ТЕМА 1. МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ЛАБОРАТОРИИ И ИХ ОБОРУДОВАНИЕ. МЕТОДЫ МИКРОСКОПИИ

⇐ ПредыдущаяСтр 2 из 9Следующая ⇒

Лабораторные занятия по микробиологии, вирусологии и иммунологии начинаются с ознакомления студентов с организацией микробиологической лаборатории, её оборудованием, основными методами исследования.

В микробиологических лабораториях выполняется бактериологические, вирусологические и серологические анализы материалов, полученных от больных (с целью диагностики заболеваний), обследуются бактерионосители и проводятся санитарно – микробиологические исследования воды, воздуха, почвы, пищевых продуктов. Микробиологические лаборатории создаются при лечебных, учебных и научных учреждениях, санитарно – эпидемиологических станциях (СЭС).

Работа с болезнетворными микробами требует обязательного соблюдения ряда правил личной профилактики.

Правила работы в микробиологических лабораториях

1. Работа в лаборатории должна проводиться в сменной обуви, в медицинских халатах и шапочках. В необходимых случаях на лицо надевается маска. При работе с особо опасными микроорганизмами необходимо руководствоваться специальными инструкциями.

2. В лаборатории не разрешается курить и принимать пищу, а также делать лишние передвижения.

3. Рабочее место должно быть в образцовом порядке, личные вещи следует хранить в специально отведенных местах. Из личных вещей студента на рабочем столе допускается иметь только рабочую тетрадь, в которой делаются записи и зарисовки.

4. При случайном попадании заразного материала на стол или на пол это место тщательно обрабатывается дезинфицирующим раствором.

5. После окончания работы нужно тщательно вымыть руки и при необходимости обработать их дезинфицирующим раствором.

6. Хранение и уничтожение микроорганизмов проводится согласно специальным инструкциям.

Методы микробиологических исследований

Все микробиологические исследования могут быть сведены к 5 основным методам:

– микроскопический метод состоит в изучении исследуемого материала с помощью различных микроскопов;

– бактериологический (микологический, вирусологический) метод заключается в искусственном культивировании микроорганизмов и выделении чистых культур с последующей их идентификацией (определением вида);

– серологический метод основан на определении специфических антител к антигенам в крови и других биологических жидкостях пораженного организма с помощью различных реакций иммунитета;

– биологический; или экспериментальный, метод заключается в заражении животных исследуемым материалом с целью воспроизведения инфекционного заболевания или последующего выделения возбудителя;

– аллергический метод заключается в постановке кожных аллергических проб с соответствующими аллергенами с целью обнаружения повышенной чувствительности макроорганизма к определенным возбудителям инфекционных заболеваний или продуктам их жизнедеятельности.

Микроскопический метод исследования

Изучение морфологии микроорганизмов ввиду их малой величины возможно только с помощью микроскопа. Для микробиологических исследований используют несколько типов микроскопов (биологический, люминесцентный, электронный) и специальные методы микроскопии.

Современные световые микроскопы характеризуются предельной разрешающей способностью 0, 2 мкм, под которой понимают наименьшее расстояние между двумя точками, различимое с помощью микроскопа. Разрешающая способность микроскопа (d) описывается формулой: d =l/NA, где l – длина волны проходящего света, NА – численная (нумерическая) апертура объектива, равная n× sins (n – показатель преломления среды между объектом и объективом, а s – половина отверстного угла, образуемого двумя крайними лучами, попадающими в объектив). Для иммерсионных объективов NA=1, 25, для объективов сильного увеличения – 0, 65, для объективов слабого увеличения – 0, 2.

Общее увеличение микроскопа определяется произведением увеличения объектива на увеличение окуляра. В повседневной практике обычно используют увеличение порядка 630 – 900.

Основными разновидностями метода световой микроскопии являются:

Микроскопия в темном поле. Ее применяют для изучения неокрашенных микробов, их подвижности. Этот метод микроскопии требует специального конденсора с затемненной центральной частью, которая, задерживая центральную часть пучка лучей, пропускает лишь боковые косо направленные лучи. В связи с этим поле зрения остается неосвещенным, в то время как объекты, находящиеся в препарате, ярко светятся на темном фоне.

Люминесцентная микроскопия. Люминесценция – это свечение объекта, возбуждаемое поглощенной световой энергией (коротковолновая и ультрафиолетовая части спектра). Микробы обладают слабой собственной первичной люминесценцией, и поэтому на практике пользуются наведенной люминесценцией путем обработки объекта растворами; люминесцирующих красителей – флюорохромами, которые светятся под влиянием ультрафиолетовых и коротковолновых синих лучей. Отдельные флюорохромы обладают избирательностью, т. е. связываются с отдельными клеточными структурами (ядро, цитоплазма, включения). Для люминесцентной микроскопии необходим источник ультрафиолетового света и набор светофильтров.

Фазово–контрастная микроскопия. Изучение живых неокрашенных микробов затруднено в связи с их малой контрастностью. В видимом свете они прозрачны. Однако при прохождении света через микробную клетку происходит изменение фазы световых лучей, что обусловлено различиями толщины и показателей преломления отдельных структур. Эти изменения могут быть обнаружены при использовании специальных фазово–контрастных устройств, в результате чего микроорганизмы и отдельные части микробной клетки становятся контрастными и видимыми человеческим глазом.

В электронном микроскопе вместо световых лучей используется поток электронов, излучаемых специальным источником (электронная пушка). На пути потока электронов помещены электромагнитные линзы, которые для электронных лучей являются фокусирующими, т. е. действует подобно линзам для световых лучей. Исследуемый препарат, приготовленный на тончайшей пленке, помещают в безвоздушной среде на пути потока электронов после их прохождения через конденсорную линзу. Затем пучок электронов проходит через объективную и проекционные линзы. Изображение микроскопируемого объекта наблюдают на флюоресцирующем экране. Возникновение изображения на экране обусловлено тем, что различные части исследуемого объекта обладают неодинаковой проницаемостью для электронов.

Электронная микроскопия дает возможность изучать объекты величиной 10 – 10000 нм. Ее широко применяют для исследования тончайших структур бактериальной клетки и функциональных особенностей ее компонентов, для изучения морфологии и биологических свойств вирусов и фагов.

В сканирующем-зондовом микроскопе используют используют комбинации инвертированного оптического и зондового микроскопов. Минимальный шаг сканирования составляет 0, 01нм. Сканирующая-зондовая микроскопия применяется для определения плотности и размеров бактерий и вирусов, определения параметров состояния мембран (эластичности, проводимости), исследования структуры ДНК, особенностей биомакромолекул и антигенов поверхности клеток.

ЗАДАНИЕ

1. Ознакомиться с основным оборудованием микробиологической лаборатории, с лабораторной посудой, оборудованием рабочего места.

Микробиологическая лаборатория должна иметь лабораторные столы, покрытые материалами (линолеум, пластик), которые хорошо моются и могут подвергаться обработке дезинфицирующими растворами; винтовые табуреты, удобные как для микроскопирования, так и для другой работы; шкафы для посуды, питательных сред, реактивов.

Необходимым оборудованием микробиологической лаборатории являются: термостат, автоклав, сушильный шкаф, микроанаэростат, компрессор, холодильники, центрифуги, весы лабораторные и аналитические. Лаборатория оснащается необходимой посудой и инструментарием: пробирки бактериологические, серологические и центрифужные, чашки Петри, пипетки градуированные и пастеровские, стекла предметные и покровные, наборы инструментов, шприцы, стерилизаторы для инструментов, водяные бани, аппаратура для фильтрования и др. Для повседневной работы лаборатория должна располагать необходимыми питательными средами, химическими реактивами, диагностическими сыворотками и другими и лабораторными материалами.

Лабораторный стол оборудуется биологическим микроскопом, иммерсионным маслом, газовыми горелками (или спиртовками), бактериологической петлей, дезинфицирующим раствором, штативом для пробирок. Для окраски препаратов на столе должны находиться набор красителей, спирт, фильтровальная бумага, эмалированный кювет, емкость с водой, предметные стекла, пинцет для извлечения стекол, банка для отработанных стекол.

2. Освоить особенности работы с иммерсионной системой микроскопа при исследовании готовых препаратов.

При иммерсионной микроскопии окрашенных препаратов необходимо создавать хорошее освещение, для чего надо максимально поднять конденсор, открыть диафрагму конденсора, поставить малый сухой объектив на расстоянии 5 – 7 см от предметного столика и с помощью плоского зеркала установить равномерное освещение поля зрения. При работе с иммерсионной системой во избежание порчи объектива необходимо соблюдать следующие правила: после нанесения на поверхность препарата небольшой капли иммерсионного масла под контролем глаза сбоку погрузить в нее фронтальную линзу иммерсионного объектива, а затем, глядя в окуляр, при помощи сначала макрометрического, а затем микрометрического винта установить препарат в фокусе микроскопа. Микроскопирование необходимо проводить, не снимая руки с микрометрического винта, что дает возможность, изменяя фокусное расстояние, рассмотреть всю поверхность поля зрения. После работы иммерсионная система и столик микроскопа должны быть очищены от масла.

3. Микроскопировать нативные препараты бактерий.

При микроскопировании живых микроорганизмов можно, наряду с формой бактерий, наблюдать за их подвижностью, а также определить количество клеток в исследуемом объеме. Живые микроорганизмы исследуют в препаратах " висячая" и " раздавленная" капля.

Приготовление препарата " висячая капля"

На середину покровного стекла нанести каплю исследуемой жидкой культуры. Каплей вниз опустить покровное стекло на предметное стекло с углублением (лункой), края которого смазаны вазелином. Капля должна свободно свисать и не касаться дна краев углубления. Создается герметически закрытая камера, в которой бактерии можно наблюдать длительное время (4-6 часов). При малом увеличении найти край капли, после чего переместить ее в центр поля зрения и микроскопировать с объективом сильного увеличения и с иммерсионным объективом.

Приготовление препарата " раздавленная капля"

На середину предметного стекла нанести каплю жидкой бактериальной культуры. Осторожно накрыть её покровным стеклом, чтобы не было пузырьков воздуха, после чего микроскопировать с малым сухим, а затем с большим сухим и иммерсионным объективами.

Прижизненная окраска бактерий

Для такой окраски применяются сильно разбавленные растворы красителей, которые не оказывают токсического действия на бактерии. На предметное стекло нанести каплю 0, 001% раствора метиленового синего, в которую внести взвесь бактерий, после чего приготовить препарат " раздавленная капля" и микроскопировать его.

Контрольные вопросы

1. Что является предметом изучения микробиологии?

2. Какие разделы включает микробиология?

3. Основные этапы развития микробиологии.

4. Каковы принципы таксономии микроорганизмов?

5. В чем состоит нумерическая таксономия микроорганизмов?

6. Как строится номенклатура микроорганизмов?

7. Каково назначение микробиологической лаборатории?

8. В чем состоят основные правила работы в микробиологической лаборатории?

9. Каковы методы микробиологических исследований?

10. Из каких частей состоит биологический микроскоп?

11. Как определить увеличение микроскопа?

12. Что собой представляет разрешающая способность микроскопа? От чего она зависит?

13. Какие существуют методы микроскопирования?

14. Каковы правила работы с сухими объективами?

15. В чем состоит принцип иммерсионной микроскопии?

16. Каковы правила иммерсионной микроскопии?

17. В чем состоит фазово – контрастная микроскопия? Ее применение.

18. С какой целью применяется темнопольная микроскопия?

19. Каков принцип люминесцентной микроскопии?

20. В чем состоит электронная микроскопия? Каковы ее возможности?

21. В чем состоит принцип сканирущей-зондовой микрскопии?

22. Какими методами исследуются нативные препараты бактерий?

23. В чем состоит приготовление препарата " висячая капля"?

24. Как готовится препарат " раздавленная капля"?

25. В чем состоит прижизненная окраска бактерий?

⇐ Предыдущая 123 4 5 6 7 8 9 Следующая ⇒