Общая характеристика молочнокислых бактерий

О Т Ч Е Т

по договору №1-09/15 от 01 апреля 2015 г

«Определение антимикробного спектра действия новых штаммов Lactobacillus acidophilus, L. delbrueckii subsp. bulgaricus, выделенных из молочнокислых продуктов функционального назначения»

по теме: НУТРИЦИОЛОГИЧЕСКИЙ И ПРОБИОТИЧЕСКИЙ ПОТЕНЦИАЛ ФУНКЦИОНАЛЬНЫХ ПРОДУКТОВ ПИТАНИЯ, КОРМОВ И ВОДЫ

(№ госрегистрации 01201354138 Министерство сельского хозяйства Российской Федерации, руководитель Полянская И.С.)

РЕФЕРАТ

Проведены исследования по изучению антимикробного спектра действия 14 штаммов лактобацилл Lactobacillus acidophilus L.delbrueckii subsp. bulgaricus, выделенных из молочнокислых продуктов функционального назначения и предоставленных для исследований Вологодской государственной молочнохозяйственной академией им. Н.В. Верещагина.

Были определеныо температурные режимы и длительность культивирования исследуемых штаммов лактобацилл, необходимые для накопления биомассы и проявления их ингибиторной активности. Для изучения антимикробного спектра действия исследуемых штаммов лактобацилл проведен отбор тест-культур бактерий (грамположительных и грамотрицательных) и грибов. Уровень антибиотической активности культуральной жидкости лактобацилл и экстрактов рассчитывали по конкретной тест-культуре с использованием стандартных растворов эталонных препаратов (низина, левомицетина и нистатина). Установлено, что антибиотическая активность лактобацилл штаммоспецифична и зависит от времени культивирования.

Ключевые слова: Функциональное питание, Lactobacillus acidophilus. L. delbrueckii subsp. bulgaricus, антимикробный спектра действия, бактериоцин, низин, левомицетин, нистатин.

ОТЧЕТ: 39с., рис. 6, табл. 9, библ.55

Список сокращений

БГКП – бактерии группы кишечной палочки

ЖКТ – желудочно-кишечный тракт

ЛЖК – летучие жирные кислоты

МКБ – молочнокислые бактерии

ОП₅₄₀ _– оптическая плотность бактериальной суспензии при длине волны 540 нм

ФП – функциональное питание

«GRAS» - Generally Recognized as Safe – «признанные как абсолютно безопасные»

Содержание

ВВЕДЕНИЕ……………………………………………………………………..4 ГЛАВА I/ ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ…………………………………………….6

I.1. Функциональное питание.
1.2. Общая характеристика молочнокислых бактерий 1.3. Характеристика молочнокислых бактерий рода Lactobacillus 1.4. Основные антимикробные метаболиты лактобацилл. 1.5. Бактериоцины, синтезируемые бактериями рода Lactobacillus

ЗАКЛЮЧЕНИЕ………………………………………………………………18 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ………………………………...……….19 Глава II. Объекты и методы исследования
Глава ШI. Результаты исследований и их обсуждение. Ш.1.Изучение динамики роста лактобацилл Ш.2.Определение спектра антимикробного действия ВЫВОДЫ……………………………………………………………………..33 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ………………………………………...…………34

ВВЕДЕНИЕ

В последние годы организм человека подвергается воздействию целого комплекса неблагоприятных факторов, влияющих на нормальное функционирование основных систем жизнедеятельности: ухудшающаяся экологическая обстановка, увеличение количества стрессовых ситуаций, неправильное питание, а также бесконтрольное применение химиотерапевтических препаратов. Противостоять изменениям микробного состава организма под воздействием экологических, лекарственных, хирургических и других стрессовых агентов можно, обогатив микробиоту желудочно-кишечного тракта (ЖКТ) полезными микроорганизмами, вносимыми извне. Это открытие дало импульс развитию целого направления в микробиологии: учению о пробиотиках – живых микроорганизмах, которые, попадая в организм при приеме пищи в определенных количествах, оказывают благотворный эффект на здоровье человека. В настоящее время интенсивно развиваются науки о питании больного –диетология и здорового человека-нутрициология, что связано с разработкой и широким внедрением в производство новых видов бактериальных препаратов в качестве пробиотиков и продуктов функционального питания на их основе.

Молочнокислые бактерии (МКБ) уже более ста лет привлекают к себе внимание исследователей. Интерес многих ученых к МКБ связан с двумя практически важными аспектами: консервацией пищевых продуктов, а также их влиянием на здоровье человека. На взаимосвязь между МКБ и здоровьем человека впервые указал И.И.Мечников, предположив, что причиной большого количества заболеваний является отрицательное действие на клетки и ткани человеческого организма разнообразных токсинов и метаболитов, образуемых микроорганизмами, попадающими в организм человека. В поисках способов борьбы с преждевременной старостью И.И. Мечников указал на молочнокислой бактерии как антагонисты вредных микробов, обитающих в ЖКТ (Мечников, 1911). Этой гипотезе долгое время не придавали должного значения, и лишь в 1990-е годы после ряда успешных исследований ученые вновь вернулись к идее И.И. Мечникова о ведущей роли МКБ в поддержании здоровья человека. Эти исследования явились стимулом к изучению их бактерицидных и пробиотических свойств.

Как известно, МКБ тесно ассоциированы с пищевыми продуктами и имеют «GRAS» статус (Generally Recognized As Safe), что определяет их как абсолютно безопасные для здоровья человека и животных. В разных странах мира кисломолочные продукты пользуются заслуженной популярностью, поскольку многовековой опыт показал, что они оказывают благоприятное влияние на человеческий организм. Сегодня в мире очень широко распространены про- и пребиотические препараты. Традиционно пробиотики используются для подавления патогенных и условно- патогенных микроорганизмовой, восстановления нормальной микробиоты кишечника при острых кишечных инфекциях и дисбактериозах у детей и взрослых. Но, как показали исследования, действие пробиотиков не ограничивается коррекцией микробиоты, их клиническая эффективность основана также на иммуномодулирующих функциях и участии в обмене веществ. Это неудивительно, если учесть тот факт, что на протяжении очень долгого времени человек и его микробиота эволюционировали вместе и естественным образом выработали взаимовыгодные отношения (Hooper et al., 2002; Bä ckhed et al., 2005). Установлено, что организм человека населяет более 1800 родов и до 36 тысяч видов микроорганизмов. Основной составной частью многих про- и пребиотические препараты являются лактобациллы, обладающие ингибиторный эффектом на болезнетворные микробы. Aнтимикробными веществами лактобацилл являются органические кислоты, образуемые в процессе сбраживания простых сахаров, что приводит к быстрому закислению среды обитания и предотвращению развития других групп микроорганизмов, включая патогенные формы ( Leroy et al., 2006), а также другие метаболиты, относящихся к разным классам органических соединений и, в частности, бактериоцины - белковые вещества, различающиеся по структуре, компонентному составу и последовательности аминокислот, входящих в их молекулы, по биологическому действию на разные группы микроорганизмов. Белковые соединения являются малоизученными веществами. Выделение новых штаммов лактобацилл, синтезирующих антимикробные метаболиты и способных проявлять пробиотические свойства, является перспективным направлением развития фундаментальных исследовании, имеющих практическую значимость. Разработка и производство новых видов продукции, способствующей поддержанию и улучшению состояния здоровья населения, относится к одним из основополагающих социальных и экономических задач.

Цель работы – изучение антимикробного спектра действия новых штаммов Lactobacillus acidophilus, L. delbrueckii subsp. bulgaricus, выделенных из молочнокислых продуктов функционального назначения»

Работа выполнена в рамках программы Министерство сельского хозяйства Российской Федерации: НУТРИЦИОЛОГИЧЕСКИЙ И ПРОБИОТИЧЕСКИЙ ПОТЕНЦИАЛ ФУНКЦИОНАЛЬНЫХ ПРОДУКТОВ ПИТАНИЯ, КОРМОВ И ВОДЫ (ЦИТИС № госрегистрации № 01201354138 на 2013-2017 гг. рук. Полянская И.С., УДК 332.1 )

Глава I. Обзор литературы

I.1. Функциональное питание.

Резкое увеличение техногенной и антропогенной нагрузки на окружающую среду в последнее столетие обусловило снижение устойчивости человека к различным заболеваниям. Наряду с этим произошли значимые изменения в образе жизни и характере трудовой деятельности, структуре питания населения, в целом характеризующиеся повышенной энергетической ценностью рационов при снижении энерготрат организма, дисбалансом незаменимых нутриентов, дефицитом витаминов, ряда макро- и микроэлементов, минорных биологически активных веществ пищи. В связи с этим стала активно развиваться концепция оптимального здорового питания, направленного на максимальное удовлетворение индивидуальных потребностей организма в энергетических, пластических, регуляторных и иных биологически активных соединениях и компонентах пищи, необходимых для нормального протекания физиологических процессов, поддержания здоровья и предотвращения возможности развития острых и хронических заболеваний (Волгарев М.Н., 2000; 5, Спиричев В.Б.и др., 2000 ). В силу того, что потребитель осведомлен о тесной связи между образом жизни, питанием и здоровьем человека в настоящее время во многих развитых странах появился неподдельный интерес к употреблению в пищу продуктов, полезных для здоровья, и развития концпепции «функционального питания» (Harzallah, Belhadj, 2013; Niazi Amraii et al., 2014).

В рамках концепции были выделены три основных качества функциональных продуктов: необходимая пищевая ценность, приятный вкус, положительный физиологический эффект, оказываемый на организм (Артюхова, Гаврилова, 2010). Под функциональным продуктом питания (ФП) понимают пищевой продукт, предназначенный для систематического употребления в составе пищевых рационов всеми возрастными группами здорового населения, снижающий риск развития заболеваний, связанных с питанием, сохраняющий и улучшающий здоровье за счет наличия в его составе физиологически активных функциональных ингредиентов (de Almada et al., 2015). В состав продуктов функционального назначения могут входить следующие ингредиенты (Kawther El-Shafie et al., 2010; Артюхова, Гаврилова, 2010):

витамины группы В, С, Д и Е;

натуральные каротиноиды (каротины и ксантофиллы), среди которых важная роль отводится β -каротину;

минеральные вещества (кальций, магний, натрий, калий, йод, железо, селен, кремний);

балластные вещества – пищевые волокна пшеницы, яблок и апельсинов, представленные целлюлозой, гемицеллюлозой, лигнином и пектином, а также полифруктозан инулина, содержащийся в цикории, топинамбуре;

протеиновые гидролизаты растительного (пшеница, соя, рис) и животного происхождения;

ненасыщенные жирные кислоты, к числу которых следует отнести полиненасыщенные омега-3 жирные кислоты (докозангексаеновая и эйкозапентаеновая);

катехины, антоцианы;

лактобациллы, бифидобактерии (препараты бифидобактерин, лактобактерин, колибак-терин, бификол).

При разработке и создании продуктов функционального питания необходимо знать химический состав сырья, пищевую ценность, специальные приемы технологической обработки. К категориям функционального питания относят пробиотики, пищевые волокна, олигосахариды, витамины, минеральные вещества, полиненасыщенные жирные кислоты, сахароспирты, холины, аминокислоты, протеины, пептиды, спирты, органические кислоты, изопреноиды, антиоксиданты (Артюхова, Гаврилова, 2010; Червинец. и др., 2012; 2013)

Научную основу «Концепции государственной политики в области здорового питания населения России составляет теория сбалансированности рационов по основным важнейшим компонентам для людей различных возрастных групп, уровней физической и умственной нагрузки. Термин «здоровое питание» предусматривает использование в рецептурах продуктов нового поколения экологически чистого сырья и полуфабрикатов, рациональное сочетание которых гарантирует полноценное обеспечение пищевыми и биологически активными веществами всех жизненно важных систем организма.

За последние годы функциональные продукты приобрели широкую известность. Первые проекты по созданию функциональных продуктов были начаты в Японии в 1984 г., а к 1987 г. их вырабатывалось уже около 100 наименований. В настоящее время в общем объеме пищевых продуктов функциональные продукты составляют около 5 %. Специалисты считают, что ФП на 40-50% заменят традиционные лекарственные препараты профилактической медицины. Ежедневное употребление ФП способствует сохранению и улучшению здоровья. Изменяя соотношение и массовую долю поступающих с функциональными продуктами пищевых и биологически активных веществ, можно регулировать обменные процессы, проходящие в организме человека.

Функциональные продукты для питания организма человека— специальные пищевые продукты, предназначенные для систематического употребления в составе пищевых рационов всеми возрастными группами здорового населения, обладающие научно обоснованными (в единичных случаях) и подтвержденными свойствами, снижающие риск развития заболеваний, связанных с питанием, предотвращающие дефицит или восполняющие имеющийся в организме человека дефицит питательных веществ, сохраняющие и улучшающие здоровье за счет наличия в их составе физиологически функциональных пищевых ингредиентов.

Многовековой опыт показал, что кисломолочные продукты оказывают благоприятное влияние на человеческий оранизм, используются для подавления патогенных и условно- патогенных микроорганизмовой, восстановления нормальной микробиоты кишечника при острых кишечных инфекциях и дисбактериозах у детей и взрослых. Основной составной частью многих про- и пребиотические препаратов являются лактобациллы, обладающие ингибиторный эффектом на болезнетворные микробы.

В природе молочнокислые бактерии приурочены к местообитаниям, богатым питательными веществами: молоко, мясо, овощи, некоторые виды обитают на растениях, другие составляют нормальную микробиоту пищеварительного тракта человека и животных (Atanassova et al., 2003).

Источником энергии для молочнокислых бактерий служит молочнокислое брожение. Известны два основных пути превращения сахаров, используемых МКБ: гликолиз (путь Эмбдена-Мейергофа-Парнаса) и 6-фосфоглюконат-фосфокетолазный путь (путь Варбурга-Хорекера) (Salminen, 1998).

В результате гликолиза образуется до 98% молочной кислоты: С₆Н₁₂О₆®2СН₃СНОHСООН+Е.

Бактерии, входящие в эту группу, называются гомоферментативными. К представителям гомоферментативного молочнокислого брожения относятся следующие МКБ: Lactococcus lactis subsp. lactis, Lc. lactis subsp. cremoris, Streptococcus thermophilus, Lactobacillus delbrueckii bv. bulgaricus, L. acidophilus, L. helveticus, L. casei, L. plantarum.

Во втором, 6-фосфоглюконат-фосфокетолазном пути, в добавление к молочной кислоте в процессе молочнокислого брожения образуются значительные количества уксусной кислоты, этилового спирта, углекислого газа и иных побочных нейтральных продуктов (диацетила, ацетоина), и на это идет до 50% сбраживаемых гексоз. Этот тип брожения называется гетероферментативным:

С₆Н₁₂О₆ ® СН₃СНОHСООН + СН₃СН₂ОН (или СН₃СOОН) + СО₂ + Е.

Известен другой тип гетероферментативного молочнокислого брожения, когда бактерии вместо этанола образуют другие спирты, например, маннит, глицерин.

Процесс гетероферментативного молочнокислого брожения более сложный, чем гомоферментативного типа.

Представителями гетероферментативных молочнокислых бактерий являются некоторые палочковидные лактобациллы: L.brevis, L.fermentum, их подрод Streptobacterium, из кокковых —Streptococcus acetoinicus, виды рода Leuconostoc (Ленгелер и др., 2005).

Изучая молочнокислое брожение в динамике развития культур было установлено, что химические превращения в среде изменяются по ходу развития. При сбраживании углеводов ясно можно различить две фазы (Безбородов, 1991; Sirisansaneeyakul et al., 2007).

В первый период (логарифмическая фаза роста бактерий) идет интенсивный синтез белков и других веществ тела, которые являются более восстановленными, чем углеводы. В среде накапливаются более окисленные продукты обмена: из гексозов образуется фосфорглицериновая кислота (ФГК) в результате окисления фосфорглицеринового альдегида (ФГА) - гомоферментативный тип брожения, или уксусная кислота и СО₂ как при гетероферментативном типе. Вторая фаза характеризуется замедлением биосинтеза веществ клеток, происходит постепенное снижение окислительно-восстановительного потенциала в культуре, что приводит к ускорению передачи водорода на ФГК с последующим восстановлением ее в молочную кислоту.

Двухфазность отражает перераспределение окислительно-восстановительных реакций по ходу биосинтеза структурных элементов клетки бактерий - конструктивныхпроцессов и брожения - энергетического процесса. Сбраживание углеводов по типу молочнокислого брожения, как правило, коррелирует с рядом других признаков.

1.3. Характеристика молочнокислых бактерий рода Lactobacillus

актобациллы – грамположительные, не образующие спор, каталазо-отрицательные микроорганизмы при условии выращивания их на среде без гема (например, на среде, содержащей кровь), обычно неподвижные палочки, способны использовать нитрат в качестве источника энергии. В качестве основного источника энергии лактобациллы используют глюкозу, сбраживая ее либо по гомоферментатичному пути до молочной кислоты, выход которой может достигать 85%, либо по гетероферментативному пути – до молочной кислоты, СО₂, этанола или уксусной кислоты в эквимолярных количествах. Ввиду долгого потребления их вместе с пищей, а также отсутствия среди них патогенов, им был присвоен статус GRAS (Avall-Jä ä skelä inenandPalva, 2005).

Род Lactobacillus вместе с родом Pediococcus составляют семейство Lactobacillaceae и включает 80 видов и 15 подвидов (Hammes, Hertel, 2006). По современной классификации род Lactobacillus входит в семейство Lactobacillaceae, порядок Lactobacillales, класс Bacilli, филум Firmicutes, домен Eubacteria (De Vos et al., 2009). Классическое разделение лактобацилл базируется на типах брожения: 1) облигатно гомоферментативное, 2) факультативно гетероферментативное и 3) облигатно гетероферментативное. Лактобациллы, входящие в группы 1 и 2, а также некоторые гетероферментативные представители из группы 3, используются в производстве ферментированных продуктов питания. Но среди представителей 3 группы встречаются такие микроорганизмы, которые способны вызывать порчу продуктов питания.

В отличие от кокковидных МКБ, лактобациллы не были разделены на разные роды по их гомо- или гетероферментативному брожению гексоз. Нынешний таксономический статус лактобацилл основывается на классическом фенотипическом подразделении, показанном в таблице 2 (жирным шрифтом – лактобациллы, важные для производства продуктов питания, а также пробиотики. L. fructosus включен в группу Leuconostoc. Группа 1 включает в себя облигатных гомоферментативных лактобацилл, которые сбраживают глюкозу исключительно в молочную кислоту и не сбраживают пентозы или глюконовую кислоту. Она представлена термобактериями Орла-Йенсена и важными видами, связанными с продуктами питания: L. acidophilus, L. delbrueckii и L. helveticus и L. kefiranofaciens (Stiles, Holzapfel, 1997).

Группа 2 включает в себя факультативно гетероферментативных лактобацилл, которые сбраживают гексозы в молочную кислоту и могут образовывать газ из глюконата, но не из глюкозы. Они также сбраживают пентозы с помощью, индуцируемой фосфокетолазы с образованием молочной и уксусной кислот. Виды в этой группе – это L. casei и L. plantarum. Лактобациллы L. casei встречается во многих местообитаниях, включая молочные продукты, силос, рот и кишечник человека (табл.2). Особенно тесно он связан с хлебными заквасками и некоторыми сортами брынзы и может вызывать порчу сыров путем сбраживания цитрата с выходом диоксида углерода. Вид плохо определен и включает пять подвидов, выделенных по фенотипическим признакам (Stiles, Holzapfel, 1997).

Группа 3 включает облигатных гетероферментативных лактобацилл, которые сбраживают гексозы в молочную, уксусную кислоты и/или этанол и СО₂. Образование газа из глюкозы является отличительной чертой этих бактерий. Самым важным облигатным гетероферментативным представителем лактобацилл, связанным с продуктами питания, является L. sanfrancisco, который превращает мальтозу в молочную и уксусную кислоты, а также выделяет разнообразные вкусовые вещества в хлебных заквасках.

Таблица 12.

Основные группы в рамках рода Lactobacillus на основе фенотипических характеристик

Группа 1 Облигатные гомоферментативное брожение	Группа 2 Факультативное гетероферментативное брожение	Группа 3 Облигатное гетероферментативное брожение
L. acidophilus	L. acetotolerans	L. brevis
L. amylophilus	L. agilis	L. buchneri
L. amylovorus	L. alimentarus	L. collinoides
L. aviarius subsp. araffinosus	L. bifermentans	L. fermentum
L. aviaries subsp. aviarius	L. casei	L. fructivorans
L. crispatus	L. coryniformis subsp. Coryniformis	L. fructosusa
L. delbrueckii subsp. bulgaricus	L. coryniformis subsp. torquens	L. hilgardii
L. delbrueckii subsp. delbrueckii	L. curvatus	L. kefir
L. delbrueckii subsp. lactis	L. graminis	L. malefermentans
L. farciminis	L. hamster	L. oris
L. gallinarum	L. homohiochii	L. panis
L. gasseri	L. intestinalis	L. parabuchneri
L. helveticus	L. murinus	L. parakefir
L. jensenii	L. paracasei	L. pontis
L. johnsonii	L. paracasei subsp. paracasei	L. reuteri
L. kefiranofaciens	L. paracasei subsp. tolerans	L. sanfrancisco
L. kefirgranum	L. paraplantarum	L. suebicus
L. mali	L. pentosus	L. vaccinostercus
L. ruminis	L.plantarum	L. vaginalis
L. salivarius subsp. salicinus	L. rhamnosus
L. salivarius subsp. salivarius	L. sake
L. sharpeae

Таблица 2.

Местообитания представителей рода Lactobacillus (Stiles, Holzapfel, 1997).

Организм человека	Полость рта
Желудочно-кишечный тракт
Влагалище
Другие местообитания	Растения и растительные материалы
Почва, вода, стоки, навоз
Ферментированные продукты (молоко, мясо, овощи)
Зерновые продукты
Силос
Порча продуктов	Пиво
Фруктовые и зерновые пюре
Маринованная рыба
Обработка сахара
Молоко
Мясо и мясные продукты
Ферментированные напитки

Для успешного культивирования того или иного микроорганизма питательные среды по своим свойствам должны быть приближены к естественным условиям его обитания. Для культивирования бактерий рода Lactobacillus используются среды, богатые питательными веществами (дрожжевой экстракт, гидролизат обезжиренного молока, пептон, твин-80), различными солями, в том числе ацетатом натрия и др., и имеющие низкий уровень рН (4.5–6.2). Бактерии рода Lactobacillus относятся к микроорганизмам, имеющим сложные питательные потребности. Для их активного развития требуется наличие веществ, необходимых для построения бактериальной клетки (нуклеиновых кислот, полисахаридов, аминосахаров и т.д. (Беспоместных, Короткая, 2011). Так, для роста большинства молочнокислых палочек необходимы органические формы азота, которые они сами не синтезируют. Многим видам лактобацилл для развития необходимы витамины. Этим объясняется значительное влияние на их рост добавок к питательной среде различных экстрактов (например, дрожжевого, кукурузного), а также других соединений.

Из специальных питательных сред наиболее широкое распространение получила среда МРС (Манна-Рогозы-Шарпа). Среда богата питательными веществами и ростовыми факторами; содержит дрожжевой и мясной экстракты, глюкозу, пептон, ацетат натрия, цитрат аммония и твин-80 – источник жирных кислот, необходимых для метаболизма лактобактерий. Кислотность среды 6.2–6.4. Среда МРС может применяться как для работы с пробиотическими лактобациллами, так и для выделения этих микроорганизмов из продуктов питания и природных биотопов (Беспоместных, Короткая, 2011).

Лактобациллы способны расти там, где высокое содержание растворимых углеводов, продуктов распада белков, витаминов и при низком парциальном давлении кислорода. Их относят к ацидофилам; разные виды лактобацилл приспособились расти в самых разных условиях окружающей среды, что обусловливается производством ими большого количества молочной кислоты, которая снижает pH субстрата, подавляя тем самым рост многих бактерий (Hammes and Hertel, 2006).

Многие лактобациллы присутствуют в заквасках, используемых для приготовления молочнокислых продуктов. При хранении таких заквасок бактерии подвергаются стрессам: воздействию низких температур и понижению кислотности среды. Такие стрессы отражаются на постоянстве микробиоты заквасок для приготовления национальных молочнокислых продуктов.

Рассмотрим коротко некоторые из стрессовых ответов бактерий рода Lactobacillus.

Во время брожения МКБ производят большое количество молочной кислоты – слабой органической кислоты, котораяв неионизированной форме при низких значениях pH легко проникает через мембрану. При высоких значениях pH ионизация молочной кислоты может привести к снижению внутриклеточного pH, что в конечном итоге проявляется в стрессовом ответе клетки.

Выживание в условиях стресса, вызванного изменениями pH, обусловливается изменениями процесса синтеза белков, вызванного синтезом белков шока. При изучении L.delbrueckii subsp. bulgaricus. Silva (Silvaetal., 2005)с коллегами установили, чтобольшее разнообразие белков выделяется при контролируемом значении pH, чем в неконтролируемых условиях. Клетки, выращенные в условиях неконтролируемого pH, отличались большей выживаемостью при нагревании и сушке, но не при хранении их в лиофильном состоянии.

Другой эффективный механизм устойчивости к кислотному стрессу –проявление глутаматдекарбоксилазной (GAD) активности. Экспрессия GAD генов предположительно контролируется подкислением цитозоля путем декарбоксилирования кислот окружающей среды (глутамата) в нейтральное соединение (γ -аминомасляную кислоту) благодаря присоединению ионов Н⁺. После этого γ -аминомасляная кислота (ГАМК) транспортируется во внеклеточную среду, способствуя, тем самым, подщелачиванию среды (Cotter, Hill, 2003). Штаммы L.paracasei, L.delbrueckii subsp.bulgaricus и L.plantarum - продуценты γ -аминомасляной кислоты, способны выжить в условиях, имитирующих желудочно-кишечные заболевания, при этом, синтезируя ГАМК (Siragusa et al., 2007). Для повышения функциональной ценности молочнокислой продукции при приготовлении сыра или закваски для ферментации используются штаммы с высокой способностью синтеза ГАМК.

При кислотном стрессе у L. delbrueckii subsp. bulgaricus избыточно экспрессируются GroES, GroELиDnaK, а у Lactobacillus sanfranciscensisколичество GroES, DnaK остается на постоянном уровне, тогда как количество GrpE увеличивается, что свидетельствует о посттранскрипционном механизме защиты (DeAngelisetal, 2001; De Angelis and Gobbetti, 2004). Также у L. delbrueckii subsp. bulgaricus индуцируется ряд генов (например, fabH, accC, fabI), участвующих в биосинтезе жирных кислот клеточных мембран (Streit et al., 2007; Streitetal, 2008). Молочная кислота индуцирует экспрессию нескольких белков клеточной стенки неустановленной функции, которые могут быть ответственны за изменение ffh L. acidophilus (Azcarate-Peril et al., 2004). Кислотный стресс индуцирует синтез экзополисахарида (ЭПС) в закваске лактобацилл (Gaenzle and Schwab, 2009). В целом, ЭПСS повышает выживаемость микробных клеток в условиях кислотного стресса, заметно способствует улучшению текстуры, реологии, ощущений во рту, вкуса и более долгому хранению продуктов брожения (Ruas-Madiedo et al., 2000; Tieking and Gaenzle, 2005

Таблица 3.

Низкомолекулярные вещества молочнокислых бактерий, имеющие антибактериальную активность ( Helander et al., 1997).

Соединение	Микроорганизм – продуцент	Микроорганизм – мишень
Кислоты: Молочная кислота Уксусная кислота	Все МКБ МКБ с гетероферментативным типом сбраживания сахаров	Все рН зависимые микроорганизмы
Спирты	Дрожжи, МКБ с гетероферментативным типом сбраживания сахаров	Все микроорганизмы
Углекислый газ	МКБ с гетероферментативным типом сбраживания сахаров	Большинство микроорганизмов
Диацетил (2, 3-бутандион)	Lactococcus spp.	Дрожжи, грамотрицательные бактерии (Salmonella, Yersinia, Escherichia, Aeromonas) при концентрации ≥ 200ppm; грамположительные бактерии (Bacillus) при концентрации ≥ 300 ppm
Перекись водорода	МКБ	Все микроорганизмы
Реутерин (β – гидроксипропионовый альдегид)	Lactobacillus reuteri	Широкий спектр: грамположительные бактерии (Clostridium, Staphylococcus, Listeria); грамотрицательные бактерии (Salmonella, Shigella), грибы (Candida)
Смесь низкомолекулярных антибактериальных веществ (бензойная кислота, лактон мевалоновой кислоты, метилгидантоин)	Lactobacillus sp. (например, Lactobacillus plantarum)	Pantoea agglomerans (грамотрицательная бактерия), Fusarium avenaceum (грибы)

1.5. Бактериоцины, синтезируемые бактериямирода Lactobacillus

Исследования в области бактериоцинов начались в 1930-х годах с работы по низину. Сегодня большое количество бактериоцинов открыто и в них замечено большое разнообразие.

Самыми первыми были открыты колицины. Они являются как бы эталоном, в сравнении с которым определяются свойства других бактериоцинов, позволяющие объединить их в особую группу антибиотических веществ. Колицин N - это бактериоцин, который убивает чувствительные клетки E. coli. После связывания колицина с находящимся на поверхности клетки E. coli рецептором, существует короткий период, в течение которого значительное число клеток, связанных с молекулами колицина, являются чувствительными к внешним ферментам.

Адсорбция колицинов на чувствительных клетках ведет к подавлению синтеза ДНК, РНК и белка. При обработке ингибированных клеток трипсином все эти синтезы восстанавливаются. По-видимому, одна единица колицина воздействует на какой-то компонент, контролирующий все макромолекулярные синтезы. Таким компонентом является бактериальная хромосома. Синтетические хромосомные механизмы в клетке при действии колицина остаются неповрежденными и начинают функционировать при замещении поврежденной хромосомы бактерии хромосомой фага (Cao et al., 2002).

Бактериоцины - экстрацеллюлярные биологически активные продукты метаболизма белковой природы, синтезируемые грамотрицательными (например, E. coli, Pseudomonas fluorescens и др.) и грамположительными бактериями (например, лактококки Lactococcus lactis ssp. lactis, Lactobacillus, Bacillus subtilis, Mycobacterium tuberculosis) (Кудлай, 1996; Szabo et al., 1998).

Бактериоцины встречаются у бактерий самой различной морфологии (кокки, палочки, вибрионы и др.), у аэробов и анаэробов, у споровых и бесспоровых форм и именуются в соответствии с видовым названием продуцента: колицины, пиоцины, пестицины, туберкулоцины, мегацины, вибриоцины.

Бактериоцины отличаются от антибиотиков. Последние являются веществами, которые продуцируются как микроорганизмами-прокариотами, так и эукариотами и являются ингибиторами при низких концентрациях других организмов, которые тоже могут быть прокариами или эукариотами. Все бактериоцины по биохимической природе являются белками. В пользу этого предположения свидетельствует тот факт, что большинство антибактериальных веществ, относящихся к бактериоцинам, разрушаются протеолитическими ферментами, но у разных бактериоцинов чувствительность к протеазам варьирует. Некоторые бактериоцины резистентны к действию протеаз. Устойчивые к протеазам бактериоцины чаще встречаются у грамположительных бактерий. При попытках получения бактериоцинов в чистом виде рядом авторов было установлено, что бактериоцины грамотрицательных бактерий представляют собой комплексы, состоящие из белка, углевода и липида. Однако, биологической активностью и в этих случаях обладал лишь белковый компонент (Klaenhammer, 1993; Nes et al., 1996).

В отличие от общеизвестных антибиотиков бактериоцины, как правило, характеризуются специфическим и сравнительно узким спектром действия. Они активны в основном только против бактерий того же или филогенетически родственных видов. Эта специфичность действия наиболее выражена у бактериоцинов uрам-отрицательных бактерий. Так, колицины подавляют рост кишечных бактерий, вибриоцины- против холерного вибриона. Для грамположительных микробов характерен более широкий круг специфичности. Например, стафилококкцины, помимо стафилококков, могут убивать листереллы (некоторые штаммы), дифтерийных коринебактерий. В свою очередь, бактериоцины грамположительных бактерий могут быть не активны против грамотрицательных бактерий.

Кроме видовой и родовой специфичности имеет место и штаммовая специфичность: некоторые бактериоцины могут отличаться друг от друга по спектру действия в пределах штаммов одного и того же вида, появление антибактериальной активности у МКБ не является признаком вида, а является штаммоспецифичным признаком (Стоянова и др., 2012; Bodaszewska-Lubas, 2012).

Бактериоцины составляют большое семейство полипептидов, которые подразделяются на различные классы, основываясь на их действии и их структуре.

Внутри этого разнообразия видны некоторые общие элементы, которые позволяют разделить их на несколько классов. Определены следующие классы бактериоцинов:

Таблица 4.

Классификация и общая характеристика бактериоцинов молочнокислых бактерий ( Oppegard et al., 2007 )

Классы бактериоцинов	Подклассы бактериоцинов	Молекулярная масса	Характеристика класс/подкласса	Бактериоцин
Класс I	IA	< 5 кДа	лантибиотики	низин (Hechard et al., 2002; Xie et al., 2004)
IB	марсацидин аламетицин (Hechard et al., 2002)
Класс II	IIa	< 10 кДа	педиоцин-подобные бактериоцины	сакацинА, сакацинР (Nissen-Meyer et al., 2009)
IIb	Двупептидные бактериоцины	лактацин F (Nissen-Meyer et al., 2009)
IIc	sec-зависимые бактериоцины	карно-бактериоцин (Nissen-Meyer et al., 2009)
Класс III	-	> 30 кДа		лактококцинВ (Oppegard et al., 2007)
Класс IV	-	большие белок/ пептидно – липидные комплексы с углеводами		лейкоцин S, мезентероцин 52 (Oppegardetal., 2007)

I) лантибиотики, II) небольшая группа термостабильных, нелантибиотических бактериоцинов, III) большая группа термолабильных бактериоцинов и класс IV. большие белок/ пептидно – липидные комплексы с углеводами.

Педиоцин - подобные бактериоцины, которые синтезируются Pediococcus acidilactici PO2. Это бактерицидные полипептиды с очень сходными первичными структурами. Педиоцин РА-1, сакацин Р, карвацин А и леакоцин А различаются по их токсичности против различных бактериальных штаммов].

12 3 Следующая ⇒