Hfr-клетки. Использование их в картировании бактериальных генов.

⇐ ПредыдущаяСтр 4 из 4

Позже были выделены штаммы у кот F-фактор встроен в бакт хромосому.Эти штаммы наз Hfr-штаммы.В этом случае при коньюгации вместе с F-фактором в F-кл-у перен-я бакт хромосома.Реплик-я начин-я с того сайта в кот встроен F-фактор.В результ кл реципиент становятся временно диплоидной и может происходить рекомбинация м\у генами, сод-ся в хромосоме Hfr, и генами хромосомы F-кл.Эта рекомбинация осуществ-я с высокой частотой, отсюда название кл Hfr.Вместе с тем при конь-ции Hfr- и F- кл-к часто происх разрыв коньюгатной трубки и соответственно обрыв хромосомы Hfr.В результ в F- кл целая Hfr- хромосома попадает редко.Кроме того F-фактор, интегрируемый в геном к Hfr, иногда может вырезаться из хромосомы. Кл-а из Hfr превращ в F+ кл-у.Кольцевой F-фактор включающий в себя бакт гены, получил название Fприм фактора.Он способен переносить бакт гены независимо от хромосомы.Это явление наз сексдукцией.Благод этому можно получить у Эширихии Коли частично диплоиды по тем генам, кот включены в Fприм фактор.Это позволяет проводить исследования аллельных отношений у бакт, кот компенсирует в какойто мере отсутствие у них регулярной диплоидной фазы.Между гомологичными участками на Fприм факторе и хромосоме возможна рекомб-я, кот-я приводит к дупликации бакт генов в случае одинарного кроссенговера\ к обмену генами м\у Fприм фактору и бакт хромосомой в случае двойного кроссенговера.

39.Картирование бактериальной хромосомы. Физическое картирование бактериальных генов методом прерванной конъюгации. Генетическое картирование бактериальной хромосомы. Кольцевая карта хромосом прокариот.

40.Генетическая роль ДНК. Исследования Гриффитса, Эвери.

Трансформация бактерий. Первым прямым доказательством генетической роли ДНК послужила ее способность переносить наследственные свойства у пневмококков. Трансформацию пневмококков — Diplococcus pneumoniae, открыл бактериолог Ф. Гриффитс в 1928 г.

У пневмококков известны два типа штаммов, различающихся по характеру роста на плотных средах и одновременно по свойству патогенности по отношению к подопытным животным — мышам. S-форма пневмококка образует на агаре гладкие блестящие колонии благодаря тому, что клетки заключены в полисахаридную капсулу. S-форма патогенна для мышей, так как полисахаридная капсула предохраняет бактериальные клетки от иммунной системы зараженного животного. Мыши, которым вводили живые клетки S-формы пневмококка, погибали. По антигенным свойствам капсулы различают несколько типов S-форм: IS, IIS, IIIS и т. д.

Другая форма пневмококка — R-форма не имеет капсулы, образует шероховатые колонии и непатогенна для мышей. Известны редкие мутационные взаимопревращения S- и R-форм. При этом мутации R- S всегда строго специфичны: IS IR, IIS IIR, IIIS IIIR и т. д.

Ф. Гриффите обнаружил, что если мышам ввести убитые нагреванием до 65 °С клетки формы IIIS и одновременно живые клетки формы IIR, то мыши погибают, а из их трупов выделяются клетки формы IIIS. В контрольных экспериментах мыши, зараженные только убитой формой IIIS или только живой формой IIR, не заболевали. Следовательно, живые клетки IIR трансформируются из IIR и llS в присутствии убитых нагреванием клеток IIIS, тем самым приобретая свойства патогенности.

В дальнейшем другие экспериментаторы показали, что такое же превращение — трансформация типов D. pneumoniae — может происходить in vitro, т. е. в пробирке. Используя этот подход, О. Эвери, К. МакЛеод и М. МакКарти в 1944 г. идентифицировали трансформирующий агент как ДНК. ДНК, выделенная из клеток типа IIIS и добавленная в культуру клеток IIR, трансформировала часть клеток в форму IIIS, и они приобретали способность стойко передавать это свойство при дальнейшем размножении. Добавление дезоксирибонуклеазы (ДНКазы) — фермента, специфически разрушающего ДНК, препятствовало трансформации.

Таким образом, было получено первое прямое доказательство генетической роли ДНК у бактерий. В дальнейшем предпринимались многочисленные попытки трансформации низших эукариот — дрожжей, водорослей, а также многоклеточных животных и растений. Эти попытки оставались безуспешными до конца 70-х годов XX в., когда стала развиваться технология генной инженерии и были разработаны методы так называемой векторной трансформации. В настоящее время проблема трансформации эукариот решена и роль ДНК как универсального носителя генетической информации не вызывает сомнения.

41.Доказательство генетической роли нуклеиновых кислот. Нуклеиновые кислоты – наследственный материал вирусов. Работы А. Херши и М. Чейз с бактериофагом Т2,

Размножение бактериофагов. Второе прямое доказательство роли ДНК в наследственности было получено при изучении размножения бактериофага Т2, инфицирующего кишечную палочку — Escherichia coli. Бактериофаги — это вирусы бактерий. Частица бактериофага заражает клетку Е. coli. Внутри клетки образуются новые частицы бактериофага. Через 20 мин при 37 °С клетка лизируется и около 100 дочерних частиц выходят наружу. Бактериофаг состоит только из двух макромолекулярных компонентов — белка и ДНК, заключенной в головке бактериофага. В 1952 г. А. Херши и М. Чейз выяснили, какой из этих двух компонентов отвечает за размножение бактериофага. В этих экспериментах белок бактериофага метили радиоактивным изотопом серы 35S, поскольку серу содержат только аминокислоты метионин и цистеин, входящие в белок. ДНК метили радиоактивным изотопом фосфора 32Р. Около 99 % фосфора бактериофага Т2 заключено в его ДНК. Для того чтобы ввести эти радиоактивные метки в бактериофаг, им заражали бактерии, выращенные в среде, содержащей соответствующие изотопы в компонентах питательной среды.

Мечеными бактериофагами заражали клетки Е. coli, не содержащие 35S и 32Р. После начального периода адсорбции бактериофага на клетках последние тщательно отмывали, освобождая их от так называемых «теней» бактериофага — их пустых оболочек, оставшихся на поверхности бактериальных клеток. Оказалось, что при такой процедуре из культуры бактерий удаляется не менее 80 % 35S, и это никак не влияет на дальнейшее размножение бактериофага. В то же время основная масса 32Р не может быть удалена, поскольку проникает внутрь бактерий, и в дальнейшем при размножении бактериофага 32Р передается потомству. Таким образом, именно ДНК, а не белок определяет размножение бактериофага в зараженных клетках.

Генетическую роль нуклеиновых кислот подтверждает также мутагенный эффект аналогов пуриновых и пиримидиновых оснований для бактерий, а также ультрафиолетового света с длиной волны 260 нм, поглощаемой азотистыми основаниями.

42.РНК – наследственный материал РНК-содержащих вирусов. Работы Г. Френкель-Конрата и Р. Вильямса на вирусе табачной мозаики.

РНК как генетический материал. Подавляющее большинство организмов содержат ДНК в качестве генетического материала. Лишь некоторые вирусы, например вирус табачной мозаики (ВТМ), лишены ДНК и состоят из белка и рибонуклеиновой кислоты — РНК. РНК отличается от ДНК по химическому составу тем, что в ней содержится сахар — рибоза, а пиримидиновое основание тимин заменено на урацил.

Генетическая роль РНК у ВТМ была доказана в экспериментах Г. Френкель-Конрата, А. Гирера и других в конце 50-х годов XX в. Каждая частица ВТМ содержит одиночную нить РНК длиной около 6400 нуклеотидов, заключенную в белковую оболочку. Оболочка ВТМ состоит примерно из 2130 идентичных субъединиц, каждую из которых составляют 158 аминокислотных остатков. Известны штаммы ВТМ, различающиеся по способности инфицировать различные формы растения-хозяина, по симптомам, которые сопровождают вирусную инфекцию, а также по аминокислотному составу субъединиц белка оболочки. Если отделить белок от РНК ВТМ, то РНК практически теряет инфекционность (на 99, 9 %). При реконструкции вирусных частиц (смешивании РНК и белка ВТМ) они вновь становятся инфекционными. Эти особенности ВТМ и были использованы в опытах. Реконструированные вирусные частицы были получены из РНК стандартного штамма и белка так называемого штамма HR. Штаммы различались аминокислотным составом белка оболочки. В отличие от штамма HR стандартный штамм не содержал гистидина и метионина.

Вирусные частицы-потомки, образовавшиеся в результате инфекции растений, по аминокислотному составу белка оболочки и другим признакам всегда соответствовали тому штамму ВТМ, от которого брали РНК. Таким образом была показана роль РНК как носителя генетической информации у ВТМ.

Итак, свойство наследственности оказалось связанным с нуклеиновыми кислотами, и прежде всего с ДНК.

43.Модели удвоения молекулы ДНК. Экспериментальное доказательство полуконсервативной модели синтеза ДНК. Работа М. Мезельсона и Ф. Сталя.

В 1975г. Дельбрук и стент предложили 3 модели удвоения днк:

1.консервативную-предпологала, что при синтезе днк, раскручивание спирали не происходит и родительская 2-я спираль служит матрицей для 2-х новых цепей. В результате дочерние днк строятся из нового материала, а родительская сохраняется как таковая.

2.дисперстная-распад исходной молекулы днк на фрагменты. Синтез новых цепей происходит на фрагментах, которые затем соединяются с отрезками нового материала. Каждая цепь днк должна состоять из нового материала и из чередующегося отрезка старого.

3.полуконсервативный-родительская днк раскручивается и на каждой цепи днк образуется новая комплементарная цепь. Дочерняя молекула является точной копией родительской молекулы днк. При этом 1-на цепь от материнской днк, а вторая синтезируется заново.

Опыты Мезельсона и Сталя:

Чтобы определить каким же из этих способов реплицируется днк надо уметь отличить родительскую днк от дочерней такой опыт провели Мезельсон и Сталь в 1975г. Они выращивали E.coli на питательных средах содержащих изотоп N15 вместоN14.

N15-тяжелый изотоп. Он служил меткой включения днк.

Для того чтобы пометить N15 всю бактерию днк необходимо получить примерно 12 поколений E.coli.

Молекулы содержащие N15 легко отличить от N14 по плотности. Они тяжелее. При центрифугировании в градиенте плотности хлористого цезия молекула днк собирается в том слое в котором плотность раствора=их собственной плотности. Таким образом 2-ве молекулы днк отличающиеся по плотности легко разделяются.

Спустя 12 поколений, которые культивировались на среде с тяжелым изотопом N15, перемещали на среду содержащую N14.через определенный период времени выделенные пробы из культуры с определенной плотностью днк было показано, что после 1-го деления бактерий на среде с N14 плотность культуральной днк была промежуточной между днк с N15 и N14.

После 2-го деления половина имела легкую днк, а другая промежуточную. Таким образом соотношение между числом генераций и распределением плотности днк в точном соответствии полуконсервативному типу репликации днк. Кроме того согласно этой модели днк с промежуточной последовательностью должна содержать собственную гибридную 2-ю спираль: 1-на из цепей которой содержит только N14, а другая только N15.

Мезельсон и Сталь проверили это. Они нагревали днк промежуточной плотности в течении 30 минут при 100 градусах, что уже как было известно не разрывает фосфодиэфирные связи, а разрушает водородные связи. Авторы обнаружили, что при таких условиях промежуточное днк превращается в 2-ве равные по объему фракции днк с разными плотностями.

Так в 1975 было доказано, что синтез днк идет по полуконсервативному пути.

44.Репликация. Биохимический анализ репликации ДНК. Этапы биосинтеза ДНК.

Основные ферменты репликации:

1-Днк-полимераза-осуществляет рост цепи днк за счет поликонденсации дезоксирибонуклеозидтрифосфатов:

Днк-пол.1-обладает экзонуклеазной активностью, способна отщеплять 5` нуклеотид от цепи днк.

Днк-пол.2-учавствует в пр-сах репарации

Днк-пол.3-катализирует синтез новой цепи днк, стадия элонгации.

Полимеризация происходит в направлении 5`-3`.

2- рнк-полимераза(праймаза, примаза)- фермент, который участвует в инициации репликации. Она катализирует синтез рнк-затравки(праймер). С него начинается синтез днк. Праймеры нужны для инициации синтеза днк, ферментом днк-пол.3. они являются поставщиком 3`-ОН-конца.

Рнк-пол. Называется проймазой с тем чтобы отличать ее от ферментов днк-пол. Учавствующих в транскрипции.

3-5`-3`-экзонуклеазы – входят в комплекс днк-пол.1 участвующих в удалении рнк-затравки. Участвует в процессах репликации.

4-3`-5`-экзонуклеаза- участвует в исправлении ошибки репликации.

5-ДНК-лигаза- сшивает 3`-ОН и 5`PO4 –концы одноцепочечных разрывов.

6-процесс расплетания двойной спирали днк происходит при участии 3-х типов белков:

-хеликаза(геликаза)-осуществляет расплетание собственной спирали днк.

-ДСБ(днк связывающий белок)-специфически связывается одноцепочечной днк предотвращает преждевременную реассорцию цепей.

-днк-гираза(прокариоты)и топоизомераза(эукариот)-эти белки снижают напряжение связей с образованием дополнительных витков впереди репликационной вилки при расплетении родительской двойной спирали днк без вращения. Вносит одноцепочечный разрыв фосфодиэфирных связей и раскручивают узлы в родительской 2-й спирали перед репликативной вилкой. После такого раскручивания днк-гираза вновь замыкает фосфодиэфирные связи и восстанавливает структурную целостность родительской днк.

Этапы биосинтеза ДНК:

Инициация-репликация начинается на участке с определенной нуклеотидной последовательностью. Эти участки обозначаются origin-начало. При инициации к цепям днк последовательно присоединяются следующие белки:

1- Хеликаза- разрушает водородные связи и расплетает 2-ю спираль днк.

2- ДСБ-белок- он связывается с одноцепочечной днк и предотвращает преждевременную реассоциауцию.

3- Днк-гираза(прокариоты) и топоизомераза(эукариоты)-снимает напряжение впереди репликационной вилки.

Инициация сводится к синтезу на днк-матрице затравки- праймера. Праймер поставляется для 3`-ОН-конца для днк-пол.3. праймаза- фермент который синтезирует праймер работающий без затравки.

Элонгация-после расплетания и разделения родительских цепей днк, они выступают в роли матриц по которым синтезируются дочерние цепи днк. Синтез новых дочерних цепей днк идет с помощью днк-пол.3, которвая в качестве субстрата использует дезоксирибонуклеотидтрифосфат.

Свободные азотистые основания распределяются, мало в клетках, они чаще находятся в виде нуклеозидов или нуклеотидов. Синтез дочерней цепи идет по матричной по принципу комплиментарности А-Т, Г-Ц.

Для осуществления реакции полимеризации любой днк-полимеразе необходимо наличие затравки со свободным 3`-ОН-концом. Химический смысл полимеризации состоит в том, что свободная 3`-ОН группа взаимодействует с атомом фосфора-нуклеозид-3-фосфоата. При этом отщипляется 3-фосфат и образуются фосфодиэфирные связи. 3`-ОН группа присоединяет нуклеотид в свою очередь выступают в роли затравки для присоединения следующего нуклеотида.

Цепи днк антипараллельны в области репликационной вилки присутствует и 3`и 5`концы синтезируемых цепей.

Поскольку для действия днк-пол. Необходимо присутствие 3`-конца, то всего лишь одна из 2-х растущих дочерних цепей днк синтезируется непрерывно. Для начала ее синтеза нужна 1-на затравка. Эта цепь названа ведущей.

Поскольку элонгация каждой дочерней цепи идет только в направлении 5`-3`, то синтез другой цепи, которая называется отстающей, идет прерывисто путем синтеза и соединением коротких фрагментов оказаки.

Эти фрагменты синтезируются в направлении противоположном направлению репликационной вилки. Имеют небольшие размеры. В начале каждого фрагмента оказаки синтезируется праймер. Он не сохраняется в зрелой днк. После репликации они удаляются с помощью днк-пол.1 за счет проявления 5`-3`экзонуклеазной активности. В дальнейшем праймеры могут распадаться на отдельные нуклеотиды, но могут перемещаться в точку старта синтеза следующего фрагмента с помощью боковых факторов репликации. После удаления затравки днк-пол.1 застраивает образующуюся брешь. Комплементарными нуклеотидами. Образующийся фрагмент оказаки сшивает с помощью днк –лигазы.

Терминация-днк реплицируется полностью. Образуется 2-ве молекулы днк в каждой из которой 1 цепь материнская, 2-я дочерняя.

45.Проблема стабильности генетического материала. Репарация ДНК. Типы репарации.

Репарация- восстановление нормальной структуры днк, имевшей повторы, которые возникли в процессе репарации или рекомбинации, либо были вызваны искусственных повреждений физических или химических факторов.

Однако организмы не беззащитны от таких воздействий, в клетках животных организмов обнаружены специальные системы, которые находят ошибки и залечивают днк- это репаративные системы:

1)Фотореактивация- репарация происходит за счет использования энергии видимого света при участии фотореактивирующего фермента. Эта дорепликативная репарация. Она может устранять только 1-н тип поареждений днк- дим еры тимина, которые возникают при облучении клеток УФ. Полимеразы не могут прочесть такие модели и останавливаются на участке цепи днк, где образуется димер тимина. В различных клетках от м.о. до человека обнаруживается фермент днк- фотолиаза. Этот фермент находит димер тимина и связывается с ним- образуя комплекс способный поглощать квант света.энергия кванта света идет на расщипление димера, а фотолиаза освобождается- повреждение устраняется. Таким образом фотореактивация-это восстановление нормальной последовательности нуклеотидов днк. Внутри многоклеточных организмов, где света нет фоторектев. Невозможна.

2)Эксцизионная-вид дорепликативной репарации осуществляющийся по типу «вырезание-вставка» и не нуждается в энергии видимого света. Эксцизионная репарация устраняет самые разнообразные повреждения: димер тимина, изменение мутагенности азотистых оснований…

Эта система не требует света и называется темновой репарацией.

Механизм: узнавание поповрежденной днк осуществляется с помощью эндонуклеазы, после этот же фермент делает надрез(расщепление фосфодиэфирной связи) рядом с поврежденным нуклеотидом.

На 2-м этапе вырезается(эксцизия) поврежденного нуклеотида производится либо экзонуклеазой, либо днк-пол.1, которая встраивает новый нуклеотид взамен старых. На последнем этапе днк-лигаза сшивает разорванную цепь и восстанавливает структуру днк. Происходит у эукариот, днк-сод фагов, бактерий.

3)рекомбинационная-один из видов репарации путем рекомбинантных хромосом путем «разрыв-воссоединение», когда нормальная мол. Днк образуется благодаря обмену поврежденного в ней сигмента на неповрежденный в процессе рекомбинации между нормальной цепью днк и и поврежденной дочерней. Это вид пострекомбинационной темновой репарации.

Если мутация не исключается системой экстизионной репарации, она будет препятствовать репликации днк. Против изменения участка матричной днк образуется незастроенная брешь, т.к. днк-пол.3 прекращает синтезироваться в этих участках и поэтому следующий фрагмент оказаки образуется на некотором расстоянии от повреждения.

Если эту брешь не застраивать, то клетка погибнет.

Пока цепи днк не разошлись после репликации из нормальной материнской цепи днк вырезается соответствующий участок и застраивается брешь. В материнской цепи днк откуда вырезался участок происходит обычный репаративный синтез с помощью днк-пол.1. этот вид репарации не ликвидирует сами мутантные дефекты, но устраняет брешь.

4)SOS-репарация- работает у млекопитающих и прокариот, это клеточная реакция на сильное повреждение днк и мутацию нуклеотидов, которые ингибируют репликацию. При SOS-репарации происходит заполнение брешей против повреждения нуклеотидов с помощью специальн. Днк-пол. SOS, которая может строить нить днк не смотря на повреждение матрицы. В этих условиях поврежденные нуклеотиды не удаляют комплементарную цепь, тоже не соответствует исходной, т.к. на против повреждения днк-пол SOS ставит производные нуклеотиды.

46.Классическое представление о гене как единице функции, рекомбинации и мутации. Критерии аллелизма, предложенные Т. Морганом.

Первая успешная попытка конкретизации представлений о гене принадлежит Т. X. Моргану, который один из своих классических трудов назвал «Теория гена» (1926). Представления школы Т. X. Моргана о гене можно кратко резюмировать следующим образом. Гены находятся в хромосомах и представляют собой далее неделимые единицы мутации, рекомбинации и функции. Ген — это:

1)единица мутации, т. е. ген изменяется как целое;

2)единица рекомбинации, т. е. кроссинговер никогда не наблюдали в пределах гена;

3) единица функции, т. е. все мутации одного гена нарушают одну и ту же генетическую функцию, что выражается в их не комплементарности у особей F i при попарном скрещивании мутантов.

Гены контролируют элементарные менделевские признаки. Соответственно в этих положениях и были предложены основные критерии аллелизма (рекомбинационный и функциональный), при помощи которых мутационные изменения относят к одному и тому же или к разным генам. Представления о гене всецело зависели от разрешающей способности генетического анализа, которая определяется возможностью (вероятностью) обнаружения редких событий — рекомбинаций между тесно сцепленными мутациями. В свою очередь, выявление таких событий зависит от численности потомства, которое можно исследовать при скрещиваниях. Очевидно, разрешающая способность генетического анализа резко повышается при использовании селективных методов, которые успешно применяются при работе с микроорганизмами и с культурами клеток высших организмов.

Не следует забывать и о значении индуцированного мутагенеза в повышении разрешающей способности генетического анализа. Повышение частоты мутаций гарантирует возможность создания обширных генетических коллекций и тем самым увеличивает вероятность все более «плотного» маркирования хромосом. Только при этом возникает возможность и необходимость изучения рекомбинации и взаимодействия между тесно сцепленными участками генетического материала.

Рекомбинационный критерий аллелизма гласил: если мутации не рекомбинируют, то они аллельны, т. е. затрагивают один и тот же ген.

Функциональный критерий аллелизма основан на скрещивании мутантов (рис. 15.1) и выяснении, нарушают ли мутации одну и ту же функцию или разные функции. Функциональный критерий аллелизма применим только к рецессивным мутациям. Согласно этому критерию если две мутации объединяются путем скрещивания, то не поврежденные мутациями участки генетического материала взаимодействуют комплементарно, т. е. образуется гибрид дикого типа, то мутации относят к разным функциональным единицам — разным генам. В этом случае имеет место классическая дигетерозигота. Если же при объединении в F | двух мутаций возникает гибрид мутантного фенотипа, это означает, что обе мутации повреждают одну и ту же функциональную единицу — один и тот же ген. В этом случае имеет место гетероаллельная комбинация, или компаунд.

47.1928 г. Представление о неделимости гена было пересмотрено. А.С.Серебровский и его ученики доказали протяжённую и сложную стр-ру гена в работах по исследованию ступенчатого аллеломорфизма.В 1928г Дубинин изучал ст-ру гена scute-achaete (скют-ашет) дрозофилы.Для этой цели он использовал рентгеновское облучение, мутагенное действие уже было известно.Ген скют контролирует на теле дрозофилы одновременно 9 щетинок.Согласно теории Моргана о неделимости гена, при мутации должны ищезнуть все 9 щетинок.Однако были получены иные данные.Дубинен получил необычные мутации: отсутствие 2, 3, 4 щетинок, а не все9.Т.о он получил серию рецессивных мутаций., затрагивающих формирование щетинок у дрозофилы.Затем все эти мутации были проверены по функциональному тесту на аллелизм.Для чего мутантов скрещивали попарно.Если гибрид имел мутантный фенотип от этого скрещивания, то исследуемые мутации были аллельны, затрагивали 1 функциональный уч-ок гена.Если же гибрид имел фенотип норм., то мутации были неаллельны, затрагивали разные функц-е уч-ки гена.При графическом изображении взаимод-я неск. Пар аллелий в компаундах получилось нечто вроде лестницы, ступеньками еоторой служили отдельные аллели.На основе этихданных был сделан вывод о том, что отдельные уч-ки гена могут мутировать независимо друг от друга и построен линейный план гена скют.Показано, что ген скют состоит из более мелких центров.предполагалось, что при мутировании изм-ся не весь ген, а лишь его некот-е центры.В рез-те была сформулирована центровая теория гена: основной ген или базиген состоит из субгенов.На основании этого выводы: 1.ген не явл-ся неделимой генит. Стр-ой, а представляет собой обл. хромосомы, отд-е уч-ки кот. Могут мутироватьнезависимо друг от друга, т.е.ген неявл-ся еденицей мутации.2.ген не явл-ся еденицей ф-ции, т.е. ген подр-ся на неск-ко самостоят-ых едениц-субген.

48.Псевдоаллелизм- это когда кросссинговер происходит м-ду мутациями одного генааллельными по функц-му тесту.Впервые осущ-е кроссинговера м-ду аллельными мутациями показал М. Грин в 1949г.Он исследовал рецессивные мутации в пределах гена лозич(lz) Этот ген контролирует формирование фасеточных глаз у дрозофилы.В пределах гена lz была получена серрия рецисивных мутаций-все они приводили к нарушению фасеток в глазу у дрозофилы.Полученых мутантов затем проверяли по функц-му тесту на аллелизм, для чего их попарно скрещивали м-ду собой.При изучении аллельных взаимоотношений в локусе лозич было установлено, что 2 мутации lz50c и lz8 в гетерозиготе дают мутантный фенотип, т.е. они аллельныОднако иногда в этой гетерозиготе формируют фенотип близкий к норм-му. Т.о. впервые было доказано, что ген может делиться путём кроссинговера.

49.В 1951г. Тест на аллелизм был модернизирован Льюисом.Он предложил использовать цис-транс-тест для определения аллельной или комплементарной мутации прошедшей в пределах 1-го гена.Тест основан на изучениигибридов, кот-й формируется при скрещивании двух рецессивных мутантов.Изучаемые мутации в фенотипе гибрида нах-ся в цис или транс конфигурации. Цис-конф. Мутаций возникает, когда обе мутации приходят в гибридот 1-го родителя, т.е. нах-ся в одной хромосоме. Транс-конф.возникает, еслимутации приходят от разных родителейи нах-ся в разн. Гомологичных хромосомах.Если гибрид имеет фенотип дикого типапри расположении мутаций в цис и транс положении, то мутации не аллельны, отн-ся к разным функц.еденицам. Если же при расположении мутаций в цис положениигибрид имеет дикий фен., а при транс-полож.мутантный, томутации алельны, относ-ся к одной функц-ой еденице. Т.О. цис-танс-тест позв. Определить аллельны или не аллельнырецесивные мутации даже в том случае, если они локализованы в одном гене.

50.Следующий этап в развитии представлений о стр-ре гена: устан-е мин. Уч-ов гена, передающихся при кроссинговере.Оценки этих величин были получены в 1956г. С. Бензер при изучении r2 мутации фага Т4.Обычно присутствие фага устанавливают по его способностиубивать заражённые им бактерии.О гибели бакт. Свидетельствуют стерильные пятна в слое бакт. Клеток на пов-ти чашки Петри.Эти пятна называют также негативные колонии или бляшки.В конце 50-х гг у фага Т4 был выделен ряд мутаций: r1 r2 r3.Эти мутанты на бакт-ом газоне дают быстро формирующ-ся негативные колонии.Дальнейшие исследования проводили с использованием мутации r2. r2 мутанты фага имеют 2 особенности.1. бляшкиr2 мутанта имеют характ-ю морфологию.Они большие, круглые, прозрачные.более крупные, чем бляшки фага Т4 дикого типа(r2+).Это позволяет легко различить на чПетрис культурой э.коли фаги дикого и мутантного типов.2. Заключ-ся в том, чтоони растут на линии э.колиВ, но не дают потомства на э.колиК12. В тоже время фагиЕ4 дикого типа размн-ся и в э.коли В и вК12.Т.О.используя линии В и К12 Бензер выделил 2 тыс. мутантов фагаЕ4.Все r2 мутанты обладали одинаковым фенотипом, т.е. давали большие прозрачные бляшки на э.колиВ и не росли на Э.колиК12, однако было не ясно одинаковы ли их генетические ф-ции.Для этого был проведён ген-й анализ с использованием теста на аллелизм и рекомбенационного теста.Тест на аллелизм позволил легко определить аллельны или не аллельны 2 анализирующие мутацииr2, принадлежат они к одной или к разным функц-ым еденицам.Для этого кл-киЭ.колиК12 заражали различными парными комбинациямимутантов r2.При заражении кл-ки 2-мя фаговыми частицами м-ду их генами возникают функц-е отношения аналогичные отношениям м-ду 2-мя гомол-ми хромосомами диплоида.Если потомства фага давала рост на штамме К12, тоанализируемые мутации не аллельны, принадлежат к разным функц-ым еденицам.Если же рост фага на штамме К12отсутствует, то анализир-е мутации аллельны, относят к 1-ой функц-ой еденице.ВЫВОД: мутации не аллельны, принадлежат к разным функц-ым еденицам.Мутации аллельны, принадлежат к 1-ой функц-ой ед.С помощью этого ме-да Бензер разделил все мутации на 2 большие группы АиВ-эти группы Бензер назвал цистроны.Т.о. цистрон это единица ф-ции т.е. отрезок хромасомы, контролирующий 1функцию.Функцион-е группы АиВ r2 комплементарны т.е.мутации принадлежащие к разным цистронам не аллельны между собой, тогда как мутации принадлежащие к 1-му цистрону аллельны. С тех пор термин цистрон часто употребляют в кач-ве синонима термина ген.После установления принадлежности мутации к той или иной функц-ой группы необходимо было определить где нах-ся мутации впределах 1-го цистрона, т.е.провести кортирование мутаций.Это было проделано с помощью рекомбиционного теста.Как известно штаммК12Э.коли можно использовать для отбора штаммов фага Т4дикого тела, т.к.мутантные фаги на К12 не растут.Т.о.если на К12 высеивать попарно различные аллельные мутанты r2, то бляшки фага появ-ся лишь втом случае если: 1) это будут фаги с обратной мутацией от r2 к r2 r2+ или 2) это будут рекомбинанты полученые в пределах 1-го цистрона, т.к.рекомбинация ведет к получению фагов дикого типа. Известно, что частоту рекомбинаций можно использовать как меру расстояния между мутациями, т.е.определить расстояние м-ду мутациями и взаимное расположение на изуч-ом участке хромосом. Результат: При кортировании мутаций была установлена принадлежность200 мутаций r2 к А цитронам и 108 мутаций к В цитронам. Мин. Частота рекомбинаций в опытах Бензера составила 0-0, 2%.Меньше расстояния не были обнаружены.Эта оценка мин. расстояний между мутациями соответствовала предположительно что мин.единицей рекомбинации служит1пара нуклеотидов.Т.о.концепция о гене как единице наследственности мутации и рекомбинации была пересмсотрена, найменший фрагмент хромосомы при Красенговере –единица рекомбинации- рекон. 1рекон=1 нуклеотид.Наим. уч-ок хромосомы, изменение которого изменяет мутацию-мутон.1мутон=1нуклеотиду.Т, О, нуклеотид этоеденица мутации и рекомбинации.Изучение тонкой стр-ры генапривело к концепции гена какпоследовательности нуклеотидных пар в молекуле ДНК.

51.Подтвердилось положение о том, что у прок. Существует прямое соответствие м-ду генами м-РНК и белком, т.е. размеры гена=мРНК.Гены высших орг-ов устроены более сложно.В 70-х гг. в Москве в институте общей генетики изучали размеры ядерной РНК и цитоплазматической.Оказалось, что яРНК больше цитопл.РНК.Сл-но она содержит последовательности, кот-е потом вырез-ся из неёТ.О. было показано, что гены эук склад-ся из кодирующих и некод-х блоков-экзоны и интроны.Экзоны это кодир-е посл-ти, они сохр-ся в зрелой РНК, интроны это нек-е посл-ти.В зрелой мРНК их нет.Про-мРНК счит-ся непрерывно и поэтому содержит и экзоны и интроны, затем интроны выр-ся из про-мРНК, а экзоны соед-ся-сплайсинг.Механизм сплайсинга: В зависимости от специфичности мех-ма спл-га интроны разд. На неск. групп: 1.первичные рРНК и т- РНК митох-й и хлоропластови иРНК мит. И хлор., выявлено самовырезание или автоэксцезия.Эти интроны сами обдадают ферментативной активностью необх.для их самовырезания.2.интроны ядерных РНК высших орг-ов могут достигать в длину до 20 тыс.п.н. и больше, поэтомудля их удаления тр-ся более сложный мех-м.В этом случае в кл-ке им-ся комплекс спец. Белков-сплайсомы, кот-й осущ-ет реакции вырезания.Число интронов в гене кол-ся от 1-го до неск. Десятков.Размеры от неск.десятков п.н.до неск.десятков тысячных. Особенности стр-я интронов.1.Характерная черта-консервативность орг-ции в родственных генах 1-го вида или в одинаковых генах разных видов интроны распр-ся в строго определённых местах.2.Нуклеот-я посл-ть самих интронов мало консервативна и легко подв-ся изменению, поэтому интроны расп-е в одних и тех же местах родственных генов могут разл-ся по нуклеот.послед-ям.3.Только на границе м-ду экзонами и интронами обнаружено сходство м-ду разными интронами.Понастоящему консер-ны лишь 2 первых и 2 последних основания(ГУ, АГ)Они выяв-ся почти во всех интронах. ДЛЯ ЧЕГО ПРИРОДЕ СПЛАЙСИНГ? 1.спл. может играть важную роль в эволюции и в обьед-е разных генов в один. В ре-те обр-ся новые гены.Подтверждением этому служит доменная стр-ра многих белков.2.Это более полное и экономное использование ген. Инф-ции. ПРИМЕР, альтернативный сплайсинг у вирусаSV40. В одном и том же гене сплайсинг может протекать по разному.Оказалось, что один и тот же уч-ок ДНК кодирует 2 разных белка, т.к.в промРНК присутствует неск-ко сигналов для сплайсинга, кот-е работают на разных стадиях инфиц-я кл-ок вирусов.3. спл.может учавст-ть в регуляции генов.

52. Развитие хромосомной теории наследственности привело к тому, что абстрактное понятие гена приобрело конкретное содержание. Дальнейшие цитогенетические исследования, успехи в молекулярной генетике дали основание пересмотреть старые представления о гене. Он стал рассматриваться как система и как часть общей системы - генотипа.В конце 20-х годов советские генетики А. С. Серебровский, Н. П. Дубинин, И. И. Агол и другие впервые получили данные, свидетельствующие о более сложной структуре гена, чем было принято считать ранее. Изучая у дрозофилы наследственные изменения, связанные с уменьшением щетинок, исследователи обнаружили, что ген вовсе не является неделимой единицей. Мутации его в одном и том же участке хромосомы имели разное фенотипическое проявление. Например, изменение одного гена приводило к уменьшению количества щетинок у некоторых особей на голове, у других - только на брюшке, у третьих - на брюшке и голове.Было высказано предположение, что ген, определяющий количество щетинок у дрозофилы, состоит из нескольких субъединиц со сходной функцией. Каждая субъединица вызывает развитие признака на одной какой-то части тела и может мутировать независимо от других. Этот вывод был окончательно доказан исследованиями на бактериях и вирусах. Такое явление назвали ступенчатым аллелизмом (аллель - это разное состояние одного и того же гена). Весь ген (базиген) состоит из отдельных участков-центров, названных трансгенами, выполняющих сходные функции. Между трансгенами одного гена существуют определенные аллельные отношения.Затем было установлено, что ген - это участок хромосомы, контролирующий развитие определенных признаков. Он состоит из отдельных различающихся между собой единиц. Чтобы отразить делимость гена и функции более мелких единиц наследственности, ввели ряд понятий. Наименьший участок ДНК, который уже не делится перекрестом хромосом, является единицей рекомбинации (рекон).Участок молекулы ДНК, вызывающий появление наследственного изменения-мутации, получил название мутона. Вначале предполагалось, что он составляет группу из пяти нуклеотидов. Но в дальнейшем было установлено соответствие мутона всего одному нуклеотиду. Самая малая неделимая функциональная единица наследственности названа цистроном. Несколько цистронов общей функции образуют оперон.

53.Транскрипция-это перевод послед-ти нуклеотидов ДНК в посл-ть РНК.Синтез РНК идёт на ДНК по принципу комплементарности, а.и.АУ, ГЦ.Молекулы РНК счит-ся не со всей длиы ДНК, а сопред-ых уч-ов.Эти уч-ки наз-ся транскрипционные еденицы или транскриптоны.Соседние транскриптоны могут быть отделены друг от друганетранскрибируемым

⇐ Предыдущая 1 2 34