ГНИЛОСТНЫЕ (ПРОТЕОЛИТИЧЕСКИЕ) БАКТЕРИИ

⇐ ПредыдущаяСтр 16 из 44Следующая ⇒

Они являются основными возбудителями порчи молочных продуктов, вызывают распад белков (протеолиз), в результате чего могут возникать различные пороки пищевых продуктов, зависящие от глубины распада белка. Антагонистами гнилостных являются молочнокислые бактерии, поэтому гнилостный процесс распада продукта возникает там, где не идет кисломолочный процесс.

Протеолиз (протеолитические свойства) изучают посевом микроорганизмов в молоко, молочный агар, мясопептонный желатин (МПЖ) и в свернутую кровяную сыворотку.

Свернувшийся белок молока (казеин) под влиянием протеолитических ферментов может свертываться с отделением сыворотки (пептонизация) или растворяться (протеолиз).

На молочном агаре вокруг колоний протеолитических микроорганизмов образуются широкие зоны просветления молока.

В МПЖ посев производят уколом внутрь столбика среды. Посевы выращивают 5-7 сут при комнатной температуре. Микробы, обладающие протеолитическими свойствами, разжижают желатин. Микроорганизмы, не обладающие протеолитической способностью, растут в МПЖ без его разжижения.

В посевах на свернутой кровяной сыворотке протеолитические микроорганизмы также вызывают разжижение, а микробы, не обладающие этим свойством, не изменяют ее консистенцию.

При изучении протеолитических свойств определяют также способность микроорганизмов образовывать индол, сероводород, аммиак, т. е. расщеплять белки до конечных газообразных продуктов.

Гнилостные бактерии имеют очень широкое распространение. Они встречаются в почве, воде, воздухе, кишечнике человека и животных, на пищевых продуктах. К этим микроорганизмам относятся спорообразующие аэробные и анаэробные палочки, пигментообразующие и факультативно-анаэробные бесспоровые бактерии.

Спорообразующие. К гнилостным аэробам относятся Вас. subtilis -сенная палочка, Вас. mesentericus - картофельная палочка, Вас. megatherium - капустная палочка, Вас. mycoides - грибовидная палочка, Вас. cereus и др.

К спорообразующим гнилостным анаэробам относятся бактерии рода Clostridium (Cl. putrificum, Cl. sporogenes, Cl. perfringens и другие виды).

Спорообразующие аэробы и анаэробы относятся к одному семейству Васillасеае.

Все спорообразующие гнилостные представляют собой довольно крупные толстые палочки, достигающие размеров 0, 5-2, 5 х 10 (у клостридий - до 20) мкм, по Граму красятся положительно, подвижные до момента спорообразования, капсул не образуют. Исключение составляет Cl. perfringens - неподвижная, образующая капсулы палочка. Клетки располагаются беспорядочно, у Вас. cereus и Вас. mycoides -цепочками

Наиболее короткими являются клетки сенной палочки. У бацилл споры располагаются, как правило, центрально, у клостридий -субтерминально. Последние чаще имеют вид теннисной ракетки, ложки или лодочки. У Cl. sporogenes почти все клетки содержат споры (рис. 29). Клетки Cl. perfringens, как правило, спор не содержат и располагаются часто в виде частокола или римской цифры V.

Спорообразующие аэробы хорошо растут на обычных питательных средах. На МПБ они вызывают помутнение среды, часто - образование пленки и хлопьевидного осадка. Вас. cereus помутнения не вызывает, а образует незначительный осадок, поднимающийся при встряхивании пробирки в виде облачка или комочка ваты.

Рисунок 29 ‑ Спорообразующие гнилостные: Вас. subtilis: а - колонии; б - клетки; Вас. mycoides: в - колонии; г - клетки; Cl. sporogenes: д - колонии; е - клетки

Вас. subtilis формирует поверхностную морщинистую беловатую пленку.

На МПА аэробные бациллы вырастают в виде крупных колоний серовато-белого цвета. Вас. mycoides образует корневидные колонии, напоминающие мицелий гриба, откуда и происходит название палочки (от греч. myces - гриб) (рисунок29). Некоторые штаммы этого микроорганизма выделяют коричневый или розово-красный пигмент. Бурый или коричневый пигмент могут выделять также штаммы Вас. mesentericus.

Вас. subtilis формирует сухие морщинистые беловатые колонии. Колонии Вас. cereus под малым увеличением микроскопа имеют локонообразный край или вид головы медузы.

Спорообразующие анаэробы выращивают на специальных питательных средах — мясо-пептонном печеночном бульоне (МППБ), среде Китта-Тароцци, а также на глюкозо-кровяном агаре. Они вызывают помутнение бульона, на агаре образуют округлые мелкие колонии с зоной гемолиза, т. е. просветления — растворения эритроцитов крови.

Спорообразующие обладают хорошо выраженными протеолитическими свойствами: разжижают желатин, свертывают и пептонизируют молоко, вызывают гемолиз, выделяют аммиак, сероводород, а анаэробы выделяют еще и индол. Способны ферментировать многие углеводы, за исключением Cl. putrificum, который не обладает сахаролитическими свойствами.

Бесспоровые. Включают пигментообразующие и факультативно-анаэробные бактерии. К пигментным гнилостным относят Pseudomonas fluorescens, Ps. aeruginosa (семейство Pseudomonadaceae), Serratia marcescens (семейство Enterobacteriaceae) (соответственно флюоресцирующая, синегнойная и чудесная палочки). Группу факультативно-анаэробных бактерий составляют Proteus vulgaris (палочка протея) и кишечная палочка рода эшерихия (Escherichia coli) (семейство Enterobacteriaceae).

Бесспоровые гнилостные представляют собой мелкие (1-2 х 0, 6 мкм) грамотрицательные подвижные палочки, не образующие спор и капсул. Клетки располагаются беспорядочно. Наиболее короткими коккобактериями являются клетки чудесной палочки. Палочка протея имеет полиморфные клетки (рисунок 30).

Бесспоровые палочки являются в основном мезофилами. Бактерии рода Pseudomonas часто могут быть психрофилами. Микроорганизмы хорошо растут на обычных питательных средах. На МПБ вызывают обильное помутнение бульона, иногда появление пленки, пигментообразующие — изменение цвета среды. На МПА образуют экрашенные в цвет пигмента округлые блестящие полупрозрачные колонии (рисунок 30).

Рисунок 30 ‑ Бесспоровые гнилостные: Pseudomonas aeruginosa: a - колонии; б - клетки; Pseudomonas fluorescens: в - клетки

Флюоресцирующие палочки выделяют зеленовато-желтый пигмент, который растворяется в воде, и поэтому МПА окрашивается также в цвет пигмента.

Синегнойная палочка также выделяет водорастворимый пигмент сине-зеленого цвета, который состоит из двух пигментов: голубого - пиоцианина и желтого - флюоресцина.

Чудесная палочка образует колонии, окрашенные в ярко-красный или вишнево-красный цвет благодаря нерастворимому в воде пигменту продигиозину.

Палочка протея не образует колоний на плотной питательной среде, а растет в виде нежного вуалеобразного налета («ползучий рост»). Эшерихия образует серые средних размеров полупрозрачные колонии.

Бесспоровые палочки разжижают желатин, свертывают и пептонизируют молоко, образуют аммиак, иногда сероводород и индол. Сахаролитические свойства выражены у них слабо.

Палочка протея обладает большой протеолитической активностью. Ее обнаруживают в 100 % проб продуктов, пораженных гниением. В связи с этим дано родовое название Proteus, обозначающее «вездесущий», видовое название vulgaris обозначает «обычный», «простой».

Кишечная палочка рода эшерихия обладает незначительной протеолитической способностью. Так как она не гидролизует цельную белковую молекулу, то к гнилостному процессу подключается на стадии пептонов, расщепляя их с образованием аминов, аммиака, сероводорода. Вызывает свертывание молока, не разжижает желатин, обладает высокой ферментативной активностью в отношении лактозы, глюкозы и других Сахаров.

Для количественного учета протеолитических микроорганизмов (кроме Е. coli) используют молочный агар. Отдельно приготовляют 2%-ный водный агар и обезжиренное молоко. Обе среды стерилизуют отдельно при 121 °С 10 мин. При употреблении к расплавленному агару добавляют 20 % обезжиренного горячего молока и после тщательного перемешивания смесь, выливают в чашки Петри.

Для приготовления водного агара в 1 дм³ питьевой воды вносят 20 г мелко измельченного агара и нагревают до кипения.. После растворения агара смесь в горячем состоянии фильтруют через ватный фильтр, разливают в колбы по 50-100 см³, закрывают ватными пробками и стерилизуют.

Для определения количества протеолитических бактерий проводят посев по 1 см³ каждого из выбранных разведений продукта на чашки Петри и заливают молочным агаром. Посевы выдерживают в термостате при 30 °С в течение 48 ч и после этого подсчитывают число выросших колоний протеолитических бактерий (с широкими зонами просветления молока).

Способностью расщеплять белки обладают также плесени и актиномицеты. Многие протеолитические микроорганизмы образуют фермент липазу, вызывающий распад жиров. Наиболее выраженной липолитической способностью обладают плесени, флюоресцирующие палочки и другие бактерии рода Pseudomonas.

МАСЛЯНОКИСЛЫЕ БАКТЕРИИ

Они являются возбудителями маслянокислого брожения, в результате которого молочный сахар и соли молочной кислоты (лактаты) расщепляются с образованием масляной, уксусной, пропионовой, муравьиной кислот, этилового, бутилового, пропилового спиртов. Они способны расщеплять белки и усваивать азот из белков, аминокислот, аммиака, а некоторые представители — молекулярный азот из воздуха.

Маслянокислые бактерии относят к роду Clostridium, объединяющему 25 видов почвенных анаэробов (Cl.pasteurianum, Cl.butyricum, Cl.tyrobutyricum и др.), которые ранее объединяли под общим названием Cl. amylobacter.

Маслянокислые бактерии представляют собой грамположительные палочки цилиндрической формы размером 5-12 х 0, 5-1, 5 мкм, подвижные до момента спорообразования. Капсул не образуют, споры располагаются терминально и субтерминально. Клетки имеют вид булавы, теннисной ракетки или ложки (рисунок 31). Споры выдерживают кипячение в течение 2-3 мин, при пастеризации не погибают. Перед образованием спор в цитоплазме клеток накапливается гранулеза - крахмалоподобное вещество, окрашивающееся йодом в синий цвет.

Рисунок 31 ‑ Маслянокислые бактерии

Маслянокислые бактерии являются облигатными анаэробами. Особенностями развития этих микроорганизмов являются бурное газообразование и неприятный запах масляной кислоты. Оптимальная температура развития 30-35°С, температурные пределы роста 8-45 °С.

В учебной лаборатории культуру маслянокислых бактерий получают на картофельной среде. В небольшую длинногорлую колбу или высокую пробирку вносят несколько кусочков неочищенного картофеля, заливают водой на 3/4 объема, добавляют 1-2 г. мела и пастеризуют при 80 °С в течение 10 мин, после чего термостатируют при 37 °С. Через 1-2 сут развивается маслянокислое брожение.

В сыроделии количественный учет спор маслянокислых бактерий (мезофильных анаэробных лактатсбраживающих бактерий) проводят на плотной лактатно-ацетатной селективной среде (гл. 18).

Количественный учет маслянокислых бактерий производят также методом предельных разведений, высевая исследуемый материал в пробирки со стерильным цельным молоком или с обезжиренным молоком и парафином (1-2 г). После посева пробирки нагревают в водяной бане в течение 10 мин при температуре 90 °С, охлаждают до 30°С и выдерживают в термостате в течение 3 сут. при температуре 30°С.

Наличие маслянокислых бактерий определяют по образованию газа, запаху масляной кислоты, наличию в микроскопическом препарате крупных споровых палочек, дающих положительную реакцию на гранулезу. Гранулеза - крахмалоподобное вещество, являющееся цитоплазматическим включением и окрашивающееся йодом (раствором Люголя) в синий цвет.

Клостридии обладают хорошо выраженной протеолитической и сахаролитической активностью. Сбраживают молочный сахар, усваивают соли молочной кислоты (лактаты) с образованием масляной, уксусной, пропионовой, муравьиной кислот, небольшого количества этилового спирта и большого количества газов СО₂ и Н₂. В результате обильного газообразования они могут вызывать порок позднее вспучивание сыров.

Кроме анаэробных клостридии маслянокислое брожение могут вызывать бактерии рода Pseudomonas, особенно флюоресцирующие палочки.

ЭНТЕРОКОККИ

Энтерококками называют молочнокислые стрептококки кишечного происхождения, т. е. они являются представителями нормальной микрофлоры кишечника человека и животного и выделяются в окружающую среду в довольно значительных количествах (в 1 г фекалий до 10 -10⁹ жизнеспособных особей), но примерно в 10 раз меньше, чем бактерий группы кишечных палочек (БГКП). В настоящее время энтерококки считаются вторым после БГКП санитарно-показательным микроорганизмом при исследовании воды водоемов, особенно проб воды колодцев, плавательных бассейнов, сточных вод, почвы, предметов обихода.

К энтерококкам относят два основных вида кокков семейства Streptococcaceae, рода Enterococcus: Ent. faecalis (биовары Ent. liquefacieus и Ent. zymogenes) и Ent. fecium (биовар Ent. bovis).

В этот род внесены другие виды, ранее относившиеся к роду Streptococcus: E.durans, E.avium, E.gallinarum, E.casseliflavus, E.malodoratus, E.cecorum, E.dispar, E.hirae, E.mundtii, E.pseudoavium, E.raffinosus, E.saccharolyticus, E.seriolicida и E.solitarius. Таким образом, род Enterococcus объединяет 16 видов микроорганизмов.

Биовар E.liquefaciens часто является обитателем молочной железы, поэтому его называют маммококком (от лат. Glandula mamma - железа молочная).

Энтерококки представляют собой диплококки овальной или круглой формы размером 0, 6-2 х 0, 6-2, 5 мкм, иногда располагающиеся цепочками, грамположительны, спор и капсул не образуют, неподвижные. Факультативные анаэробы, хорошо размножаются на простых питательных средах, но при выращивании необходимо пользоваться средами с ингибиторами, подавляющими сопутствующую флору (бактерии группы кишечных палочек, протей и др.). Лучший рост наблюдается при добавлении в среду глюкозы, дрожжевых препаратов и других стимуляторов роста. При культивировании в жидких питательных средах образуется осадок и наблюдается диффузное помутнение. На плотных средах колонии энтерококков мелкие, серовато-голубые, прозрачные, круглые с ровными краями, выпуклые, с блестящей поверхностью. На кровяном агаре в зависимости от биовара они могут давать гемолиз (Ent. liquefaciens), изменение цвета вокруг колоний на зеленовато-бурый, так как гемоглобин превращается в метгемоглобин (Ent. faecalis). Оптимальная температура роста 37 °С, пределы - 10-45 °С.

Для определения энтерококков используется молочная среда с полимиксином по Калине. На 100 см³ 1, 5 % питательного агара (МПА) вносят глюкозы - 1 г, дрожжевого диализата (экстракта, автолизата) - 2 см³. Стерилизуют при -112 °С 20 мин; рН 6, 0. Перед разливом в чашки Петри добавляют на 100 см³ среды: кристаллического фиолетового - 1, 25 см³ 0, 01 % водного раствора; сухого вещества 2, 3, 5-трифенилтетразолий хлорида (ТТХ) -10 мг; стерильного обезжиренного молока - 10 см³; полимиксина -200 ед/мл.

Типичные колонии энтерококков имеют на этой среде округлую форму, ровные края, блестящую поверхность, диаметр 1, 5-2 мм, красноватую окраску с зоной протеолиза на светло-голубом фоне.

Энтерококки являются хемоорганотрофами, метаболизм у них бродильного типа, разлагают глюкозу и маннит до кислоты и газа, но не обладают каталазной активностью (в отличие от других грамположительных кокков). По антигенной структуре они однородны и относятся к группе D по классификации Ленсфильд.

Отличительные признаки энтерококков от мезофильных молочнокислых стрептококков по тестам Шермана приведены в таблице 18.

Таблица 18 ‑ Дифференциация энтерококков от стрептококков

Признак	Энтерококки	Стрептококки
Температурные пределы роста, °С	10-45	10-41
Рост: при рН 9, 6 в бульоне с 40 % желчи в бульоне с 6, 5 % хлорида натрия в молоке с 1 % метиленового синего	+ + + +	- - - -
Терморезистентность при 60°С в течение 30 мин	+	-
Примечание: «+»- наличие признака; «-» - отсутствие признака.

Энтерококки довольно устойчивы к физическим и химическим факторам, что и было положено в основу дифференциации энтерококков от других стрептококков, входящих в нормальную микрофлору человека и вызывающих заболевание верхних дыхательных путей. Помимо устойчивости к температуре (легко переносят нагревание до 60 °С в течение 30 мин) энтерококки резистентны к действию активного хлора, некоторых антибиотиков, красителей и др.

Дифференциацию Ent. faecalis от Ent. faecium проводят по способности ферментировать глицерин: Ent. faecalis расщепляет глицерин в аэробных и анаэробных условиях, в то время как Ent. faecium только в аэробных. Для дифференциации видов энтерококков рекомендовано свыше 30 биохимических тестов: ферментация сорбита, маннита, арабинозы, редукция ТТХ, пептонизация молока и др. Необходимость разделения энтерококков на виды связана с их неодинаковой распространённостью у людей и животных. Однако в повседневной практике всех представителей энтерококков считают санитарно-показательными микроорганизмами.

Будучи термостойкими, они составляют значительную часть остаточной микрофлоры пастеризованного молока и играют определенную роль- при созревании сыра. Ent. durans за рубежом применяют в составе закваски при производстве некоторых сыров. В нашей стране проводят исследования о возможности использования Ent. faecium в составе закваски для кисломолочных продуктов. В остальных случаях энтерококки являются нежелательными микроорганизмами в молоке и молочных продуктах. Особенно технически вредными являются маммококки (Ent. liquefaciens), которые выделяют сычужный фермент, вызывают прогоркание молочных продуктов и преждевременное свертывание молока.

⇐ Предыдущая 11 12 13 14 151617 18 19 20 Следующая ⇒