Свойства ДНК (репликация, репарация)

⇐ ПредыдущаяСтр 2 из 5Следующая ⇒

Одним из основных свойств материала наследственности является его способность к самокопированию - репликация. Это свойство обеспечивается особенностями химической организации молекулы ДНК, состоящей из двух комплементарных цепей. В процессе репликации на каждой полинуклеотидной цепи материнской молекулы ДНК синтезируется комплементарная ей цепь. В итоге из одной двойной спирали ДНК образуются две идентичные двойные спирали. Такой способ удвоения молекул, при котором каждая дочерняя молекула содержит одну материнскую и одну вновь синтезированную цепь, называют полуконсервативным.

Для осуществления репликации цепи материнской ДНК должны быть отделены друг от друга, чтобы стать матрицами, на которых будут синтезироваться комплементарные цепи дочерних молекул.

Инициация репликации осуществляется в особых участках ДНК. Они включают последовательность, состоящую из 300 нуклеотидных пар, узнаваемую специфическими белками. Двойная спираль ДНК в этих локусах разделяется на две цепи, при этом, как правило, по обе стороны от точки начала репликации образуются области расхождения полинуклеотидных цепей -репликационные вилки, которые движутся в противоположных от локуса ori направлениях. Между репликационными вилками образуется структура, называемая репликационным глазком, где на двух цепях материнской ДНК образуются новые полинуклеотидные цепи.

С помощью фермента геликазы, разрывающего водородные связи, двойная спираль ДНК расплетается в точках начала репликации. Образующиеся при этом одинарные цепи ДНК связываются специальными дестабилизирующими белками, которые растягивают остовы цепей, делая их азотистые основания доступными для связывания с комплементарными нуклеотидами, находящимися в нуклеоплазме. На каждой из цепей, образующихся в области репликационной вилки, при участии фермента ДНК-полимеразы осуществляется синтез комплементарных цепей В процессе синтеза репликационные вилки движутся вдоль материнской спирали в противоположных направлениях, захватывая все новые зоны.

Разделение спирально закрученных цепей родительской ДНК ферментом геликазой вызывает появление супервитков перед репликационной вилкой. Это объясняется тем, что при расхождении каждых 10 пар нуклеотидов, образующих один виток спирали, родительская ДНК должна совершить один полный оборот вокруг своей оси. Следовательно, для продвижения репликационной вилки вся молекула ДНК перед ней должна была бы быстро вращаться, что потребовало бы большой затраты энергии. В действительности это не наблюдается благодаря особому классу белков, называемых ДНК-топоизомеразами. Топоизомераза разрывает одну из цепей ДНК, что дает ей возможность вращаться вокруг второй цепи. Это ослабляет накопившееся напряжение в двойной спирали ДНК.

К высвобождающимся водородным связям нуклеотидных последовательностей разделенных родительских цепей присоединяются свободные нуклеотиды из нуклеоплазмы, где они присутствуют в виде дезоксирибонуклеозидгрифосфатов: дАТФ, дГТФ, дЦТФ, дТТФ. Комплементарный нуклеозидтрифосфат образует водородные связи с определенным основанием материнской цепи ДНК. Затем при участии фермента ДНК-полимеразы он связывается фосфодиэфирной связью с предшествующим нуклеотидом вновь синтезируемой цепи, отдавая при этом неорганический пирофосфат.

Поскольку ДНК-полимераза присоединяет очередной нуклеотид к ОН-группе в 3'-положении предшествующего нуклеотида, цепь постепенно удлиняется на ее 3'-конце.

Особенностью ДНК-полимеразы является ее неспособность начать синтез новой полинуклеотидной цепи путем простого связывания двух нуклеозидтрифосфатов: необходим 3'-ОН-конец какой-либо полинуклеотидной цепи, спаренной с матричной цепью ДНК, к которой ДНК-полимераза может лишь добавлять новые нуклеотиды. Такую полинук-леотидную цепь называют затравкой или праймером.

Роль затравки для синтеза полинуклеотидных цепей ДНК в ходе репликации выполняют короткие последовательности РНК, образуемые при участии фермента РНК-праймазы. Указанная особенность ДНК-полимеразы означает, что матрицей при репликации может служить лишь цепь ДНК, несущая спаренную с ней затравку, которая имеет свободный 3'-ОН-конец.

синтез второй цепи ДНК осуществляется короткими фрагментами (фрагменты Оказаки) также в направлении от 5' - к 3'-концу (по типу шитья " назад иголкой" ). У прокариот фрагменты Оказаки содержат от 1000 до 2000 нуклеотидов, у эукариот они значительно короче (от 100 до 200 нуклеотидов). Синтезу каждого такого фрагмента предшествует образование РНК-затравки длиной около 10нуклеотидов. Вновь образованный фрагмент с помощью фермента ДНК-лигазы соединяется с предшествующим фрагментом после удаления его РНК-затравки.

В связи с указанными особенностями репликационная вилка является асимметричной. Из двух синтезируемых дочерних цепей одна строится непрерывно, ее синтез идет быстрее и эту цепь называют лидирующей. Синтез другой цепи идет медленнее, так как она собирается из отдельных фрагментов, требующих образования, а затем удаления РНК-затравки. Поэтому такую цепь называют запаздывающей (отстающей). Хотя отдельные фрагменты образуются в направлении 5' → 3', в целом эта цепь растет в направлении 3' → 5'. В виду того, что от локуса oriкак правило начинаются две репликационные вилки, идущие в противоположных направлениях, синтез лидирующих цепей в них идет на разных цепях материнской ДНК. Конечным результатом процесса репликации является образование двух молекул ДНК, нуклеотидная последовательность которых идентична таковой в материнской двойной спирали ДНК.

Рассмотренная последовательность событий, происходящих в ходе репликативного синтеза, предполагает участие целой системы ферментов: геликазы, топоизомеразы, дестабилизирующих белков, ДНК-полимеразы и других, совместно действующих в области репликационной вилки.

Репликация ДНК у про- и эукариот в основных чертах протекает сходно, однако, скорость синтеза у эукариот (около 100 нуклеотидов/с) на порядок ниже, чем у прокариот (1000 нуклеотидов/с). Причиной этого может быть образование ДНК эукариот достаточно прочных соединений с белками, что затрудняет ее деспирализацию, необходимую для осуществления репликативного синтеза.

Фрагмент ДНК от точки начала репликации до точки ее окончания образует единицу репликации - репликон. Однажды начавшись в точке начала, репликация продолжается до тех пор, пока весь репликон не будет дуплицирован. Кольцевые молекулы ДНК прокариотических клеток имеют один локус on и представляют собой целиком отдельные репликоны. Эукариотические хромосомы содержат большое число репликонов. В связи с этим удвоение молекулы ДНК, расположенной вдоль эукариотической хромосомы, начинается в нескольких точках. В разных репликонах удвоение может идти в разное время или одновременно.

Репарация. Рассмотренный выше механизм репликации отличается чрезвычайно высокой точностью воспроизведения структуры ДНК. При удвоении ДНК ошибки возникают в среднем с частотой 1·10^-6комплементарных пар оснований.

В поддержании высокой точности репликации важная роль принадлежит прежде всего ферменту ДНК-полимеразе. Этот фермент осуществляет отбор необходимых нуклеотидов из числа имеющихся в ядерном соке нуклеозидтрифосфатов (АТФ, ТТФ, ГТФ, ЦТФ), точное присоединение их к матричной цепи ДНК и включение в растущую дочернюю цепь. Частота включения неправильных нуклеотидов на этой стадии составляет 1·10^-5пар оснований.

Такие ошибки в работе ДНК-полимеразы связаны с возникновением измененных форм азотистых оснований, которые образуют " незаконные" пары с основаниями материнской цепи. Например, измененная форма цитозина вместо гуанина связывается водородными связями с аденином. В результате в растущую цепь ДНК включается ошибочный нуклеотид. Быстрый переход измененной формы такого основания в обычную нарушает его связывание с матрицей, появляется неспаренный 3'-ОН-конец растущей цепи ДНК. В этой ситуации включается механизм самокоррекции, осуществляемый ДНК-полимеразой (или тесно связанным с ней ферментом - редактирующей эндонуклеазой). Самокоррекция заключается в отщеплении ошибочно включенного в цепь ДНК нуклеотида, не спаренного с матрицей. Следствием самокоррекции является снижение частоты ошибок в 10 раз (с 10^-5до 10^-6).

Несмотря на эффективность самокоррекции, в ходе репликации после удвоения ДНК в ней обнаруживаются ошибки. Особенно часто это наблюдается при нарушении концентрации четырех нуклеозидтрифосфатов в окружающем субстрате. Значительная часть изменений возникает также в молекулах ДНК в результате спонтанно происходящих процессов, связанных с потерей пуриновых оснований - аденина и гуанина (апуринизацией) - или дезаминированием цитозина, который превращается в урацил. Частота последних изменений достигает 100 на 1 геном/сут.

Содержащиеся в ДНК основания могут изменяться под влиянием реакционноспособных соединений, нарушающих их нормальное спаривание, а также под действием ультрафиолетового излучения, которое может вызвать образование ковалентной связи между двумя соседними остатками тимина в ДНК (димеры тимина). Названные изменения в очередном цикле репликации должны привести либо к выпадению пар оснований в дочерней ДНК, либо к замене одних пар другими. Указанные изменения действительно сопровождают каждый цикл репликации ДНК, однако их частота значительно меньше, чем должна была бы быть. Это объясняется тем, что большинство изменений такого рода устраняется благодаря действию механизма репарации (молекулярного восстановления) исходной нуклеотидной последовательности ДНК.

Механизм репарации основан на наличии в молекуле ДНК двух комплементарных цепей. Искажение последовательности нуклеотидов в одной из них обнаруживается специфическими ферментами. Затем соответствующий участок удаляется и замещается новым, синтезированным на второй комплементарной цепи ДНК. Такую репарацию называют эксцизионной, т.е. с " вырезанием". Она осуществляется до очередного цикла репликации, поэтому ее называют также дорепликативной.

Восстановление исходной структуры ДНК требует участия ряда ферментов. Важным моментом в запуске механизма репарации является обнаружение ошибки в структуре ДНК. Нередко такие ошибки возникают во вновь синтезированной цепи в процессе репликации. Ферменты репарации должны обнаружить именно эту цепь. У многих видов живых организмов вновь синтезированная цепь ДНК отличается от материнской степенью метилирования ее азотистых оснований, которое отстает от синтеза. Репарации при этом подвергается неметилированная цепь. Объектом узнавания ферментами репарации могут также служить разрывы в цепи ДНК. У высших организмов, где синтез ДНК происходит не непрерывно, а отдельными репликонами, вновь синтезируемая цепь ДНК имеет разрывы, что делает возможным ее узнавание. Восстановление структуры ДНК при утрате пуриновых оснований одной из ее цепей предполагает обнаружение дефекта с помощью фермента эндонуклеазы, которая разрывает фосфоэфирную связь в месте повреждения цепи. Затем измененный участок с несколькими примыкающими к нему нуклеотидами удаляется ферментом экзонуклеазой, а на его месте в соответствии с порядком оснований комплементарной цепи образуется правильная нуклеотидная последовательность.

При изменении одного из оснований в цепи ДНК в восстановлении исходной структуры принимают участие ферменты ДНК-гликозилазы числом около 20. Они специфически узнают повреждения, обусловленные дезаминированием, алкилированием и другими структурными преобразованиями оснований. Такие модифицированные основания удаляются. Возникают участки, лишенные оснований, которые репарируются, как при утрате пуринов. Если восстановление нормальной структуры не осуществляется, например в случае дезаминирования азотистых оснований, происходит замена одних пар комплементарных оснований другими - пара Ц-Г может заменяться парой Т-А и т.п..

Образование в полинуклеотидных цепях под действием УФ-лучей тиминовых димеров (Т-Т) требует участия ферментов, узнающих не отдельные измененные основания, а более протяженные повреждения структуры ДНК. Репаративный процесс в этом случае также связан с удалением участка, несущего димер, и восстановлением нормальной последовательности нуклеотидов путем синтеза на комплементарной цепи ДНК.

В том случае, когда система эксцизионной репарации не исправляет изменения, возникшего в одной цепи ДНК, в ходе репликации происходит фиксация этого изменения и оно становится достоянием обеих цепей ДНК. Это приводит к замене одной пары комплементарных нуклеотидов на другую либо к появлению разрывов (брешей) во вновь синтезированной цепи против измененных участков. Восстановление нормальной структуры ДНК при этом может произойти и после репликации.

Пострепликативная репарация осуществляется путем рекомбинации (обмена фрагментами) между двумя вновь образованными двойными спиралями ДНК. Примером такой пострепликативной репарации может служить восстановление нормальной структуры ДНК при возникновении тиминовых димеров (Т-Т), когда они не устраняются самопроизвольно под действием видимого света (световая репарация) или в ходе дорепликативной эксцизионной репарации.

Ковалентные связи, возникающие между рядом стоящими остатками тимина, делают их не способными к связыванию с комплементарными нуклеотидами. В результате во вновь синтезируемой цепи ДНК появляются разрывы (бреши), узнаваемые ферментами репарации. Восстановление целостности новой полинуклеотидной цепи одной из дочерних ДНК осуществляется благодаря рекомбинации с соответствующей ей нормальной материнской цепью другой дочерней ДНК. Образовавшийся в материнской цепи пробел заполняется затем путем синтеза на комплементарной ей полинуклеотидной цепи. Проявлением такой пострепликативной репарации, осуществляемой путем рекомбинации между цепями двух дочерних молекул ДНК, можно считать нередко наблюдаемый обмен материалом между сестринскими хроматидами.

В ходе дорепликативной и пострепликативной репарации восстанавливается большая часть повреждений структуры ДНК. Однако, если в наследственном материале клетки возникает слишком много повреждений и часть из них не ликвидируется, включается система индуцируемых (побуждаемых) ферментов репарации (SOS-система). Эти ферменты заполняют бреши, восстанавливая целостность синтезируемых полинуклеотидных цепей без точного соблюдения принципа комплементарности. Вот почему иногда сами процессы репарации могут служить источником стойких изменений в структуре ДНК (мутаций). Названная реакция также относится к SOS-системе.

Если в клетке, несмотря на осуществляемую репарацию, количество повреждений структуры ДНК остается высоким, в ней блокируются процессы репликации ДНК. Такая клетка не делится, а значит, не передает возникших изменений потомству.

Вызываемая повреждениями ДНК остановка клеточного цикла в сочетании с невозможностью молекулярной репарации измененного наследственного материала может с участием белка, синтез которого контролируется геном р53, приводить к активации процесса самоликвидации (апотпоз) дефектной клетки с целью устранения ее из организма.

Таким образом, обширный набор различных ферментов репарации осуществляет непрерывный " осмотр" ДНК, удаляя из нее поврежденные участки и способствуя поддержанию стабильности наследственного материала. Совместное действие ферментов репликации (ДНК-полимераза и редактирующая эндонуклеаза) и ферментов репарации обеспечивает достаточно низкую частоту ошибок в молекулах ДНК, которая поддерживается на уровне 1 · 10^-9 пар измененных нуклеотидов на геном. При размере генома человека 3 · 10⁹ нуклеотидных пар это означает появление около 3ошибок на реплицирующийся геном. Вместе с тем даже этот уровень достаточен для образования за время существования жизни на Земле значительного генетического разнообразия в виде генных мутаций.

⇐ Предыдущая 123 4 5 Следующая ⇒