Основные антимикробные метаболиты лактобацилл

⇐ ПредыдущаяСтр 2 из 3Следующая ⇒

Помимо основных продуктов, образующихся в процессе гомо- и гетероферментативного брожений, молочнокислые бактерии синтезируют и небольшие органические молекулы, которые придают продуктам питания некоторые особенности и органолептические свойства (Caplice, Fitzgerald, 1999).

Брожение, сопровождающееся понижением pH в связи с выделением молочной и других органических кислот, является важным фактором для подавления роста нежелательных микроорганизмов. Низкий pH делает органические кислоты растворимыми, что позволяет им проникать через клеточную мембрану, поражая, таким образом, цитоплазму патогенного микроорганизма (Haller et al., 2001). К тому же, многие штаммы МКБ производят различные антибактериальные вещества. Антибактериальные вещества МКБ разделяют на: вещества с низкой молекулярной массой (LMM); 2) вещества с высокой молекулярной массой (HMM).

К первой группе веществ (LMM) относят перекись водорода, углекислый газ, диацетил (2, 3-бутандион), реутерин (β – гидроксипропионовый альдегид), спирты, молочную и уксусную кислоты. Выборочные данные по спектру низкомолекулярных веществ МКБ, имеющих антибактериальную активность, представлены в табл.3.

Ко второй группе (HMM) относят вещества белковой природы, такие как бактериоцины и фунгицины (Atanossova et al., 2003; Schnü rer, Magnusson, 2005). Многие штаммы МКБ синтезируют антибактериальные вещества, наиболее перспективными из которых являются бактериоцины (De Vuyst & Leroy, 2007).

Такие микроорганизмы, подавляющие рост патогенных микроорганизмов, обнаружены в молоке, мясе и молочнокислых продуктах, а также в квашеных овощах, напитках. Среди гетероферментативных лактобацилл L. reuteri вызывает значительный интерес тем, что он выделяет антимикробный метаболит – реутерин (3-гидроксипропионовый альдегид), который активен против широкого спектра микроорганизмов (Stiles, Holzapfel, 1997).

При выделении лактобацилл из внешней среды, молочных продуктов и других источников возникает необходимость дифференциации их друг от друга и других бактерий. Для решения подобных задач созданы селективные среды, основной особенностью которых был низкий уровень рН (< 5, 4) и высокая концентрация ионов ацетата, который является ингибитором многих микроорганизмов (Беспоместных, Короткая, 2011).

Таблица 3.

Низкомолекулярные вещества молочнокислых бактерий, имеющие антибактериальную активность ( Helander et al., 1997).

Соединение	Микроорганизм – продуцент	Микроорганизм – мишень
Кислоты: Молочная кислота Уксусная кислота	Все МКБ МКБ с гетероферментативным типом сбраживания сахаров	Все рН зависимые микроорганизмы
Спирты	Дрожжи, МКБ с гетероферментативным типом сбраживания сахаров	Все микроорганизмы
Углекислый газ	МКБ с гетероферментативным типом сбраживания сахаров	Большинство микроорганизмов
Диацетил (2, 3-бутандион)	Lactococcus spp.	Дрожжи, грамотрицательные бактерии (Salmonella, Yersinia, Escherichia, Aeromonas) при концентрации ≥ 200ppm; грамположительные бактерии (Bacillus) при концентрации ≥ 300 ppm
Перекись водорода	МКБ	Все микроорганизмы
Реутерин (β – гидроксипропионовый альдегид)	Lactobacillus reuteri	Широкий спектр: грамположительные бактерии (Clostridium, Staphylococcus, Listeria); грамотрицательные бактерии (Salmonella, Shigella), грибы (Candida)
Смесь низкомолекулярных антибактериальных веществ (бензойная кислота, лактон мевалоновой кислоты, метилгидантоин)	Lactobacillus sp. (например, Lactobacillus plantarum)	Pantoea agglomerans (грамотрицательная бактерия), Fusarium avenaceum (грибы)

1.5. Бактериоцины, синтезируемые бактериямирода Lactobacillus

Исследования в области бактериоцинов начались в 1930-х годах с работы по низину. Сегодня большое количество бактериоцинов открыто и в них замечено большое разнообразие.

Самыми первыми были открыты колицины. Они являются как бы эталоном, в сравнении с которым определяются свойства других бактериоцинов, позволяющие объединить их в особую группу антибиотических веществ. Колицин N - это бактериоцин, который убивает чувствительные клетки E. coli. После связывания колицина с находящимся на поверхности клетки E. coli рецептором, существует короткий период, в течение которого значительное число клеток, связанных с молекулами колицина, являются чувствительными к внешним ферментам.

Адсорбция колицинов на чувствительных клетках ведет к подавлению синтеза ДНК, РНК и белка. При обработке ингибированных клеток трипсином все эти синтезы восстанавливаются. По-видимому, одна единица колицина воздействует на какой-то компонент, контролирующий все макромолекулярные синтезы. Таким компонентом является бактериальная хромосома. Синтетические хромосомные механизмы в клетке при действии колицина остаются неповрежденными и начинают функционировать при замещении поврежденной хромосомы бактерии хромосомой фага (Cao et al., 2002).

Бактериоцины - экстрацеллюлярные биологически активные продукты метаболизма белковой природы, синтезируемые грамотрицательными (например, E. coli, Pseudomonas fluorescens и др.) и грамположительными бактериями (например, лактококки Lactococcus lactis ssp. lactis, Lactobacillus, Bacillus subtilis, Mycobacterium tuberculosis) (Кудлай, 1996; Szabo et al., 1998).

Бактериоцины встречаются у бактерий самой различной морфологии (кокки, палочки, вибрионы и др.), у аэробов и анаэробов, у споровых и бесспоровых форм и именуются в соответствии с видовым названием продуцента: колицины, пиоцины, пестицины, туберкулоцины, мегацины, вибриоцины.

Бактериоцины отличаются от антибиотиков. Последние являются веществами, которые продуцируются как микроорганизмами-прокариотами, так и эукариотами и являются ингибиторами при низких концентрациях других организмов, которые тоже могут быть прокариами или эукариотами. Все бактериоцины по биохимической природе являются белками. В пользу этого предположения свидетельствует тот факт, что большинство антибактериальных веществ, относящихся к бактериоцинам, разрушаются протеолитическими ферментами, но у разных бактериоцинов чувствительность к протеазам варьирует. Некоторые бактериоцины резистентны к действию протеаз. Устойчивые к протеазам бактериоцины чаще встречаются у грамположительных бактерий. При попытках получения бактериоцинов в чистом виде рядом авторов было установлено, что бактериоцины грамотрицательных бактерий представляют собой комплексы, состоящие из белка, углевода и липида. Однако, биологической активностью и в этих случаях обладал лишь белковый компонент (Klaenhammer, 1993; Nes et al., 1996).

В отличие от общеизвестных антибиотиков бактериоцины, как правило, характеризуются специфическим и сравнительно узким спектром действия. Они активны в основном только против бактерий того же или филогенетически родственных видов. Эта специфичность действия наиболее выражена у бактериоцинов uрам-отрицательных бактерий. Так, колицины подавляют рост кишечных бактерий, вибриоцины- против холерного вибриона. Для грамположительных микробов характерен более широкий круг специфичности. Например, стафилококкцины, помимо стафилококков, могут убивать листереллы (некоторые штаммы), дифтерийных коринебактерий. В свою очередь, бактериоцины грамположительных бактерий могут быть не активны против грамотрицательных бактерий.

Кроме видовой и родовой специфичности имеет место и штаммовая специфичность: некоторые бактериоцины могут отличаться друг от друга по спектру действия в пределах штаммов одного и того же вида, появление антибактериальной активности у МКБ не является признаком вида, а является штаммоспецифичным признаком (Стоянова и др., 2012; Bodaszewska-Lubas, 2012).

Бактериоцины составляют большое семейство полипептидов, которые подразделяются на различные классы, основываясь на их действии и их структуре.

Внутри этого разнообразия видны некоторые общие элементы, которые позволяют разделить их на несколько классов. Определены следующие классы бактериоцинов:

Таблица 4.

Классификация и общая характеристика бактериоцинов молочнокислых бактерий ( Oppegard et al., 2007 )

Классы бактериоцинов	Подклассы бактериоцинов	Молекулярная масса	Характеристика класс/подкласса	Бактериоцин
Класс I	IA	< 5 кДа	лантибиотики	низин (Hechard et al., 2002; Xie et al., 2004)
IB	марсацидин аламетицин (Hechard et al., 2002)
Класс II	IIa	< 10 кДа	педиоцин-подобные бактериоцины	сакацинА, сакацинР (Nissen-Meyer et al., 2009)
IIb	Двупептидные бактериоцины	лактацин F (Nissen-Meyer et al., 2009)
IIc	sec-зависимые бактериоцины	карно-бактериоцин (Nissen-Meyer et al., 2009)
Класс III	-	> 30 кДа		лактококцинВ (Oppegard et al., 2007)
Класс IV	-	большие белок/ пептидно – липидные комплексы с углеводами		лейкоцин S, мезентероцин 52 (Oppegardetal., 2007)

I) лантибиотики, II) небольшая группа термостабильных, нелантибиотических бактериоцинов, III) большая группа термолабильных бактериоцинов и класс IV. большие белок/ пептидно – липидные комплексы с углеводами.

Педиоцин - подобные бактериоцины, которые синтезируются Pediococcus acidilactici PO2. Это бактерицидные полипептиды с очень сходными первичными структурами. Педиоцин РА-1, сакацин Р, карвацин А и леакоцин А различаются по их токсичности против различных бактериальных штаммов].

В настоящее время открыто большое количество бактериоцинов и в них замечено большое разнообразие. Внутри этого разнообразия мы теперь видим некоторые общие элементы, которые позволяют разделить их на несколько классов.

Наиболее известным и изученным бактериоцином является полипептидный антибиотик низин, который выпускается под торговой маркой Nisaplin (“Applin & Barrett, Ltd.”, Великобритания) и широко используется как биологический консервант при производстве продуктов питания. Основным продуцентом низина являются молочнокислые бактерии Lactococcus lactis subsp. lactis. Известно несколько форм низина (A, B, C, D, E, Z), различающиеся по структуре, компонентному составу и последовательности аминокислот, входящих в их молекулы, а также по биологическому действию на разные группы микроорганизмов.

Низин имеет уникальное строение, он содержит 34 остатка аминокислот (из них 30 остатков кислот, His, Asp, Ser, Pro, Gli, Ala, Val, Met, Ile, Leu), а также остатки редко встречающихся серосодержащих аминокислот: лантионина, b-метиллантионина и ненасыщенных аминокислот дегидроаланина и b- метилдегидроаланина. Биологическая активность низина обусловлена наличием в его молекуле a-, b-ненасыщенных аминокислот Низин обладает бактерицидным действием на грамположительные микроорганизмы: стрептококки различных серологических групп, стафилококки, пневмококки, микобактерии, споровые - аэробные и анаэробные бактерии. Обладая способностью адсорбироваться на поверхности спор чувствительных к нему спорообразующих микроорганизмов, низин нарушает проницаемость мембран, снижает термоустойчивость спор (Стоянова и д. 2012).

Синтез бактериоцинов - наследственная особенность организмов, проявляющаяся в том, что каждый штамм способен образовывать один или несколько определенных, строго специфичных для него антибиотических веществ.

На синтез оказывают влияние условия культивирования продуцента: состав питательной среды, рН, температура, а также время инкубации продуцента. К тому же, ограничения некоторых веществ, необходимых для клеточного метаболизма и энергетического обмена, могут значительно снизить синтез бактериоцина.

Бактериоцины не действуют на бактериоциногенные популяции, способные осуществлять синтез гомологичных антибактериальных веществ. Это принципиально общее свойство четко выражено у грамотрицательных бактерий, как правило, иммунных к гомологичному бактериоцину. Бактериоцины грамположительных бактерий (мегацины, стафилококкцины) в этом отношении ведут себя иначе. Они могут действовать и на бактерии продуцирующей их популяции. По-видимому, эти различия определяются биохимическими особенностями поверхностных структур у тех и других микроорганизмов и особенностями механизмов действия бактериоцинов. В отличие от бактериоцинов грамотрицательных бактерий некоторые бактериоцины Грамположительных оказывают разрушающее действие на цитоплазматическую мембрану клеток. Чувствительность или резистентность бактерий к действию бактериоцина определяется наличием специальных структур - рецептеров на поверхности клетки и, по- видимому, этим определяется избирательная активность бактериоцинов в отношении бактерий того же или близко родственных видов.

Как альтернатива к традиционным химическим консервантам, бактериоцины являются весьма перспективными. Бактериоцины могут использоваться для контроля присутствия патогенных микроорганизмов, например, L.monocytogenes. Кроме того, в случае использования вместе со специфическими физическими методамии химическими препаратами, ингибирующий эффект многих бактериоцинов может быть увеличен. Это может обеспечить безопасность продуктов.

В законодательстве Европейского Сообщества бактериоцины определены как пищевые добавки для использования в пищевых продуктах и относятся к категории консервантов.

Поиск природных консервантов, отвечающих требованиям потребителей и производителей, актуальный вопрос и для Российской Федерации. К сожалению, изучение бактериоцинов в России ведется в недостаточной степени Класс бактериоцинов IIа с одной или двумя парами цистеиновых остатков относят к «цистиобиотикам», в то время как бактериоцины с одной цистеиновой аминокислотой, находящиеся в редуцированной тиоловой форме, относят к «тиолбиотикам». Бактериоцины c двумя дисульфидными мостиками имеют более широкий спектр активности, чем с одним, которые в свою очередь активнее «тиолбиотиков» (van Belkum, Stiles, 2000). Sec-зависимые бактериоцины были отнесены к отдельному подтипу второго класса (Nes et al, 1996). Им не требуются специфические секреционные белки: их экспорт основывается на общих секреционных путях клетки. Их лидерный пептид похож на сигнальный пептид, как было показано в случае с дивергицином А, синтезируемым Carnobacterium divergens. К этому классу также был отнесен ацидоцин В, синтезируемый Lactobacillus acidophilus и похожий на газерцин А (класс IIс бактериоцинов) продуцируемый Lactobacillus gasseri. Лидерный пептид ацидоцина В может выступать в качестве сигнального пептида. В то же время последовательность его аминокислот гомологична лидерному пептиду лантибиотиков. Ацидоцин обладает широким антибактериальным спектром, кроме активности в отношении лактобацил.

В последние годы острым ребром встала проблема устойчивости бактерий к антибиотикам из-за их широкого применения в лечении болезней человека и животных (Yoneyama and Katsumata, 2006). Как следствие, большое количество устойчивых к антибиотикам штаммов вызывает некоторые трудности в их использовании. Поэтому продолжающиеся открытия новых антимикробных препаратов становятся более значимыми для медицины (Fisher et al., 2005).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Молочнокислые бактерии как антагонисты вредных микробов, обитающих в желудочно-кишечном тракте человека, уже свыше ста лет привлекают к себе возрастающее внимание исследователей, разнообразны области их применения: от биоконсервации продуктов до создания пробиотических препаратов – одного из новейших и очень важных направлений на сегодняшний день.

В последнее время установлено, что организм человека населяет более 1800 родов и до 36 тысяч видов микроорганизмов. В дистальном отделе организма основными представителями микробиоты являются молочнокислые бактерии. В ходе своего метаболизма они продуцируют целый спектр веществ, необходимых и полезных для здоровья человека и принимают самое деятельное участие в поддержании иммунной системы человека, что важно для создания пробиотических препаратов и биоконсервантов.

В литературном обзоре рассмотрены основные физиолого-биохимические свойства молочнокислых бактерий, их антимикробные метаболиты: бактериоцины, низкомолекулярные антимикробные метаболиты и фунгицидные метаболиты. Во всех разделах основное внимание было уделено лактобациллам, как выбранным объектам исследования. Была показана актуальность использования этих молочнокислых бактерий в качестве биоконсервантов и изучение их пробиотических свойств, так как они влияют на динамическое равновесие симбионтных микроорганизмов нормальной микробиоты желудочно-кишечного тракта человека.

С давних времен проблема качества пищевых продуктов и интересовала людей. В последние годы все больше внимания уделяется поиску новых веществ, обладающих антибактериальным потенциалом и лишенных недостатков классических антибиотиков (Senok, 2005). Такой антибактериальной активностью во многом обладают МКБ, отличительной физиологической чертой которых является синтез органических кислот (молочной, уксусной и др.), а также способность некоторых штаммов МКБ синтезировать бактериоцины и бактериоцинподобные молекулы, которые демонстрируют ингибирующую активность по отношению к патогенным бактериям, вызывающим порчу продуктов питания и пищевого сырья (De Vuyst, 1994; Ross et al., 2002, Schnü rer, Magnusson, 2005; De Vuyst, Leroy, 2007). Лактобациллы встречаются на разных субстратах, богатых питательными веществами. Они тесно ассоциированы с пищевыми продуктами и имеют «GRAS» статус, таким образом, их использование абсолютно безопасно для здоровья человека и животных. Первичный и основной эффект, вызываемый МКБ, – выделение лактата и его быстрое накопление, приводящее к снижению рН и, следовательно, закислению среды, Антимикробные метабилиты лактобацилл разделяют на: 1) вещества с низкой молекулярной массой (перекись водорода, углекислый газ, диацетил, реутерин, спирты, органические кислоты и др.); 2) вещества с высокой молекулярной массой (вещества белковой природы, такие как бактериоцины и фунгицины (Atanossova et al., 2003; Schnü rer, Magnusson, 2005). Наиболее перспективными в плане применения являются вещества, относящиеся ко второй группе. Бактериоцины грамположительных бактерий очень разнообразны. Выделяют 4 класса бактериоцинов с учетом их химического строения, молекулярной массы, чувствительности к действию фермента, состава (содержание модифицированных аминокислот) и механизма действия, из них наиболее изученными являются первые два класса (Oppegard et al., 2007). К первому классу относят наиболее полно изученный лантибиотик низин. В настоящее время низин одобрен в качестве пищевого консерванта в более чем 50 странах, единственный из бактериоцинов имеет статус «GRAS» (Generally Recognised as Safe), что позволяет широко использовать его в пищевой промышленности в качестве биоконсерванта. Надо заметить, что широкому использованию низина препятствуют несколько существенных ограничений: 1) низин имеет узкий спектр действия, направленный преимущественно на Грам-положительных бактерий; 2) проявляет антибактериальную активность главным образом в кислой; 3) различные соединения, находящиеся в самих продуктах пищевого сырья (эмульгаторы, фосфолипиды, жирные кислоты и др.), способны препятствовать действию низина; 4) действие протеаз; 5) адсорбция низина на частицах пищи и на клетках-продуцентах ( De Vuyst, Leroy, 2007; Стоянова и др.2012). Доказано, что различные бактериоцины, продуцируемые бактериями рода Lactobacillus, способны ингибировать рост таких патогенных грамположительных бактерий, как: Streptococcus agalactiae, Listeria innocua, а также патогенных грамотрицательных бактерий: Salmonella enterica, Escherichia coli (Prado Acosta et al., 2008). Важно отметить, что механизмы действия бактериоцинов так же, как и классы бактериоцинов, изучены не до конца. Молочнокислые бактерии рода Lactobacillusи их метаболиты, включая бактериоцины, находят широкое применение в пищевой промышленности: производстве кисломолочных продуктов, в том числе сыров, сухих колбас, мяса, консервированных овощей, оливок, алкогольных напитков и т.д. (De Vuyst, Leroy, 2007; de Barros et al., 2010). Учитывая, что потребность в антимикробных и пробиотических препаратах растет с каждым годом, поиск таких метаболитов среди непатогенных форм микроорганизмов (в том числе среди МКБ) является актуальной задачей.

Экспериментальная часть

⇐ Предыдущая 123 Следующая ⇒