Эпигенетическое репрограммирование генома

⇐ ПредыдущаяСтр 4 из 4

Развитие организма представляет собой циклы эпигенетического репрограммирования генома, которые обеспечивают процессы гаметогенеза, оплодотворения, формирования и размножения организма. В онтогенезе млекопитающих и человека выделяют 2 волны эпигенетического репрограммирования генома. Первая волна соответствует периоду гаметогенеза, вторая – дроблению оплодотворенной яйцеклетки и началу дифференцировки эмбриональных тканей (Reik, 2007; Lange, Schneider, 2010)

Первый раунд деметилирования ДНК происходит в первичных половых клетках во время заселения полового гребня. В дальнейшем реметилирование ДНК мужских и женских половых клеток осуществляется во время их созревания, что происходит в разные временные интервалы. К моменту оплодотворения характер метилирования гамет обоих типов схож с таковыми в соматических клетках. Исключение составляют импринтированные гены, в которых статус метилирования устанавливается в соответствии с полом особи (Carlson, 2009).

Второй раунд эпигенетического репрограммирования происходит после объединения материнского и отцовского геномов в оплодотворенной яйцеклетке. Сначала начинает снижаться уровень метилирования ДНК отцовского, а затем и материнского генома. В этом процессе задействованы механизмы как активного, так и пассивного деметилирования (Morgan et al., 2005). В результате геном зародыша полностью деметилируется, за исключением генов, импринтированных в гаметогенезе. Затем уровень метилирования генома прогрессивно нарастает на стадии первичной эмбриональной индукции - появление трофэктодермы (ТЭ) и начало дифференцировки внутренней клеточной массы (ВКМ).

В зиготах человека при сопоставлении степени метилирования родительских пронуклеусов и гомологичных метафазных хромосом показано гипометилирование отцовского генома (Fulka et al., 2004; Pendina et al., 2011; Xu et al., 2005). Предполагается, что такая асинхронность снижения уровня метилирования в родительских геномах является следствием процесса актиного деметилирования в отцовской ДНК. Сравнение уровней содержания 5-метилцитозина и 5-гидроксиметилцитозина в раннем эмбриогенезе млекопитающих проведено только на модельных объектах. В зиготах мышей, кроликов и коров был выявлен высокий уровень содержания 5-гидроксиметилцитозина в мужском пронуклеусе (Iqbal et al., 2011; Wossidlo et al., 2011). На стадии зиготы процесс превращения 5-метилцитозина в 5-гидроксиметилцитозин в мужском геноме катализирует фермент ТЕТ3, который присутствует в большом количестве в ооцитах и зиготах. Однако, несмотря на высокое содержание ТЕТ3, геном ооцитов не подвергается активному деметилированию (Wossidlo et al., 2011). Такая избирательность фермента связана с защитой от ферментативного деметилирования материнского генома с помощью белка Dppa3 (developmental pluripotency-associated 3, так же известен как Stella-белок и PGC) (Saitou et al., 2012).

Снижение уровня метилирования ДНК продолжается при последующих делениях дробления эмбрионов человека вплоть до стадии бластоцисты. Такое снижение уровня метилирования связано с истощением в ядре метилтрансферазы DNMT1, которая поддерживает метилирование CpG-динуклеотидов во время репликации ДНК. Поэтому при митотическом делении количество всей метилированной ДНК клетки после каждого раунда репликации уменьшается вдвое. Таким образом, на стадии двух бластомеров все хромосомы характеризуются асимметричным метилированием сестринских хроматид. Наличие 5-метилцитозина в этих хроматидах свидетельствует о том, что в деметилированном состоянии находятся не все последовательности ДНК (Pendina et al., 2011). Исключением остаются кластеры импринтированных генов, которые сохраняют свое метилированное состояние даже при удалении из ядра DNMT1.

На стадии четырех клеток у человека появляются хромосомы, у которых гипометилированы обе хроматиды. Сохранение низкого уровня метилирования ДНК в обеих хроматидах подтверждает предположение о том, что у человека некоторые последовательности сохраняют метилированное состояние цитозина при репликации (Pendina et al., 2011). Появление гипометилированных хромосом у человека совпадает с предположительным временем активации генома, которая происходит на стадии четырех-восьми бластомеров (Ефимова и др., 2012). В экспериментах на мышах установлено, что белковые продукты, контролируемые отцовским геномом, могут быть выявлены уже на стадии 2-х бластомеров (β ₂ микрогорбулин, гипоксантин-фосфорибозил трансфераза) и даже на стадии пронуклеусов (некоторые гены H2 локуса – гены Ped, контролирующие время наступления 1-го деления дробления) (Dyban, Baranov, 1987). К сожалению, сведений о начале экспрессии этих генов у зародышей человека, нет.

Дальнейшие деления дробления у человека также сопровождаются снижением уровня метилирования ДНК и увеличением количества гипометилированных хромосом. На стадии восьми клеток появляются единичные метафазные пластинки с сегмент-специфичным распределением 5-метилцитозина – чередованием гипер- и гипометилированных участков ДНК вдоль плеч хромосом, совпадающим с R/G сегментацией (Баранов и др., 2005; Ефимова и др., 2009; Пендина и др., 2005). Изменение характера распределения 5-метилцитозина в некоторых метафазных пластинках (Pendina et al., 2011) и высокий уровень содержания 5-метилцитозина в отдельных интерфазных ядрах (Fulka et al., 2004) на стадии восьми бластомеров свидетельствуют о начале процесса реметилирования ДНК.

После 3-4 делений дробления, то есть на стадии морулы, отмечается уплощение наружных бластомеров, изменяются их межклеточные контакты, происходит компактизация бластомеров. На этой стадии идет процесс первичной эмбриональной индукции - дифференцировка гомогенной массы бластомеров в клетки 2-х типов (внутренняя клеточная масса (ВКМ) и трофэктодерма (ТЭ)). При дальнейшем развитии из ВКМ образуются все ткани и органы собственно зародыша. Лежащие снаружи от ВКМ клетки ТЭ впоследствии сформируют цитотрофобласт хориона и плаценты. Большинство эпигенетических программ индивидуального развития начинает реализовываться именно на этой стадии эмбриогенеза.

На стадии бластоцисты у человека устанавливается характер метилирования ДНК, специфичный для ВКМ и ТЭ. Интерфазные ядра клеток внутренней клеточной массы гипометилированы по сравнению с ядрами клеток трофэктодермы (Fulka et al., 2004). У доимплантационных зародышей мышей наблюдается обратная картина: гипометилированное состояние характерно для клеток ТЭ, тогда как в метафазных хромосомах и ядрах из клеток внутренней массы высокий уровень метилирования ДНК (Fulka et al., 2004). На стадии бластоцисты происходит установление специфичного характера метилирования ДНК, что свидетельствует о завершении процесса репрограммирования генома зародыша. Такой характер метилирования ДНК сохраняется и при дальнейших делениях. Дифференцировка клеток внутренней клеточной массы с образованием трех зародышевых листков сопровождается установлением специфичного для каждого из них характера метилирования ДНК за счет локальных изменений. В результате формируются так называемые эпигеномы, которые определяют набор функционально активных генных комплексов, регулируют процессы дифференцировки и развитие зародыша (Ефимова и др., 2012).

Нарушения эпигенетического репрограммирования, в том числе обусловленные негативным влиянием внешних факторов, приводят к гибели эмбрионов или нарушениям развития (Haaf, 2006). Однако, многие ключевые процессы эмбриогенеза, такие оплодотворение, первые деления дробления, время активации генома и эпигенетическое репрограммирование, являются видоспецифичными (Hou et al., 2005; Fulka et al., 2006). Поэтому данные, полученные на модельных объектах, нельзя экстраполировать на человека.

Таким образом, эпигенетическим модификациям, в частности 5-mC и трем его кислородсодержащим производным – 5-hmC, 5-fC, 5-caC - принадлежит ведущая роль в установлении особых структурно-функциональных состояний хроматина, необходимых для правильной реализации программы индивидуального развития. Наибольший интерес представляет исследование характера метилирования ДНК и процесс деметилирования во время доимплантационного развития, когда происходят ключевые этапы эпигенетического репрограммирования генома. Недостаточность данных о репрограммировании генома в эмбриогенезе человека, связанная с трудностями изучения ранних стадий развития, обуславливает необходимость проведения дополнительных исследований в этой области.

Помимо волн эпигенетического репрограммирования генома, на доимлантационном этапе развития зародыша происходит и другая, «волна» изменения длины теломер. Она необходима для нормального перехода от высокоспециализированных половых клеток к тотипотентной зиготе и бластомерам первых делений дробления.

1.4. Теломеры и изменение их длины в ходе проэмбрионального и доиплантационного периодов развития млекопитающих и человека

Строение и функции теломер

Теломеры – нуклеопротеиновые комплексы на концевых участках эукариотических хромосом (Ozturk et al., 2013). Само слово «теломера» образовано от греческих «телос» - конец, и «мерос» - часть. История теломер началась в 30-40-х годах 20 века с обнаружения особых свойств концевых участков хромосом Германом Мёллером и Барбарой МакКлинток. Эти свойства заключались в том, что теломеры способны защищать от слияний хромосом концами (Muller, 1938; McClintock, 1941).

Позже было обнаружено, что теломеры защищают хромосомы от действия ферментов системы репарации ДНК (O'Sullivan, Karlseder, 2010), а также от нуклеазной деградации, поскольку нуклеазы распознают простые концы хромосом как двунитевые разрывы (Azzalin, Lingner, 2007). Таким образом, нарушение функций теломер приводит клетки к преждевременному старению, апоптозу и нестабильности генома (O'Sullivan, Karlseder, 2010). Поэтому с нарушениями работы теломер связан широкий спектр заболеваний человека, включая болезни сердца, язвенный колит, цирроз печени, атеросклероз, и ряд синдромов преждевременного старения (Oh et al., 2003; Samani et al., 2001; Wiemann et al., 2002).

Теломерная ДНК человека состоит из двухнитевого района, состоящего из повторов TTAGGG, который заканчивается 100-200 нуклеотидным однонитевым выступом на 3`конце (Riethman, 2008). В настоящее время существует ряд вопросов относительно того, в каком виде представлен этот выступ. Одни группы исследователей считают, что он представлен в виде четырехнитевых структур, образованных гуанином (Xu, Komiyama, 2013); другие – в виде т-петли (Doksani et al., 2013). Четырехнитевые гуаниновые структуры являются стопкой тетрад гуниновых нуклеотидов за счет формирования дополнительных водородных связей (Xu, 2011) (рис. 4 Б ). Т-петля представляет собой особую структуру, похожую на лассо, в которой 3`концевой выступ заворачивается внутрь двунитевого участка теломерной ДНК и так же стабилизируется водородными связями между нуклеотидами (Xu, 2011) (рис. 4 А ). Возможно, в теломерах одновременно существуют обе эти структуры и, согласно объединенной модели, обеспечивают тонкую регуляцию теломер в ответ на изменения условий окружающей среды (Xu, 2008) (рис. 4 В ).

Около 200 белков могут взаимодействовать с теломерами и влиять на их структуру (Dejardin, Kingston, 2009). Но основным является комплекс из 6 белков, называемый шелтерин (от анг. shelter – кров, убежище), связывающийся с повторами ТТАGGG теломер человека. 3 белка этого комплекса - TRF1, TRF2 и POT1 - напрямую распознают теломерные последовательности и связываются с другими, дополнительными белками – TIN2, TPP1, Rap1 (Xu, 2011) (рис. 4 Г ). Белок POT1 может взаимодействовать с теломерными последовательностями только в комплексе с TPP1. Такой комплекс TPP1-POT1 способен разрушать гуаниновые четырехнитевые структуры, что способствует посадке теломеразы и, в дальнейшем, удлинению теломеры (Zaug et al., 2005). Белок TRF2 способствует образованию т-петли и связывается с ней. Функции остальных белков либо неизвестны, либо выполняют вспомогательную роль для TRF2 и TPP1-POT1. В целом, комплекс шелтерин участвует в регуляции работы теломер и их защите (Xu, 2011).

Рис.4. Строение концевой части теломеры: А) Схематичное изображение т-петли. Б) Схематичное изображение 4-нитевой гуаниновой структуры. В) Схематичное изображение модели, сочетающей т-петлю и 4-нитевую гуаниновую структуру. Г) Строение связанного с теломерами комплекса шелтерин, состоящего из 6 белков. (по Xu, 2011)

⇐ Предыдущая 1 2 34