МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ К ЛАБОРАТОРНЫМ ЗАНЯТИЯМ

Стр 1 из 9Следующая ⇒

МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

КАБАРДИНО-БАЛКАРСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ К ЛАБОРАТОРНЫМ ЗАНЯТИЯМ

ПО ОБЩЕЙ МИКРОБИОЛОГИИ

ДЛЯ СПЕЦИАЛЬНОСТЕЙ: 040100 – ЛЕЧЕБНОЕ ДЕЛО

СТОМАТОЛОГИЯ

Нальчик 2005

УДК 576.8 (075)

ББК 28.4 я73

Г12

Рецензент:

Доцент кафедры микробиологии Кабардино-Балкарской государственной сельскохозяйственной академии Якушенко О.С.

Составители: Габрилович И.М., Блиева Л.З., Хараева З.Ф.

Методические указания к лабораторным занятиям по общей микробиологии. Методические разработки. – Нальчик: Каб.-Балк.университет, 2006 -155с.

В методических разработках содержится описание лабораторных занятий по разделам общей микробиологии. К каждой теме дается краткая характеристика темы занятия, список заданий по лабораторному практикуму и контрольные вопросы. Издание предназначено для самостоятельной подготовки к лабораторным занятиям по микробиологии и контроля усвоения материала.

Рекомендовано РИСом университета

УДК 576.8 (075)

ББК 28.4 я73

Кабардино-Балкарский государственный университет, 2005
РАЗДЕЛ I. МОРФОЛОГИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ

ТЕМА 2. МИКРОскопический метод исследования: морфология и структура бактерий. приготовление фиксированных препаратов, простые и сложные методы окраски

Всем бактериям присущи определенная форма и размеры, которые выражаются в микрометрах. Они варьируют в широких пределах – от 0, 1 – 0, 15 мкм (Mycoplasma) до 10 – 15 мкм (Clostridium) в длине и от 0, 1 мкм до 1, 5 – 2, 5 мкм в диаметре. Бό льшая часть бактерий имеет размеры от 0, 5 – 0, 8 мкм до 2 – 3 мкм.

Различают следующие основные формы бактерий: шаровидные (сферические), или кокковидные, палочковидные (цилиндрические), извитые (спиралевидные), нитевидные. Существуют бактерии, имеющие треугольную форму. Обнаружены так называемые квадратные бактерии, которые образуют скопления из 8 или 16 клеток в виде пласта.

Организация бактериальной клетки такова, что она позволяет ей координировать все процессы жизнедеятельности, за определенный срок удваивать свою биомассу и размножаться путём бинарного деления. В составе бактериальной клетки можно выделить различные структуры: клеточную стенку, цитоплазматическую мембрану, цитоплазму, нуклеоид, мезосому, периплазматическое пространство, цитоплазматические включения, рибосомы, капсулу, микрокапсулу, жгутик, плазмиды, пили, фимбрии, перемычки в периплазматическом пространстве.

Клеточная стенка – структурный компонент, присущий только бактериям:

· сохраняет постоянную форму клетки;

· защищает внутреннюю часть клетки от действия механических и осмотических сил внешней среды; участвует в регуляции роста и деления клеток;

· обеспечивает коммуникацию с внешней средой через каналы и поры;

· несёт на себе специфические рецепторы для бактериофагов;

· определяет антигенную характеристику бактерий;

· содержащийся в её составе пептидогликан наделяет клетку важными иммунобиологическими свойствами;

Нарушение синтеза клеточной стенки бактерий является главной причиной их L – трансформации. Структура и химический состав клеточной стенки у разных бактерий не одинаков. По окраске мазков по методу Грама все бактерии дифференцируют на грамположительные и грамотрицательные, которые характеризуются отличительными особенностями (табл. 1).

Таблица 1

РАЗДЕЛ II. Физиология микроорганизмов

ТЕМА 1. бактериологический метод. культивирование микроорганизмов: питательные среды и методы стерилизации

Культивирование микроорганизмов широко используется в лабораторных условиях для их выделения, накопления и сохранения. Для культивирования бактерий пользуются естественными и искусственными питательными средами различного состава. Питательные среды должны отвечать следующим требованиям:

· содержать в достаточном количестве все необходимые питательные вещества, соли и ростовые факторы;

· иметь оптимальную рН, вязкость достаточную влажность;

· должны быть стерильными и по возможности прозрачными.

По назначению питательные среды подразделяют на следующие основные категории:

· основные – предназначены для выращивания многих видов бактерий (мясо – пептонный бульон, мясо – пептонный агар);

· элективные – способствующие развитию отдельных видов микробов (кровяные, сывороточные, яичные);

· селективные – подавляющие рост одних микроорганизмов и не влияющие на рост других (среды Мюллера, селенитовая, Рапопорт);

· дифференциально – диагностические – позволяющие отличать одни виды бактерий от других по их ферментативной активности или культуральным проявлениям (среды Эндо, Левина, Плоскирева, Гиса).

По консистенции питательные среды могут быть жидкими, плотными и полужидкими. Жидкие среды готовят на основе водных растворов каких – либо веществ, чаще всего мясной воды, различных гидролизатов, иногда естественных продуктов (молока, крови). Для получения плотных сред к ним добавляют агар – агар, который представляет собой полисахарид сложного состава, получаемый из морских водорослей. Агар – агар плавится при 100⁰С, но при охлаждении сохраняет жидкую консистенцию до 45⁰С. Для получения плотных сред его добавляют в концентрации 1, 5 – 3, 0 %. Полужидкие среды имеют вязкую консистенцию благодаря добавлению к ним небольшого количества агара (0, 3 – 0, 7 %).

Стерилизация – обеззараживание, полное уничтожение микроорганизмов в питательных средах, посуде и прочих различных материалах. Производится с помощью физических, химических и механических методов.

К физическим относятся:

а) прокаливание, или фламбирование, над пламенем горелки; б) кипячение; в) стерилизация сухим жаром; г) стерилизация паром под давлением – автоклавирование; д) стерилизация текучим паром; е) дробная стерилизация; ж) тиндализация; з) пастеризация; и) стерилизация УФ – лучами; к) стерилизация ионизирующим излучением (рентгеновские или гамма – лучи).

Химическая стерилизация проводится с помощью веществ, обладающих антимикробным действием. В качестве стерилизантов в настоящее время используют растворы карболовой кислоты или фенола (3 – 5 %), сулемы (0, 1 – 0, 2%), хлорамина (1 – 5 %), этиловый спирт, щелочи и кислоты различной концентрации.

Для обработки сред, компоненты которых легко разлагаются при нагревании, применяют механическую стерилизацию фильтрованием через мелкопористые фильтры (свечи Шамберлана, Беркефельда, фильтр Зейтца).

Демонстрация

1. Питательные среды: основные, элективные, селективные, дифференциально – диагностические.

2. Бактериальные фильтры.

ЗАДАНИЕ

1. Ознакомиться с устройством и работой автоклава и сушильного шкафа.

2. Приготовить питательный мясо – пептонный бульон, для чего в колбу со 100 мл дистиллированной воды поместить навеску пасты, содержащей концентрированный рыбный гидролизат, размешать, кипятить в течение 2 – 3 минут, определить рН (7, 2 – 7, 5), профильтровать, разлить в пробирки и простерилизовать в автоклаве.

3. Приготовить питательную среду из сухого агара, для чего всыпать в колбу со 100 мл дистиллированной воды навеску сухого порошка, размешать, кипятить на слабом огне 1 – 2 минуты, профильтровать, разлить по пробиркам. После автоклавирования пробирки оставить на столе в наклонном положении для застывания агара в виде скошенной поверхности (скошенный агар).

Контрольные вопросы

1. Какую роль выполняют вода, минеральные соли, углеводы и липиды в микробной клетке?

2. Как классифицируют микроорганизмы по типам питания?

3. Каковы особенности автотрофных и гетеротрофных микроорганизмов?

4. В чём состоит строительный и энергетический обмен у микробов?

5. Какие продукты образуются в результате строительного и энергетического обмена микроорганизмов?

6. Какие требования предъявляются к питательным средам? Что такое ростовые факторы?

7. Как классифицируются питательные среды? Привести примеры основных категорий питательных сред.

8. Что такое стерилизация и дезинфекция?

9. Какие существуют методы стерилизации питательных сред и лабораторной посуды?

РАЗДЕЛ III. Общая вирусология и генетика микроорганизмов

РАЗДЕЛ IV. инфекция и иммунитет

Антигены бактерий

Связанные со структурой клетки	Продуцируемые клеткой
О-аг – соматический (пептидогликан)	Фибринолизин
Н-аг – жгутиковый (флавопротеин)	Лецитиназа
К-аг – капсульный (А-аг, Vi-аг, L-аг)	Гиалуронидаза
Антигены мембранных структур (липопротеиды)	Экзотоксины

Таблица 5

Антигены вирусов

Связанные с вирионом	Связанные с зараженной клеткой
Антигены белков слияния	Антигены, экспрессированные на поверхности клетки
Антиген капсида	Антигены, встроенные в мембрану клетки
Антиген суперкапсида	-
Антиген нуклеопротеида	-

Иммунологические методы исследования — диагностические методы исследования, основанные на специфическом взаимодействии антигенов и антител. Широко используются для лабораторной диагностики инфекционных болезней, определения групп крови, тканевых и опухолевых антигенов, видовой принадлежности белка, распознавания аллергии и аутоиммунных болезней, беременности, гормональных нарушений, а также в научно-исследовательской работе. Они включают серологические реакции, к которым относят обычно реакции прямого воздействия антигенов и антител сыворотки крови in vitro. В зависимости от механизма серологические реакции можно подразделить на реакции, основанные на феномене агглютинации; реакции, основанные на феномене преципитации; реакции лизиса и реакция нейтрализации.

Реакции, основанные на феномене агглютинации. Агглютинация представляет собой склеивание клеток или отдельных частичек — носителей антигена с помощью иммунной сыворотки к этому антигену. Реакция агглютинации бактерий с использованием соответствующей антибактериальной сыворотки относится к наиболее простым серологическим реакциям. Взвесь бактерий добавляют к различным разведениям испытуемой сыворотки крови и через определенное время контакта при t°37° регистрируют, при каком наивысшем разведении сыворотки крови происходит агглютинация. Выделяют мелкозернистую и крупнохлопчатую реакции агглютинации. При связывании через Н-антиген бактерий образуются осадок из крупных конъюгатов аг-ат, в виде хлопьев. При контакте с О-аг появляется мелкозернистый осадок. Реакцию агглютинации бактерий используют для диагностики многих инфекционных болезней: бруцеллеза, туляремии, брюшного тифа и паратифов, кишечных инфекций, сыпного тифа.

Реакция пассивной, или непрямой, гемагглютинации (РПГА, РНГА). В ней используют эритроциты или нейтральные синтетические материалы (например, частицы латекса), на поверхности которых сорбированы антигены (бактериальные, вирусные, тканевые) или антитела. Их агглютинация происходит при добавлении соответствующих сывороток или антигенов. Эритроциты, сенсибилизированные антигенами, называют антигенным эритроцитарным диагностикумом и используют для выявления и титрования антител. Эритроциты, сенсибилизированные антителами. называют иммуноглобулиновыми эритроцитарными диагностикумами и применяют для выявления антигенов. Реакцию пассивной гемагглютинации используют для диагностики заболеваний, вызванных бактериями (брюшной тиф и паратифы, дизентерия, бруцеллез, чума, холера и др.), простейшими (малярия) и вирусами (грипп, аденовирусные инфекции, вирусный гепатит В, корь, клещевой энцефалит, крымская геморрагическая лихорадка и др.).

Реакции, основанные на феномене преципитации. Преципитация происходит в результате взаимодействия антител с растворимыми антигенами. Простейшим примером реакции преципитации является образование в пробирке непрозрачной полосы преципитации на границе наслоения антигена на антитело. Широко применяют различные разновидности реакции преципитации в полужидких гелях агара или агарозы (метод двойной иммунодиффузии по Оухтерлони, метод радиальной иммунодиффузии, иммуноэлетрофорез), которые носят одновременно качественный и количественный характер. В результате свободной диффузии в геле антигенов и антител в зоне оптимального их соотношения образуются специфические комплексы— полосы преципитации, которые выявляют визуально или при окрашивании. Особенностью метода является то, что каждая пара антиген— антитело формирует индивидуальную полосу преципитации, и реакция не зависит от наличия в исследуемой системе других антигенов и антител.

ЗАДАНИЕ

1.Поставить ориентировочную реакцию агглютинации на стекле. Для этого на предметное стекло пипеткой наносят каплю диагностической сыворотки и рядом каплю физиологического раствора. В каждую пробу с помощью бактериологической петли вносят небольшое количество бактериальной культуры и эмульгируют. Через 2-4 минуты в положительном случае в пробе с сывороткой появляются хлопья, кроме того капля становится прозрачной. В контрольной пробе капля остается равномерно мутной.

2.Поставить развернутую реакцию агглютинации. Для постановки реакции взять 6 пробирок. Первые 4 пробирки являются опытными, 5 и 6 –контрольными. Во все пробирки кроме 1 вносят 0, 5мл физ.раствора. В первых 4 пробирках провести титрование исследуемой сыворотки (1: 50; 1: 100; 1: 200; 1: 400). Во все пробирки, кроме 5-й внести 0, 5мл антигена. Пробирки встряхнуть и поставить в термостат (37⁰С) на 2 часа, затем оставить пробы в комнатной температуре на 18часов. Учет результатов проводят по следующей схеме:

++++ полная агглютинация, хорошо выраженный хлопьевидный осадок, надосадочная жидкость прозрачная

+++ неполная агглютинация, выраженный осадок, надосадочная жидкость слегка мутная

++ частичная агглютинация, есть небольшой осадок, жидкость мутная

+ частичная агглютинация, осадок слабо выражен, жидкость мутная

- агглютинации нет, осадка нет, жидкость мутная.

3.Ознакомиться с постановкой реакции преципитации при диагностике токсигенного штамма C.diphtheriae.

4. Разобрать схемы прямой и непрямой реакций Кумбса.

Контрольные вопросы

1. Иммунитет, его виды

2. Центральные и периферические органы иммунитета. Функции, строение.

3. Основные клетки, задействованные в иммунных реакциях.

4. Классификация антигенов, свойства антигенов, свойства гаптенов.

5. Антигенное строение бактериальной клетки, вируса.

6. Гуморальный иммунитет: особенности, основные клетки, задействованные в гуморальном иммунитете.

7. В-лимфоциты, строение клетки, фазы созревания и дифференцировки.

8. Т-лимфоциты: строение клетки, фазы созревания и дифференцировки.

9. Трехклеточная кооперация в иммунном ответе.

10. Классификация иммуноглобулинов.

11. Строение иммуноглобулина.

12. Неполные антитела, строение, значение.

13. Реакции иммунитета, классификация.

14. Реакция агглютинации, варианты постановки, диагностическое значение.

15. Реакция Кумбса, схема постановки, диагностическое значение.

16. Реакция преципитации, варианты постановки, диагностическое значение.

МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

КАБАРДИНО-БАЛКАРСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ К ЛАБОРАТОРНЫМ ЗАНЯТИЯМ

ПО ОБЩЕЙ МИКРОБИОЛОГИИ

12 3 4 5 6 7 8 9 Следующая ⇒