ОСНОВНЫЕ ПРИНЦИПЫ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ

⇐ ПредыдущаяСтр 7 из 44Следующая ⇒

Для выделения чистой культуры микроорганизмов, изучения их биологических свойств с целью идентификации, а также для получения биомассы необходимо размножить микроорганизмы в условиях лаборатории. Культивирование, или выращивание, микробов возможно лишь при создании определенных условий для их жизнедеятельности. Большинство бактерий, дрожжей, плесеней культивируют на искусственных питательных средах. Вирусы и риккетсии размножаются только в живых клетках, культуре тканей, курином эмбрионе или в организме животного.

Искусственные среды, применяемые для культивирования микроорганизмов, должны соответствовать определенным требованиям: быть легкоусвояемыми, с необходимым составом азотистых и углеводных веществ, витаминов, необходимой концентрацией солей, с определенным водородным показателем (рН среды); обладать буферными- свойствами; иметь оптимальный окислительно-восстановительный потенциал.

Питательные среды должны также содержать достаточное количество воды и обязательно быть стерильными, т. е. до посева не содержать микроорганизмов. Источником азота в средах могут быть различные органические, редко - неорганические соединения. Часто к безбелковым средам добавляют пептон, представляющий собой продукт неполного гидролиза белка. Протеолитические микроорганизмы в качестве азотистого вещества могут использовать желатин («животный студень»). Источником углерода в питательных средах чаще служат углеводы, спирты, некоторые органические кислоты.

Для приготовления искусственных питательных сред можно использовать различные естественные продукты: молоко, кровь, сыворотку, мясо, желток куриного яйца, картофель и другие органические вещества и минеральные соли.

Искусственные питательные среды по назначению подразделяют на четыре основные группы: универсальные, специальные, избирательные (элективные) и дифференциально-диагностические.

К универсальным средам относят мясо-пептонный бульон и мясо-пептонный агар, на которых растут многие виды патогенных и непатогенных бактерий. Специальные среды применяют для выращивания бактерий, не размножающихся на универсальных средах. К специальным относят среды с молоком, сывороткой крови, с добавлением крови животных, глюкозы и др. На них выращивают молочнокислые бактерии, патогенные и другие микроорганизмы.

В избирательных (элективных) средах хорошо развиваются только бактерии определенных видов. К таким средам относятся среды обогащения, в которых интересующий исследователя вид растет быстрее сопутствующих бактерий. Например, среда Кесслер, содержащая в своем составе генцианвиолет и желчь крупного рогатого скота, элективна для устойчивых к. этим веществам грамотрицательных кишечных палочек и вместе с тем селективна для чувствительных грамположительных бактерий.

Дифференциально-диагностические среды используют для дифференциации определенных видов бактерий по их культуральным и биохимическим свойствам. К ним относятся:

среды для определения протеолитической активности (мясопептонный желатин - МПЖ, молочный агар и др.);

среды для определения ферментации углеводов (среды Гисса, Эндо, Плоскирева и др.);

среды для определения гемолитической способности (кровяной агар и другие среды с добавлением крови животных);

среды для определения восстановительной (редуцирующей) способности микроорганизмов (среда Вильсон-Блера);

селективные среды, применяемые для дифференциации прототрофных и ауксотрофных бактерий.

По консистенции питательные среды могут быть плотными, полужидкими и жидкими. Для получения сред плотной консистенции' к жидким средам добавляют 2-2, 5 % агара или 10-20 % желатина. Полужидкие среды получают при добавлении 0, 5- 1, 0 % агара. Агар (по-малайски «желе») - плотное волокнистое вещество, получаемое из красных водорослей и образующее в водных растворах плотный гель (студень). Он состоит в основном из полисахаридов (70-75 %). Основными компонентами агара являются высокомолекулярные вещества агароза и агаропептин, которые не расщепляются и не усваиваются микроорганизмами. В связи с этим агар не является питательным субстратом, его добавляют в среды исключительно для получения плотной консистенции. Агар расплавляется в воде при 100 °С, а застывает при 40-43 °С. Его выпускают в виде желтоватых пластинок или серовато-белого порошка.

Осмотические условия, необходимые для жизнедеятельности микробов, создают в питательной среде добавлением хлорида натрия или определенным сочетанием солей фосфата натрия и фосфата калия.

Для жизнедеятельности микроорганизмов большое значение имеет реакция среды - водородный показатель (рН), который определяется соотношением водородных (Н⁺) и гидроксильных (ОН^-) ионов. Он представляет собой логарифм числа абсолютной концентрации водородных ионов.

Водородный показатель нейтральной реакции соответствует 7, 0. В этом случае число водородных ионов равно числу гидроксильных. Показатель ниже 7, 0 указывает на кислую реакцию, а выше 7, 0 - на щелочную. Микроорганизмы приспособились развиваться в условиях с чрезвычайно широким диапазоном рН - от 2, 0 до 8, 5. Большинство сапрофитных и патогенных микроорганизмов культивируют при слабощелочной реакции среды с рН 7, 2-7, 4. Для культивирования молочнокислых бактерий, дрожжей и плесеней необходима кислая реакция среды, рН 5, 0-6, 5.

В настоящее время многие питательные среды выпускают в виде готовых сухих сред-полуфабрикатов, содержащих все необходимые для жизнедеятельности микроорганизмов ингредиенты. Для приготовления питательной среды порошок разводят водой, полученную смесь кипятят, устанавливают необходимое значение рН и стерилизуют.

Большое значение для роста и размножения микроорганизмов на искусственных питательных средах имеют температурные условия. По отношению к температурному режиму все микроорганизмы делят на три группы: психрофильные (холодолюбивые), мезофильные (средние), термофильные (теплолюбивые). Температурные границы размножения у психрофилов составляют от 0 до 20 °С, у мезофилов - от 20 до 45 °С, у термофилов - от 45 до 70 °С.

При выращивании аэробов посевы культивируют в термостатах при доступе кислорода воздуха, т. е. в обычных условиях. Для культивирования анаэробов создают бескислородные условия, которые можно достичь физическими, химическими и биологическими методами. Используют также анаэробные термостаты.

Физические методы основаны на создании вакуума в специальных аппаратах анаэростатах или в вакуум-эксикаторах, в которые сначала помещают посевы, а затем в аппаратах создают разрежение.

Иногда воздух в анаэростатах заменяют углекислым газом, азотом или другим инертным газом. Доступ кислорода в питательную среду можно затруднить, если культивировать анаэробов в глубине столбика питательного агара или внутри запаянных стеклянных трубок. Анаэробные условия можно создать и более простыми способами: с помощью слоя агара, залитого поверх посевов на плотной питательной среде, или с помощью вазелинового масла, которым покрывают жидкую питательную среду (среда Китта-Тароцци).

Химические методы заключаются в том, что в эксикатор с посевами помещают химические вещества, например пирогаллол и щелочь, реакция между которыми идет с поглощением кислорода.

Биологический метод основан на одновременном культивировании аэробов и анаэробов на плотных питательных средах в герметически закупоренных чашках Петри. При этом кислород поглощается растущими аэробами, посеянными на одной половине среды, после чего начинается рост анаэробов, посев которых сделан на другой половине.

ОБРАЗОВАНИЕ МИКРООРГАНИЗМАМИ ПИГМЕНТОВ И АРОМАТИЧЕСКИХ ВЕЩЕСТВ. СВЕЧЕНИЕ МИКРОБОВ

Пигменты. Некоторые виды бактерий и грибов, обитающих в почве, воде и воздухе, способны вырабатывать красящие вещества, называемые пигментами.

Пигменты подразделяют на растворимые в воде, растворимые в спирте, нерастворимые в воде и спирте. Различают также хромопарные пигменты, которые поступают во внешнюю среду, и хромофорные пигменты, находящиеся в цитоплазме, вакуолях и оболочке.

Образование пигментов происходит при хорошем доступе кислорода, у большинства видов при рассеянном солнечном свете и оптимальной температуре 20-25 °С.

Микроорганизмы выделяют различные пигменты, цвет которых определяют по окраске колоний на плотной питательной среде, а иногда по цвету жидкой питательной среды. Растворимый в воде синий пигмент пиоцианин образует синегнойная палочка (Pseudomonas aeruginosa). Пигмент вызывает порок молока, окрашивая его в синий цвет. Зеленый водорастворимый пигмент флюоресцин образуют флюоресцирующие палочки (Ps. fluorescens); красный, растворимый в спирте пигмент продигиозин продуцирует чудесная палочка (Serratia marcescens). Пигменты красного цвета могут выделять также актиномицеты и дрожжи, розовый пигмент - дрожжи и розовый микрококк. Стафилококки образуют пигменты золотистого, белого и желтого цветов. Колонии сарцин окрашиваются в желтый, лимонный или золотистый цвет. Плесневые грибы продуцируют преимущественно нерастворимые в воде и спирте пигменты черного, зеленого, бурого, шоколадно-коричневого цветов. Бурого цвета пигмент образуют некоторые штаммы спорообразующих гнилостных аэробов (грибовидная, капустная палочки).

При отсутствии благоприятных условий пигментобразующие микроорганизмы не продуцируют пигменты и образуют бесцветные (серовато-белые колонии).

Пигментообразование у микробов имеет определенное физиологическое значение. Пигменты обеспечивают защиту клеток от природной ультрафиолетовой радиации, участвуют в биохимических реакциях, обладают антибиотическим действием.

Ароматические вещества. Некоторые микроорганизмы в процессе жизнедеятельности вырабатывают летучие ароматические вещества, сообщающие молочным продуктам (маслу, сыру) приятные специфические запах и вкус. Из этих веществ наибольшее значение имеют диацетил, летучие кислоты, этиловый спирт, уксусноэтиловый и уксусноамиловый эфиры и др.

Среди молочнокислых бактерий наиболее интенсивно выражено ароматообразование у гетероферментативных молочнокислых стрептококков Lactococcus diacetylactis, Leuconostoe cremoris, Leuconostoc dextranicum.

На интенсивность ароматообразования влияют температура сквашивания молока, реакция и окислительно-восстановительные условия среды. Оптимальными условиями ароматообразования для молочнокислых стрептококков являются: температура 23-25 °С; рН среды около 5, 0; окислительно-восстановительный потенциал Eh 6; периодическое перемешивание закваски с целью обогащения ее кислородом.

Ароматические вещества при длительном хранении продукта разрушаются, особенно при высоких плюсовых температурах.

Свечение микроорганизмов. Свечение (люминесценция) представляет собой своеобразную форму освобождения энергии при окислительных процессах. Светящиеся микроорганизмы могут вызывать свечение различных пищевых продуктов (мяса, рыбы, сыра и т. д.). Они проникают в тело мелких ракообразных, обусловливая яркое свечение этих животных ночью у берега моря. У некоторых рыб светящиеся бактерии являются постоянными симбионтами (сожителями), служащими источником света. Светятся некоторые грибы, живущие в старых пнях и корнях деревьев.

Светящиеся бактерии называют фотобактериями. К ним относятся некоторые кокки, вибрионы, палочки, красящиеся по Граму отрицательно, не образующие спор.

Большая часть видов светящихся бактерий являются аэробами, они не вызывают гниения, растут на рыбных и мясных субстратах, культивируются в обычных средах. Оптимальная температура роста и свечения 15-18 °С, содержание хлорида натрия около 3 %. Типичным представителем фотогенных микробов является Fotobacterium phosphoreum - неподвижная кокковидная палочка, развивающаяся при 28 °С, при температуре выше 30 °С рост прекращается. Протеолитические свойства не выражены, желатин не разжижает.

Подавляется развитие фотогенных микробов при уменьшении концентрации солей в среде, под действием сульфаниламидных и других химических препаратов, звуковых колебаний, механического растирания, при экстракции различными растворителями, медленном автолизе и др.

⇐ Предыдущая 2 3 4 5 678 9 10 11 Следующая ⇒