Виды, использование и регенерация

Виды, использование и регенерация

Питательных сред.

Ф.И.О. студента: ________________________________________________

курс, группа: _________________

Ставрополь, 2008 г.

Методические указания предназначены для самостоятельной подготовки студентов специальности 2715 «Пищевая биотехнология» к лабораторным работам по дисциплине «Виды, использование и регенерация питательных сред». Включают краткое изложение теоретических основ, рекомендации по выполнению и оформлению работ, вопросы для самоконтроля.

Составитель: к.б.н., доц. Емельянов С.А.

Ответственный редактор: доцент Рябцева С.А.

Технология приготовления питательных сред для культивирования микроорганизмов.

В зависимости от вида культивируемого микроорганизма используют соответствующие питательные среды, которые, прежде всего, отличаются между собой по консистенции: плотные, жидкие и полужидкие. По используемому сырью среды также подразделяются на среды животного и растительного происхождения, а также комбинированные.

Питательные среды должны быть стерильными и, как отмечалось выше, создавать оптимальные условия для жизнедеятельности микроорганизма. Наиболее широко в микробиологическом синтезе используются питательные среды на основе мясо-пептонного бульона (МПБ), мясо-пептонного агара (МПА), мясо-пептонно-печеночного агара (МППА). Однако, в связи с высокой стоимостью мяса, достаточно распространены другие виды сырья животного, растительного происхождения, а также отходы микробиологической промышленности.

Перед употреблением, независимо от происхождения, все белковое сырье проходит стадию гидролиза. Рассмотрим процесс приготовления гидролизата на основе перевара Хоттингера. Мясо крупного рогатого скота средней упитанности, полученное от 2-3 летних животных, освобождают от жира, фасций, сухожилий и измельчают на мясорубке. В реакторе подогревают водопроводную воду до температуры 60-65°С. Полученный фарш добавляют в воду в соотношении 1, 0: 1, 5. При постоянно включенной мешалке в реактор добавляют двууглекислый натр, снижают температуру до 45°С и добавляют протеолитический фермент – панкреатин. В качестве этого фермента на практике чаше всего используют поджелудочную железу, которую также в виде фарша добавляют в раствор в количестве 30-40% и оставляют для гидролиза на 5-6 суток. Для обеспечения сохранности раствора в него добавляют консервант – хлороформ 1-2%-ной концентрации. Во время гидролиза температура поддерживается в пределах 42°С. Готовый гидролизат должен иметь следующие показатели:

- активная кислотность (рН) - 6.0-6.5;

- содержание аминного азота, мг% - 600-800;

- содержание пептона, % - 2-3.

При наличии данных показателей питательная среда на основе гидролизата Хоттингера обеспечивает достаточно высокое накопление биомассы бактерий.

В ряде случаев проводят химический гидролиз белков: кислотный (реже щелочной) и, как наиболее щадящий, аммиачный. Не исключается, в зависимости от назначения среды, использование комбинированного способа проведения гидролиза, когда одновременно применяются протеолитические ферменты и химические реагенты.

По такой же схеме ведется гидролиз других видов белоксодержащего сырья. Основное требование к применяемому способу: максимальное накопление свободных аминокислот и недопущение их разрушения.

При изготовлении производственных питательных сред необходимо тщательно соблюдать требования технологических инструкций и прописей, так как это является залогом достижения конечной цели в необходимых объемах и с высоким качеством.

В производстве биопрепаратов в качестве основы используется перевар Хоттингера с различными добавками, соотношение которых варьирует в зависимости от вида культивируемого микроорганизма.

Среда для культивирования листерий:

- перевар Хоттингера;

- бактопептон, % - 1;

- натрий хлористый, % - 0, 3;

- Na₂HPO₄·12 H₂O, % - 0, 5;

- KH₂PO₄, % - 0, 3;

- гидролизат печени, % - 2;

- лимоннокислый натр, мг - 400;

- магний сернокислый, мг - 100;

- железо лимоннокислое, мг - 50.

Готовая среда должна иметь следующие показатели:

- активная кислотность, рН - 7, 4-7, 6;

- содержание аминного азота, мг% - 200-220;

- содержание пептона, % - 1-2;

- содержание триптофана, мг% - 80-100.

Среда для культивирования сальмонелл:

- перевар Хоттингера;

- бактопептон, % - 0, 5;

- хлористый натр, % - 0, 3;

- Nа₂HPO₄, % - 0, 5.

Готовая среда должна иметь следующие показатели:

- активная кислотность, рН - 7, 8-8, 0;

- содержание аминного азота, мг% - 200-220;

- содержание пептона, % - 0, 5;

- хлористого натра, % - 0, 3.

Питательная среда для культивирования пастерелл:

- перевар Хоттингера;

- бактопептон, % - 0, 5;

- желатин, % - 0, 5;

- агар-агар, % - 0, 1;

- KH2PO4, % - 0, 1;

- Na₂HPO₄·12H₂O, % - 0, 3;

- NaCl, % - 0, 3.

Готовая среда должна иметь следующие показатели:

- активная кислотность, рН - 8, 0;

- содержание аминного азота, мг% - 180-200;

- содержание пептона, % - 0, 5.

Среда для культивирования коли-бактерий:

- перевар Хоттингера;

- пептон, % - 0, 5;

- хлористый натр, % - 0, 3;

- Na₂HPO₄·12 H₂O, % - 0, 5.

Готовая среда должна иметь следующие показатели:

- активная кислотность, рН - 8, 0;

- содержание аминного азота, мг% - 200;

- содержание пептона, % -0, 5.

Среда для культивирования бифидо-бактерий (КД-5):

- дрожжевой автолизат;

- гидролизат казеина триптический, мл/л - 350;

- натр хлористый, % - 0, 5;

- L-цистин, % - 0, 01;

- агар микробиологический, % - 0, 07-0, 2.

Готовая среда должна иметь следующие показатели:

- активная кислотность, рН - 8, 5.

Лабораторная работа №1

Тема: Приготовление жидкой питательной среды для микробов.

Мясная вода, мясо-пептонный бульон, перевар по Хоттингеру.

Белковой основой всех сред является питательный бульон. В зависимости от состава среды остальные ингредиенты добавляются к питательному бульону.

Существуют два способа приготовления основного питательного бульона:

1. на мясной воде с добавлением готового пептона, который представляет собой смесь разнообразных частиц распада белка, не свернувшихся при нагревании (частицы альбумозы, пептоны, пептиды и незначительное количество аминокислот). Это так называемый мясо-пептонный бульон

2. на переварах, продуктах гидролиза исходного сырья при помощи ферментов (трипсина - бульон Хоттингера, пепсина - бульон Мартена) или кислот; среды этой группы богаче аминокислотами.

От азотистого состава мясо-пептонных сред и от степени расщепления белка в мясных и прочих гидролизатах зависит содержание в среде общего и аминного азота. Отношение количества аминного азота к количеству общего выражает степень расщепления общего азота. Обычно эта величина выражается в процентах. При изготовлении питательных сред необходимо определять количество общего и аминного азота как основных показателей качества.

Для хорошего роста большинства микробов необходимо содержание в 100 мл бульона не менее 250—300 мг общего азота при наличии в этом количестве аминоазота (аминокислот) в среднем в пределах 25—30%. Принимая во внимание, что для приготовления питательного бульона полуфабрикаты разводят в несколько раз, необходимо доводить гидролиз основного сырья (мяса, казеина и прочих субстратов) до максимального накопления общего азота.

Лабораторная работа № 2

Тема: Плотные питательные среды и сухие питательные среды.

Консерванты и среды обогащения.

Плотные питательные среды

Питательные свойства плотной среды зависят исключительно от состава питательного бульона, из которого она изготовлена путем добавления агар-агара или желатины. Последние служат как желирующие вещества для создания плотности среды.

К мясо-пептонному бульону (МПБ) или бульону Хоттингера (рН 8, 2—8, 4) добавляют 2—2, 5% отечественного или 2% импортного мелко нарезанного агар-агара. К дрожжевому аутолизату необходимо добавить и 0, 5% поваренной соли. Концентрация агара в большой степени зависит от качества агар-агара.. Поэтому при употреблении новой партии агара необходимо проверить его желирующую способность. Если агар влажный, его следует до употребления подсушить.

Кастрюлю с бульоном и агаром ставят на огонь и кипятят до полного растворения агара. Во время кипячения необходимо все время помешивать во избежание пригорания. По окончании кипячения следует восстановить объем среды добавлением горячей дистиллированной воды. Проверяют и, если нужно, исправляют реакцию. При определении реакции в агаре или желатине температура этих сред должна быть не ниже 80°, так же как и температура воды, прибавляемой в пробирки компаратора. В противном случае агар или желатина очень быстро становятся плотными, что затрудняет определение. После установления реакции агар кипятят. Дают ему отстояться в теплом месте, после чего фильтруют в горячем состоянии через ватно-марлевый фильтр. Осадок на фильтр не выливают. Разливают в посуду, стерилизуют под давлением 1 атм. в течение 30 минут.

При приготовлении больших количеств агара (более 10 л) можно пользоваться другим способом его варки: кастрюлю с агар-агаром на любой питательной основе помещают в автоклав под текучий пар (100°) на 1 час. Текучим паром можно варить агар также в текучепаровом аппарате. Затем оставляют для медленного и равномерного отстаивания в теплом месте (можно оставить в автоклаве с потушенной горелкой) на 1 час, после чего проверяют реакцию, исправляют ее и фильтруют.

Можно после отстаивания дать агару застыть и на другой день срезать и удалить нижнюю его часть с осадком. Прозрачный слой измельчают ножом и расплавляют текучим паром при 100° (1- 1, 1\2 часа), после чего устанавливают реакцию и фильтруют. Если после расплавления срезанного агара в нем будет заметна муть, дают ему вновь отстояться в теплом месте, после чего осторожно сливают с осадка. Надо избегать подщелачивания готового агара, так как не исключена возможность выпадения осадка после подщелачивания при последующей стерилизации.

Прозрачный и светлый агар получают также путем просветления его яичным белком или кровяной сывороткой. На каждые 1—2 л агара, остуженного до 50 ^º, прибавляют белок одного куриного яйца или 25—50 мл кровяной сыворотки. Яичный белок нужно предварительно хорошо размешать с двойным объемом холодной воды. Употребляют только свежие яйца, в противном случае агар может сделаться еще более мутным. После прибавления белка или сыворотки агар тщательно размешивают и кипятят 10—15 минут па огне. Добавленный белок свертывается и адсорбирует взвешенные частицы. Крупнохлопчатый осадок легко отделяется фильтрованием. Фильтрованный агар разливают в посуду, стерилизуют в автоклаве под давлением 1 атм. в течение 30 минут. После стерилизации питательный агар, разлитый в пробирки, оставляют застыть столбиком, если он приготовлен не для немедленного использования, или скашивают (косой агар) для непосредственного употребления. Для скашивания пробирки с горячим агаром укладывают на покатой поверхности или под верхнюю часть пробирок подкладывают резиновую или стеклянную трубку. После остывания на агаровой среде собирается конденсационная жидкость, которая сохраняется некоторое время, если среду хранить в прохладном месте.

Рост микробов на влажном агаре лучше, чем на сухом. Последний следует расплавить и дать ему снова застыть, тогда выделится снова конденсационная вода. Однако многократное кипячение агара и особенно стерилизация снижают его плотность.

Для разливки в чашки Петри пользуются агаром из флаконов или пробирок. Непосредственно перед разливкой агар следует растопить на водяной бане или текучепаровом аппарате, а затем остудить до 50-55°. Чашки Петри должны быть стерильны. Срок годности чашек со средой до 48 часов. Хранить их следует на холоде.

Ход работы:

Наливают в пробирку мясо-пептонный бульон (1/2 пробирки), затем добавляют в нее 2% сухой агар-агар (предварительно замоченный в воде или бульоне до 2/3 объема пробирки). Смесь кипятят на водяной бане до полного растворения при помешивании, охлаждают пробирку в воде. Пробирки подписывают. Ставят в штатив в холодильник.

Сухие питательные среды

В последние годы в бактериологии широко пользуются сухими питательными средами. Это избавляет лаборатории от громоздкого процесса приготовления обычных сред, позволяет получать сравнимые результаты в разных лабораториях и, наконец, приближает к разрешению вопроса о стандартности питательных сред. Значение сухих сред возрастает в экспедиционных и полевых условиях.

Сухие питательные среды следует хранить герметически закрытыми и по возможности не на свету, так как препараты гигроскопичны и светочувствительны. Увлажнение, комкование и изменение цвета порошка свидетельствуют о понижении качества препарата. Сухие препараты, не содержащие глюкозы, даже при комковании могут не терять своих качеств, однако их пригодность следует проверить. При наличии же в сухой среде глюкозы комкование и изменение цвета порошка свидетельствуют о порче.

Технология приготовления питательных сред из сухих препаратов проста. Навеску, указанную па этикетке, всыпают в стеклянную колбу или бутыль с холодной дистиллированном водой. Смесь следует хорошо размешать до полного смачивания порошка водой. Затем в водяной бане или лучше в текучепаровом аппарате смесь нагревают до кипения, периодически помешивая. Кипятят до тех пор, пока порошок окончательно не растворится. Растворение на голом огне возможно, но требует большого внимания, чтобы не допустить пригорания среды. Перед разливкой следует среду хорошо перемешать. Сухие среды выпускаются основные, элективные и дифференциальные.

Сухой питательный агар (рН 7, 3—7, 6). К растворенному сухому агару (5—7, 5 г сухого агара на 100 мл) рекомендуется добавлять в качестве факторов роста небольшое количество дрожжевого аутолизата, мясной воды пли неразведенного триптического перевара мяса (около 1/3 растворяющей жидкости). Для выявления валообразования паратифозной В палочки, а также расщепления бактерий Зонне на круглые плоские варианты сухой агар растворяют дистиллированной водой, содержащей триптический перевар, в отношении 2: 1. Если после растворения агар недостаточно прозрачен, его фильтруют через ватно-марлевый фильтр. Разливают по пробиркам или флаконам. Стерилизуют под давлением 1 атм. в течение 20 минут.

Сухой питательный агар Д имеет в своем составе дрожжевой экстракт в качестве фактора роста. Прибавления дополнительных факторов роста не требуется. Способ приготовления не отличается от описанного для предыдущей среды.

Лабораторная работа № 3

ВОПРОСЫ

к зачету (в форме письменного опроса);

СПИСОК РЕКОМЕНДУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

Основная литература

Баснакьян И.А. Культивирование микроорганизмов с заданными свойствами.. М.: Медицина. –1992. –192 с.

Сидоров М.С., Корнелаева Р.П. Микробиология мяса и мясопродуктов. М.: Колос. –1996. –240 с.

Тутов И.К., Ситьков В.И. Основы биотехнологии ветеринарных биопрепаратов. Ставрополь: 1997. –253 с.

Дополнительная литература

Безбородов А.М. Биосинтез биологически активных веществ микроорганизмами. М.: Медицина. –1969. –246 с.

Биргер М.О. Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам исследования. М.: Медицина. – 1973. – 456 с.

Бурьян Н.И., Тюрина Л.В. Микробиология виноделия. М.: Пищевая промышленность. –1979. –272 с.

Воробьева Л.И. Промышленная микробиология. М.: Изд-во МГУ. -1989. –294 с.

Залашко М.В., Залашко Л.С. Микробный синтез на молочной сыворотке. Минск: Наука и техника. –1976. –274 с.

Иванов В.Н. Энергетика роста микроорганизмов. Киев: Наукова думка. –1981. –140 с.

Коротяев А.И. Механизмы саморегуляции бактериальной клетки. М.: Медицина. –1973. –272 с.

Козлов Ю.А. Питательные среды в медицинской биологии. М.: МЕДГИЗ – 1950 – 252 с.

Месробяну Л., Пуэнеску Э. Физиология бактерий. Бухарест: Меридиане. –1963. –807 с.

Мосичев М.С., Складнев А.А., Котов Б.В. Общая технология микробиологических производств. М.: Легкая и пищевая промышленность. –1982. – 264 с.

Основы общей биологии. Пер. с нем. Колесниковой Г.С. и Фролова Ю.М. Под общей ред. Либберта Э. М.: Мир. –1982. –440 с.

Перт С.Дж. Основы культивирования микроорганизмов и клеток. М.: Мир. –1978. –331 с.

Пехов А.П. Генетика бактерий. Изд. 2. М.: Медицина. –1977. –408 с.

Практикум по физико-химическим методам в биологии. М.: Изд-во МГУ. –1981. –240 с.

Руководство по вакцинному и сывороточному делу. Под ред. Бургасова П.Н. М.: Медицина. –1978. –440 с.

Уэбб Ф. Биохимическая технология и микробиологический синтез. Пер. с англ. Швалева П.Е. М.: Медицина. –1969. –560 с.

Виды, использование и регенерация

Питательных сред.

Ф.И.О. студента: ________________________________________________

курс, группа: _________________

Ставрополь, 2008 г.

Составитель: к.б.н., доц. Емельянов С.А.

Ответственный редактор: доцент Рябцева С.А.

12 3 4 5 6 Следующая ⇒