < -NH- (карбазол) < -C(О)OR <

< -С(О)Н < -C(О)R < -ОН < -NH₂ < -С(О)ОН.

F-< С1-< Вг-< I-< -OR < -NR₂< -NО₂ < -C(О)ОR < C(О)R < -C(О)H < NH₂ <

< NHC(O)R < -OH < -C(O)OH < -SO₃H.

Некоторые несоответствия в двух приведенных выше эмпирических рядах показывают, что они носят приблизительный характер, поскольку существуют различия между алифатическими и ароматическими соединениями, имеет место влияние дипольного момента и поляризуемости молекулы, стерический факторы, кислотность адсорбента, пол яр (ость и селективность подвижной фазы.

ЖАХ на силикагеле обеспечивает наибольшую селективность при разделении соединений, имеющих различные функциональные группы и различное число таких групп. В то же время разделение веществ гомологов и вообще веществ по молекулярной массе в силу специфического механизма удерживания в этом варианте хроматографии не эффективно. Разделение членов гомологического рада достигается только для первых членов и быстро надает с ростом числа метиленовых групп. Ограничением метода является растворимость сорбатов, они должны удовлетворительно растворяться в органических растворителях. Хроштографическая система в ЖАХ очень чувегвительна к влаге, медленно стабилизируется, поэтому

Большую популярность с 1971 г. приобрели химически модифицированные силикагели. Принцип их получения чаще всего заключается в обработке поверхности силикагеля органилгалогенсиланами ( см. рис. 2.3).

В зависимости от природы органического радикала R могут быть получены разные сорбенты. Условно химически модифицированные силикагели можно отнести к одной из двух групп — сорбентам общего назначения либо сверхселективным.

Выпуск сорбентов первой группы в настоящее время широко освоен в промышленном масштабе. В качестве органических радикалов чаще всего используют следующие:

— СН₃ - (C₁) - метилсиликагель, применяется в обращенно-фазовом режиме обычно для разделения высокомолекулярных веществ;

— (СН₂)₇СН₃ - (С₈) - октилсиликагель, занимает среднее положение в ряду неполярных сорбентов С₁ - С₁₈. Может быть использован для ориентировочного разделения смесей неизвестного состава;

— (CH₃)₁₇CH₃ - (C18, ODS) - октадецилсиликагель, предназначен для разделения широкого круга веществ от умеренно- до высокополярных. Сорбент пригоден для работы в режиме ион-парной хроматографии. Обладает высокой селективностью по отношению к гомологам;

Рис. 2.3. Схема получения химически модифицированных силикагелей с помощью а) моно-, б) ди-, в) трихлорсиланов.

— СН₂С₆Н₅ и — СН(С₆H₅)₂ - (фенил - и дифенилсиликагель) - по сравнению с другими неполярными сорбентами менее селективен по отношению к гомологам. Может быть рекомендован преимущественно для разделения веществ различных классов, в особенности оснований;

— (CH₂)₃NH₂ - (NH₂, аминосиликагель) - используется для обращенно- и нормально-фазовой хроматографии. В водных подвижных фазах сорбент может, найти применение как слабый анионообменник для разделения кислот; часто используется для хроматографии сахаров в водно-органических системах. Следует избегать использования сорбатов, содержащих альдегидные или кетогруппы, которые могут образовывать с аминогруппами сорбата шиффовы основания;

¾ (CH₂)₃CN - (CN, нитрилсиликагель) - может быть использован в системах с водными и органическими подвижными фазами; в последнем случае напоминает по свойствам силикагель, однако присутствие нитрильной группы изменяет селективность этого материала по сравнению с исходным силикагелем;

¾ (CH₂)₃― OCH₃― CH― CH₃― OH (OH, диол) - по селективности значительно отличается от немодифицированного силикагеля;

— (CH₂)N⁺R₃ - (SAX) - сильный анионообменник, используется для разделения кислот;

¾ (СН₂)SO₃H - (SCX) - сильный катионообменник, используется для разделения оснований.

Успехи в области химической модификации силикагеля дают возможность многим исследователям проводить целенаправленный синтез материалов, обладающих определенными свойствами. К настоящему времени в литературе описаны многие десятки разнообразных органических лигандов. Однако лишь незначительная их доля (кроме перечисленных выше) включается в программу фирм-производителей сорбентов. Это, несомненно, объясняется тем, что на уже освоенных в массовом производстве нескольких типах сорбентов можно успешно решать 99% всех возникающих задач. Все же иногда выбор оригинального лиганда может придать сорбенту качественно новые свойства. Например, модификация оптически активными радикалами позволяет разделять на полученном хиральном сорбенте рацематы некоторых родственных лиганду веществ.

При выборе неподвижной фазы для разделения той или иной смеси необходимо исходить в первую очередь из свойств разделяемых соединений. Полярность разделяемых веществ непосредственно сказывается на их растворимости в растворителях различных классов, поэтому она служит первым критерием выбора. Одновременно следует иметь в виду, что часто возможно решение одной и той же задачи на сорбентах различных типов и что сорбционные свойства материала иногда могут радикально изменяться в зависимости от характера подвижной фазы. Одна из возможных схем выбора представлена на рис. 2.4.

Наименее полярные органические соединения — углеводороды, их галогензамещенные производные, а также кислородсодержащие соединения с большими алифатическими радикалами, как правило, хорошо растворимы в гексане. Вещества этой группы, довольно слабо удерживаются силикагелем, и для их хроматографии потребовались бы очень малополярные подвижные фазы. Однако силикагель медленно уравновешивается такими растворителями, и получить достаточно стабильные величины удерживания непросто. Потому для сорбатов этого типа можно рекомендовать обращенно-фазовую хроматографию. В качестве подвижной фазы необходимо брать растворы, содержащие 0 - 30% воды в ацетонитриле или метаноле, а для наименее полярных сорбатов (например, триглицериды, высшие полиядерные ароматические углеводороды) — смеси ацетонитрила с хлороформом либо хлористым метиленом.

Органические соединения промежуточной полярности растворяются в сложных эфирах, спиртах, хлороформе. Эти вещества имеют в составе молекул функциональные группы, способные к довольно сильному взаимодействию с силанольными группами силикагеля, полярными функциональными группами химически модифицированных силикагелей. Подвижные фазы для хроматографии на этих сорбентах содержат 2—50 % полярного органического растворителя в смеси с менее полярными (углеводороды, галогенуглеводороды). Равновесие между силикагелем и такими растворами устанавливается быстро, и оно довольно устойчиво. Поэтому результаты хроматографирования обычно с легкостью воспроизводимы. Разделение на силикагеле более селективно по отношению к пространственной структуре сорбатов, в силу чего нормально-фазовая хроматография наиболее предпочтительна, если предстоит разделение изомеров.

Рис. 2.4. Схема выбора неподвижной фазы для разделения низкомолекулярных органических соединений.

Многие полярные органические соединения растворимы в воде, и потому для них обычно используют обращенно-фазовую хроматографию. Подвижная фаза содержит 0—50 % органического растворителя (метанол, ацетонитрил) в воде. Соединения выходят из колонки и порядке убывания полярности. Если сорбаты ионизированы в водных растворах, с целью улучшения формы пика и воспроизводимости результатов в подвижную фазу добавляют соли, кислоты, буферные растворы для поддержания необходимой ионной силы и рН.

Для ионогенных соединений существуют и другие варианты выбора хроматографической системы. Во-первых, это ионообменная хроматография на материалах, которые по химизму взаимодействия повторяют классические иониты. Недостатком такого режима является сравнительно невысокая эффективность разделения. Подвижная фаза, как правило, представляет собой буферный раствор. Его рН и ионная сила подбираются таким образом, чтобы обеспечить желаемые значения констант сорбции. Другой режим разделения ионогенных соединений — так называемая ион-парная хроматография. Методически суть ее сводится к тому, что в обычную обращенно-фазовую систему добавляют гидрофобные ионы, имеющие заряд, противоположный по знаку заряду разделяемых ионов. Этот прием позволяет получить пики ионогенных соединений почти идеальной формы, что редко достигается при обычной обращенно-фазовой или ионообменной хроматографии соединений данной группы.

Растворители

Общая характеристика

Подвижная фаза в жидкостных хроматографических системах выполняет двоякую функцию. С одной стороны, она (подобно подвижной фазе в газовой хроматографии) служит для транспорта десорбированных молекул по колонке. С этой точки зрения химические свойства подвижной фазы не играют существенной роли, более важны их физические параметры: вязкость, летучесть и т.д. С другой стороны, в отличие от газохроматографических систем, подвижная фаза в жидкостной хроматографии играет активную, химическую по существу роль. Молекулы подвижной фазы взаимодействуют с другими компонентами системы: молекулами разделяемых веществ и молекулами неподвижной фазы. Фактически константы сорбционного равновесия в системе определяются характером подвижной фазы ничуть не менее, чем характером сорбента. Более того, во многих случаях компоненты подвижной фазы способны к прочной сорбции, что приводит к образованию на поверхности слоя, существенно изменяющего свойства неподвижной фазы. Поэтому вторая, и более важная, функция подвижной фазы сводится к регулированию констант равновесия, величин удерживания. Возможности регулирования удерживания с помощью подвижной фазы необычайно широки. Нередко заменой одного растворителя другим можно изменить коэффициент емкости в 1000 – 10000 раз. Однако для практической хроматографии пригоден лишь довольно узкий диапазон величин - примерно между 1 и 20. Слишком малые значения непригодны, так как в этой области резко возрастает вероятность взаимного перекрывания пиков. Наоборот, при слишком больших константах сорбции и разделение требует значительного времени, к тому же увеличивается риск не обнаружить более прочно сорбирующиеся компоненты смеси.

Таким образом, для решения каждой конкретной задачи состав неподвижной фазы должен быть тщательно подобран с точки зрения физических и химических свойств ее компонентов.

Физические свойства

Современный хроматограф представляет собой весьма чувствительный комплекс механических, оптических, электрических и химических узлов, и его надежная работа во многом зависит от свойств и качества используемых растворителей.

Наличие в подвижной фазе механических примесей в первую очередь отрицательно сказывается на работе насоса, вызывая нечеткую работу клапанов, способствуя износу плунжеров и уплотнений. Кроме того, твердые частицы, накапливаясь на фильтре у входа в колонку, приводят к постепенному увеличению ее сопротивления, невоспроизводимости рабочего давления либо времени удерживания при использовании насосов постоянного расхода и постоянного давления соответственно. Поэтому перед использованием подвижная фаза должна быть профильтрована через материал с размером пор около 0, 5 мкм. Как правило, повторная фильтрация осуществляется уже в хроматографе, при отборе растворителя из резервуара.

Надежная работа насоса также сильно зависит от летучести используемых растворителей. При резком всасывании в камере насоса даже предварительно дегазированные растворители иногда образуют паровые пузыри, препятствующие работе клапанов. Этот эффект наиболее выражен у таких легколетучих растворителей, как пентан, ацетон, метиленхлорид и диэтиловый эфир. Кроме того, подвижные фазы, содержащие эти вещества, могут изменять свой состав в ходе использования из-за испарения, что приводит к невоспроизводимости величин удерживания. В связи с этим в практической работе следует избегать растворителей, кипящих при температуре ниже 60⁰С. С другой стороны, для менее летучих растворителей характерна более высокая вязкость, что отрицательно отражается на эффективности разделения и вынуждает использовать большие давления для достижения желаемой скорости разделения. Предельно допустимая вязкость подвижной фазы зависит от размера частиц сорбента и качества упаковки колонки. В качестве ориентира можно указать величину 1, 5 сП. При такой вязкости и линейной скорости подвижной фазы около 0, 4 см/с давление на входе качественной колонки не должно превышать 200 атм. Если все же обстоятельства вынуждают пользоваться более вязкими подвижными фазами, колонку следует термостатировать при повышенной температуре (например, 60⁰С).

Определенные требования к растворителям предъявляет используемый метод детектирования. При применении детекторов, основанных на поглощении света, подвижная фаза должна быть прозрачной в избранной спектральной области. Набор растворителе, прозрачных для УФ-света вплоть до 190-220 нм, довольно велик. Однако в каждом конкретном случае этот показатель определяется не столько физическими свойствами основного вещества, сколько содержанием УФ-поглощающих примесей. Поскольку содержание таких примесей часто не нормируется даже для растворителей квалификации «химически чистый», рекомендуется применять растворители специальных квалификаций – «для жидкостной хроматографии» или «для спектроскопии». При отсутствии готовых растворителей необходимого качества их следует тщательно очистить в лаборатории с помощью подходящих методов. Чувствительность рефрактометрического детектора зависит от разности коэффициентов преломления подвижной фазы и анализируемых соединений. На этом основании для большинства случаев применения можно рекомендовать подвижные фазы с минимальными величинами коэффициентов преломления. Характеристики растворителей, наиболее важные с хроматографической точки зрения, приведены в табл.1.

⇐ Предыдущая 3 4 5 6 789 10 11 12 Следующая ⇒