Влияние условий культивирования на питание и метаболизм микроорганизмов.

⇐ ПредыдущаяСтр 2 из 6Следующая ⇒

Пищей принято называть любое вещество, которое, попав в живой организм, служит эффективным источником энергии или пластическим материалом для роста организма. Микроорганизмы лишены специализированных органов пищеварения, дыхания и выделения. Все эти функции выполняют ферменты, благодаря которым питательные вещества поступают в клетку, подвергаются внутриклеточным превращениям в энергоемкие и структурные соединения. Эти процессы являются сопряженными и взаимосвязанными, отражают разные стороны обмена веществ, поэтому весь процесс утилизации микробами питательных веществ именуется метаболизмом от английского metabolism - обмен веществ. Следует отметить, что в настоящее время большинство авторов под данным термином подразумевают жизнедеятельность организма как таковую, в том числе динамику и кинетику обменных процессов

Процесс переваривания пищи у животных начинается в ротовой полости под действием гидролитической ферментной системы и по мере продвижения по пищеварительному тракту сложные пищевые системы расщепляются на более простые растворимые соединения, такие как аминокислоты, жирные кислоты и моносахара, в основном - глюкоза. В отличие от исходной пищи, имеющей преимущественно плотную структуру, эти низкомолекулярные соединения с незначительными геометрическими размерами могут проникать через клеточную оболочку или мембрану вакуоли в протоплазму клетки. При этом по мере перемещения пищи по желудочно-кишечному тракту, ферментные системы организма сменяют друг друга по мере расщепления или ферментолиза исходного пищевого комплекса.

У микроорганизмов процесс ферментолиза имеет свои характерные отличия. Микробная клетка в связи с отсутствием специфических органов пищеварения способна в зависимости от условий ее нахождения выделять в окружающую среду ферменты, необходимые для расщепления доступных питательных веществ до удобоваримого состояния. То есть, предварительный процесс пищеварения начинается за пределами клетки.

Если контакт пищеварительных ферментов с субстратом произошел, начинается процесс переваривания пищи с образованием мелких молекул простых растворимых веществ. В дальнейшем процесс усвоения низкомолекулярных соединений клеткой аналогичен описанному выше, что подтверждает положение о единстве биологических процессов в живой природе.

Микробная клетка окружена оболочкой или мембраной, представляющей собой высокоорганизованную структуру, обеспечивающую поступление внутрь питательных веществ и выводящую наружу ненужные продукты обмена, гидролитические ферменты и другие вещества, образованные клеткой в процессе ее жизнедеятельности. Для осуществления столь многообразных функций клеточная оболочка должна обладать тонко дифференцированной избирательной проницаемостью или селективностью для низко- и высокомолекулярных соединений, необходимых клетке. Растворенные или диспергированные в водной фазе частицы вещества находятся в непрерывном хаотическом движении, которое при отсутствии электрического или центробежного полей известно как броуновское. Движущей силой, определяющей или регламентирующей поступление частиц к клетке является концентрационная поляризация, определяемая рядом факторов, наиболее значимыми из которых являются величина заряда на ее поверхности, концентрация и степень ионизации вещества. При этом фактору концентрации согласно теории броуновского движения, еще в 1905 году описанной Энштейном, отводится практически утилитарная роль: чем выше концентрация, тем выше вероятность контакта частицы и бактерии. С временной точки зрения следует отметить и подвижность частиц, которая находится в линейной зависимости от величины их молекулярного веса. Однако, в большей степени вероятности это утверждение справедливо для неорганических компонентов системы. Протеиновые, липидные и липопротеиновые составляющие, имеющие, кроме того, достаточно разветвленную пространственную структуру, обладают подвижностью на несколько порядков ниже, чем простые низкомолекулярные соединения.

Согласно логике приведенных рассуждений следует, что в первую очередь подвержены диффузии через мембранную оболочку микробной клетки низкомолекулярные фрагменты окружающей среды. Однако в действительности, диффузионные процессы на границе раздела содержимого клетки и среды имеют логарифмическую зависимость и не являются функцией молекулярного веса и геометрических размеров.

Столь же важной функцией мембраны являются ее чисто механические свойства - она подобно футляру удерживает в замкнутом объеме содержимое клетки и поддерживает в заданных пределах величину осмотического давления. О механической прочности оболочки свидетельствует тот факт, что она способна поддерживать жизнеспособную клетку в состоянии тургора. В этом случае величина избыточного давления по отношению к окружающей среде составляет 3 атм. и более. Отдельные представители выдерживают давление до 25 атм.

На метаболизм микроорганизмов и их фенотипические признаки оказывает влияние целый ряд физических и биологических факторов: наличие воды, температура, активная кислотность, окислительно-восстановительный потенциал, осмотическое давление, содержание энергетических, ростовых, структурообразующих веществ, их соотношение и ряд других, не менее важных по значимости соединений.

В этой связи при конструировании искусственной питательной среды необходимо учитывать физиологические особенности культивируемых штаммов микроорганизмов и конечную цель процесса. Не менее важную роль при этом играют химический состав, биологические свойства и качественные показатели основного сырья и ингредиентов. При использовании гидролизатов необходимо неукоснительно соблюдать технологию их приготовления с тем, чтобы свести до минимума расхождения глубины и степени гидролиза, так как стабильно высокое накопление бакмассы возможно получать лишь при наличии стандартной по компонентному составу и ростовым свойствам питательной основы.

Вода. Как отмечалось выше, подавляющее большинство бактерий потребляют пищу в растворенном виде. Вода, как универсальный растворитель, служит основой для всех биологических процессов. Кроме того, все живые организмы, включая микроорганизмы на 85-90% состоят из воды, которая находится в свободном и связанном состоянии. В гидролитических реакциях при участии воды происходят реакции расщепления липидов, белков и их производных, углеводов, протекают реакции гидратации и дегидратации, окислительно-восстановительные процессы. Микробная клетка окружена коллоидной гидратированной оболочкой, которая за счет сил электростатического взаимодействия поляризует молекулы воды и растворенных в ней компонентов питательной среды. Последние в свою очередь диссоциируются и за счет сил электролитического взаимодействия притягиваются к разнородно заряженным активным участкам клетки, после чего вступают в действие трансферазы и фосфолипиды, ответственные за доставку питательных компонентов в клетку.

При снижении содержания свободной влаги биологические процессы у вегетативных форм многих видов микроорганизмов замедляются, а при высушивании практически полностью прекращаются, так как они в значительной степени определяются осмосом, диффузией, ионизацией и размерами коллоидных частиц, что в свою очередь зависит от степени гидратации. В данном аспекте целесообразно упомянуть термин «активность воды», которая напрямую связана с наличием в системе свободной влаги. Причем, большинство авторов отмечают, что чем выше влажность окружающей среды, тем активнее динамика всех биологических обменных процессов. По этой причине биотехнология выращивания чистых культур в производстве бактериальных препаратов при наличии прочих условий осуществляется преимущественно в жидких питательных средах.

При высушивании показатель активности воды снижается, что вызывает полную остановку вегетативных процессов в бактериальной клетке. Так, сухие пищевые продукты, даже при высокой бактериальной обсемененности, способны сохранять свой качественные показатели в течение длительного времени. При увлажнении продукта большинство микроорганизмов способно прорасти и вызвать биологическую порчу. Свойство микробов сохранять жизнеспособность при высушивании, использовано в технологии биопрепаратов, где чистые культуры микроорганизмов в виде сырой бакмассы расфасовываются во флаконы из нейтрального стекла, высушиваются лиофильным способом в условиях высокого вакуума и герметически упаковываются. Имеются данные, что высушенные подобным образом патогенные стрептококки сохранялись в течение 25 лет. При заполнении флаконов с высушенной культурой инертными газами, в частности азотом, гарантированный срок хранения препарата существенно увеличивается

Температура. Микроорганизмы способны сохраняться в достаточно широком диапазоне температур: ото льдов Антарктиды до кратеров вулканов. Основная роль в их терморезистентности отводится липидам, хотя с биологической точки зрения способность развиваться при высоких температурах является биохимической аномалией, так как температурный максимум для нативных белков, являющихся основой всего живого, не превышает 50-60°С, хотя при увеличении экспозиции температурный градиент термостойкости смещается в область более низких значений. Для подавляющего большинства патогенных микробов температурный оптимум развития соответствует температуре тела своего носителя, для человека и теплокровных животных - 36-37°С. При этой же температуре ведется культивирование микроорганизмов, используемых в производстве вакцин. Имеются сведения, что отклонения в меньшую или более высокую от оптимальной температуры область значений может вызвать накопление в культуральной жидкости неспецифических белков, способных вызывать аллергические реакции при вакцинировании животных и людей. Кроме того, снижение температуры существенно удлиняет продолжительность культивирования и вызывает лизис клеток, образовавшихся на начальных стадиях процесса. В производстве так называемых «живых» вакцин и биопрепаратов этот фактор является обесценивающим по отношению к конечному продукту.

В ряде случаев, в зависимости от конечной цели, температуру культивирования меняют в пользу оптимизации температуры ферментных эндо - и экзосистем, способствующих синтезу целевого продукта: антибиотиков, ферментов и других сложных органических соединений.

В пищевой биотехнологии, в частности при производстве молочных продуктов, используется сочетание мезофильной и термофильной молочнокислой микрофлоры. В соответствии с технологическим регламентом производства конкретного продукта и видом используемых штаммов температуру в ходе процесса меняют для последовательной активизации жизнедеятельности всей комбинации входящих в состав сложной заквасочной культуры молочнокислых микроорганизмов. При производстве сычужных сыров температуру свертывания устанавливают в пределах 30-32°С, во время обработки сырного зерна проводят второе нагревание при 37°С, а в ряде случаев при 42°С, что благоприятно сказывается на кислотообразующей и ферментативной активности микрофлоры.

Низкая (плюсовая) и отрицательная температуры менее пагубно сказываются на жизнеспособности микробных клеток, в связи с чем рекомендовано коллекционные штаммы микроорганизмов хранить в консервирующих средах в холодильниках.

При высоких температурах, превышающих оптимальные, жизненные функции бактериальных клеток резко замедляются и ослабляются в связи со снижением ферментативной активности и нарушением осмотических процессов. При дальнейшем повышении температуры происходят необратимые изменения, обусловленные денатурацией белков цитоплазмы, инактивацией ферментов, в результате чего микроорганизмы теряют жизнеспособность. Термоустойчивость микроорганизмов в значительной степени зависит от особенностей среды, в которых они находятся в момент нагревания. Во влажной среде микроорганизмы отмирают быстрее, чем в сухом нагретом воздухе, так как скорость денатурации белков прямо пропорциональна содержанию влаги в среде. Аналогичным образом термостойкость белков зависит от кислотности.

Губительное действие высоких температур используется для уничтожения микроорганизмов. При этом эффективность процесса является функцией температуры и времени. Существует два основных вида тепловой обработки: пастеризация и стерилизация, широко применяемые в биотехнологии пищевых продуктов, биопрепаратов, ветеринарии, медицине и так далее.

Пастеризация – это нагревание продукта от 63°С до 90°С. Продолжительность экспозиции в зависимости от вида продукта, объема, используемой тары и температуры от нескольких секунд до 30 минут. При этом погибают не все микроорганизмы: споры большинства бацилл и клостридий, некоторые термостойкие бактерии сохраняют жизнеспособность.

Стерилизация – это нагревание продукта от 100°С до 120°С с выдержкой 20-40 минут и проводится для обеспложивания объекта. Применяется при производстве мясных, молочных и растительных консервов, а также для стерилизации посуды, инструмента, питательных сред в микробиологической промышленности, ветеринарии и медицине. При этом процесс ведется в автоклавах под избыточным давлением. В ряде случаев стерилизация проводится в сухожаровых шкафах при температурах от 180°С и выше.

Активная кислотность (рН) и окислительно-восстановительный потенциал (Еh). Активная кислотность - это обратные значения отрицательного логарифма концентрации ионов водорода в г/л и определяется степенью диссоциации находящихся в растворе кислот и их содержанием. Значения окислительно-восстановительного потенциала и рН обычно используют для характеристики окислительных и иных свойств среды, клетки, ее компонентов и отдельных химических веществ. Показатель Еh служит мерой способности биологической системы отдавать или принимать электроны. Этот потенциал отсчитывается относительно потенциала молекулярного водорода. Водородный электрод (платиновая пластинка, погруженная в раствор кислоты и обтекаемая током водорода) при рН=0 и атмосферном давлении имеет потенциал, равный нулю. При рН=7, 0 водородный электрод имеет потенциал (Е_о) =-420 мВ.

С повышением температуры раствора подвижность ионов усиливается, что в свою очередь увеличивает диссоциацию и, соответственно, приводит к сдвигу активной кислотности в область более низких значений. Большинство бактерий наиболее активно развиваются в средах с нейтральными или весьма близкими к нейтральным значениями рН. Некоторые микроорганизмы «предпочитают» нейтральную реакцию среды, но при этом хорошо переносят область кислых значений (рН - 4, 0 и ниже).

По всей видимости, область нейтральных значений активной кислотности является оптимальной не столько для микроорганизмов, сколько для продуцируемых ими эндо- и экзоферментов. Эти сложные соединения играют важную роль в биосинтезе. По этой причине их называют биокатализаторами. В настоящее время выделен и изучен широкий спектр ферментов. Важной их особенностью является наличие в составе каждого фермента какого-либо витамина, роль которых в биологическом синтезе общеизвестна. Являясь, по сути, белковыми комплексами, ферменты весьма чувствительны к изменениям рН и при отклонении от оптимума в кислую или щелочную сторону теряют свою активность. В простых растворах оптимум активной кислотности ферментов несколько шире. Тем не менее, он напрямую зависит от солевого состава и концентрации раствора, температуры, количества субстрата и так далее. В сложных растворах, к которым относятся и питательные среды, границы действия ферментов по показателю рН значительно сужаются. При отклонении от оптимума ферменты теряют свою активность и, как следствие, способность участвовать в метаболических процессах клетки. В этой связи во время культивирования бактерий необходимо рН культуральной жидкости поддерживать на строго определенном, оптимальном для жизнедеятельности, уровне, безусловно, если это не противоречит интересам синтеза целевого продукта.

Для направленного регулирования технологических параметров микробиологического синтеза, в том числе и рН, многие авторы используют термин «управляемое культивирование». Как отмечалось, оптимум значений активной кислотности для большинства видов микробов находится в строго заданной области. В производстве чистых культур это особенно актуально, так как доказано, что, например, при культивировании Pasteurella multocida прослеживается строгая корреляция между значениями оптической плотности культуральной жидкости и рН. Полученные данные позволили авторам создать математическую модель и вывести критериальные уравнения зависимости количественного прироста числа жизнеспособных клеток от величины значений активной кислотности.

Наиболее доступным и широко применяемым способом стабилизации рН является добавление разбавленных до 0, 1 н растворов кислот или щелочей. При этом отмечено, что при попытке изменения активной кислотности в ту или иную сторону происходит запаздывание изменения абсолютного показателя рН от дозы добавленного реагента. В особенности это характерно для питательных сред приготовленных на основе мясного бульона. Иными словами, титрование показывает, что даже в области значений рН близких к нейтральным, бульон имеет тенденцию к противодействию изменения реакции среды. Данное явление обусловлено буферными свойствами некоторых компонентов бульона, в особенности белковыми составляющими: аминокислотами, полипептидами и протеазами. Эти соединения, не являясь ни сильными кислотами, ни сильными щелочами, тем не менее, способны соединяться как с кислотами, так и со щелочами. Эту особенность белков и продуктов их ферментолиза сдерживать снижение рН при культивировании микроорганизмов в практическом применении рекомендовано усиливать добавлением буферных солей. Чаще всего для этих целей используются водные растворы смесей одно- и двузамещенных фосфатов калия (КН₂РО₄ или К₂НРО₄). В водных растворах фосфаты диссоциируют относительно слабо, то есть не дают ни резко кислой, ни резко щелочной реакции. При связывании кислоты в культуральной жидкости двуосновная соль присоединяет атомарный водород с образованием одноосновной соли. В случае необходимости связывания щелочи водород одноосновной соли связывается с ОН^- - группой с образованием воды, а оставшаяся часть фосфата соединяется с катионом щелочи. Определенными буферными свойствами также обладают карбонаты и бикарбонаты, что послужило причиной их широкого использования в составе сложных питательных сред.

Корректировку рН в ряде случаев рекомендуется производить путем постоянного дозирования раствора глюкозы, роль которой помимо всего - обеспечение энергетических потребностей микроорганизмов при культивировании.

Изменение значения рН, как правило, приводит к сдвигу окислительно-восстановительного потенциала в ту или иную сторону. Установлено, что изменение внутриклеточной величины рН вызывает изменение Еh и в среде. Причем, во время лаг-фазы развития аэробной микробной культуры Еh снижается до определенных значений, затем наступает перелом и, начиная с нижней экстремальной точки, начинается фаза экспоненциального роста. Преждевременное повышение значений Еh является свидетельством неблагоприятного развития процесса под воздействием какого-либо внешнего фактора. При чрезмерно высоких значениях Еh среды часть полезной энергии нерационально тратится на снижение этого показателя, что в свою очередь снижает энергию роста аэробной культуры.

Таким образом, отклонения рН и Еh от оптимальных (но не летальных) значений приводит к тому, что популяция микроорганизмов начинает не столько развиваться, сколько бороться за выживание в условиях неспецифического стресса при резко возрастающих энергетических затратах на поддержание клеточной структуры. При этом отмечается, что изменяется не только химический состав бактериальной клетки, но и ее морфология. Смещение показателей активной кислотности и окислительно-восстановительного потенциала вызывает адекватную защитную реакцию клетки, обусловленную ее природой, с довольно высокой скоростью. Дрожжи семейства C. utilis при снижении рН от 4, 5 до 2, 5 в течение трех минут в 17 раз повышали содержание так называемого стрессового АТФ. Нормализация активной кислотности приводила к реверсу содержания АТФ, но уже в течение 5-7 минут. Аналогичным образом срабатывают защитные механизмы и у ряда других культур, причем не только при изменении рН и Еh, но и других параметров среды. На практике путем изменения электрофизических и других параметров и включения различные биологических механизмов провоцируют синтез конкретных целевых продуктов.

Минеральные вещества и осмотическое давление. Растворы, используемые в микробиологическом синтезе в зависимости от концентрации растворенных солей условно подразделяются на гипотонические и гипертонические. В наиболее общем случае перемещение веществ через мембрану из одной части системы в другую вызывается двумя основными причинами: повышением гидростатического давления в одной из частей системы и увеличением в другой ее части концентрации растворенного вещества, для которого мембрана менее проницаема, чем для воды. Второй случай известен как осмос, при котором мембрана проницаема как для вещества, так и для растворителя. Подобное взаимодействие между стационарными потоками вполне удовлетворительно вписывается в законы термодинамики, которые предполагают, что каждый из обобщенных потоков пропорционален всем обобщенным силам, действующим в системе. То есть, чем выше разность концентраций ингредиентов по обе стороны мембраны, тем интенсивнее динамика обменных процессов. Так, в микробной клетке, помещенной в дистиллированную воду, происходят интенсивные обменные диффузионные процессы на границе раздела клетка/среда солей в окружающую среду и воды внутрь микроорганизма. Этот процесс, согласно закону равновесия движущих сил в системе, будет происходить до момента достижения одинаковой концентрации всех компонентов. Вполне естественно, что в таких условиях клетка вскоре погибнет за счет механического разрушения оболочки из-за избыточного давления. При равенстве концентраций солей система клетка/среда находится в стационарном состоянии, что обусловлено постоянством свойств мембраны и концентрации ионов вблизи ее поверхности. В случае увеличения концентрации солей и, следовательно, повышения осмотического давления водной фазы, свободная влага диффундирует в окружающую среду, клетка обезвоживается и также погибает в результате так называемого «осмотического шока» Это явление зачастую используется в биотехнологии для выделения из клетки ферментов, специфических, так называемых стрессовых, белков или липидов. Оптимальными являются так называемые физиологические растворы, в которых концентрация растворенных солей строго дозирована. Наиболее простым и доступным для применения является водный раствор NaCl, который в стерильном виде используется для растворения сухих вакцин перед их применением по назначению. При конструировании синтетических питательных сред чаще всего используются сложные комплексы солей, в том числе микроэлементы, которые помимо буферных свойств являются важной составной частью жизненно необходимых ферментов, участвуют в синтезе РНК и ДНК, выполняют структурообразующие функции при формировании новых клеток. Так, наиболее широко применяются, кроме указанных выше буферных солей, NaCl, CaCL_2,FeSO₄, Na₂MoO₄, MgSO₄, (NH₄)₂SO₄. Вполне естественно, что перечисленные соли служат важным фактором регулирования и поддержания в заданных пределах осмотического давления среды. Из микроэлементов чаще всего используются Fe, Mn, Zn, Co и другие.

Следует отметить, что микроорганизмы весьма требовательны к качеству ингредиентов, используемых для приготовления питательных сред. Так, с целью исключения влияния случайных факторов в виде минеральных солей, содержащихся в питьевой воде, используемой для приготовления питательных сред, необходимо проведение ее деминерализации или деионизации. Причем, максимальный эффект достигается при 2-3-кратной дистилляции. Для снижения энергозатрат на практике одну дистилляцию заменяют пропусканием воды через ионообменную колонку. Степень очистки воды от солей определяется путем измерения ее электропроводности. Считается, что вода, имеющая сопротивление порядка 1, 5-2, 0 мОм пригодна для использования в качестве основы питательной среды. Остаточная электропроводность объясняется растворением атмосферной углекислоты. Аналогичные требования предъявляются к таре, используемой для хранения воды. Кроме того, даже в случае использования специальной, химически инертной, тары, срок хранения деминерализованной воды в ней должен быть ограниченным несколькими часами. Химические реактивы также должны иметь наивысшую степень чистоты, так как в ряде случаев даже незначительное количество не идентифицированных примесей может быть токсичным для клетки и вызывать замедление ее роста.

Анализ доступной научной литературы и нормативно-технической документации по вопросам конструирования и приготовления питательных сред для культивирования различных групп микроорганизмов показывает, что большинство авторов предусматривает весьма регламентированную дозировку минеральной составляющей без учета вариабельности используемого, в частности - белкового, сырья. Последнее, как известно, зачастую содержит довольно богатый и разнообразный набор минеральных веществ, количественно изменяющихся в зависимости от вида, пола и породы животного, его возраста, условий и рациона кормления, физического состояния перед убоем, сезонности и целого ряда факторов. Аналогичным образом изменяются физико-химические показатели и, соответственно, биологические свойства молочно-белковых, рыбных, растительных и других компонентов, используемых для приготовления сред.

Практикуемые до настоящего времени подходы к процессу конструирования питательных сред на наш взгляд является поверхностным, а в ряде случаев ошибочным, так как не учитывает физико-химических и биологических свойств используемого сырья и реальных потребностей микробов. По всей видимости, добавление минеральных веществ и буферных солей должно быть строго дозированным и осуществляться в конце процесса приготовления сред после проведения анализов по определению, как минимум величины осмотического давления, хотя этого, безусловно, явно недостаточно.

Энергетические и ростовые вещества питательной среды, какотмечалось выше, создают предпосылки и условия для метаболических процессов при культивировании микроорганизмов. Установлено, что из энергетических веществ наиболее предпочтительной является легкоусвояемая глюкоза, которая, являясь моносахаром, легче атакуется ферментами и не требует существенных затрат для утилизации. Под воздействием ферментов гексокиназы и глюкокиназы глюкоза, преимущественно ее D-форма, превращается множество соединений, наиболее важным из которых является глюкозо-6-фосфат, а углекислый газ выводится из клетки за ее пределы. При этом используется большая энергия фосфатной связи адезинтрифосфата (АТФ).

Углеводы с более сложной структурой, в частности лактоза, проходят стадию предварительной ферментации и расщепляются на простые сахара глюкозу и галактопиранозу. То есть, во втором случае, процесс идет в два этапа: расщепление гликозидной связи под воздействием фермента лактазы и непосредственно атака моносахаров микробными экзоферментами. По способности ферментировать углеводы штаммы микроорганизмов, используемые в вакцинном производстве, существенно уступают культурам, применяемым в других областях биотехнологического производства. Так, например пастереллы и сальмонеллы активно потребляют арабинозу, глюкозу, галактозу, мальтозу, маннит. Сложные (многоатомные) сахара ввиду отсутствия у данных культур специфических ферментов им не доступны. Способность бактерий потреблять углеводы позволяет осуществлять их видовую идентификацию. Так, например для бифидобактерий предпочтительным углеводом является именно лактоза, являющаяся для данных микробов специфическим сахаром.

В зависимости от вида культивируемого микроорганизма меняется дозировка, так называемая подкормка, углеводов. Для большинства культур максимальной одновременной дозой является 8-10%. Повышение дозировки в ряде случаев позволяет ускорить деление клеток и увеличить накопление бакмассы, но это чревато изменением морфологии получаемых культур за счет того, что клетка не успевает сформироваться как полноценный биологический организм. Кроме того, одномоментная передозировка углеводов, может вызвать лимитирование других питательных веществ и снижение скорости накопления бакмассы. По всей видимости, этот вывод можно распространить на большинство производственных культур микроорганизмов. В промышленных условиях, во избежание повышения осмотического давления и возникновения фактора лимитирования, подкормку ведут малыми дозами с интервалом 3-4 часа. Второй причиной дробного дозирования углеводов является их способность при высоких температурах вызывать реакцию меланоидинообразования (карамелизации), то есть вступать во взаимодействие с протеиновыми компонентами среды с образованием сложных белково-углеводных пигментных комплексов темного цвета. Помимо снижения качества питательной среды за счет изменения окраски и потери прозрачности, затрудняется определение концентрации бакмассы по стандартам мутности. Для отдельных групп микроорганизмов эти комплексы являются факторами, угнетающими их рост.

Заслуживает внимание работа, в которой авторы с целью снижения негативного влияния образовавшихся пигментных веществ рекомендуют обрабатывать питательную среду активированным углем, который, являясь поверхностно-активным веществом, адсорбирует на своей поверхности большую часть балластных соединений, снижает концентрацию редуцирующих веществ и железа, в результате чего ростовые и культуральные свойства среды существенно повысились. Рекомендуемая доза угля – 2% к объему питательной среды. Повышение дозировки выше указанного значения чревато снижением содержания аминного азота и, как следствие, уменьшением объема получаемой при культивировании бакмассы. Следует отметить, что активированный уголь является адсорбентом более широкого спектра действия, и эти его свойства целесообразно проверить на адсорбционную способность других вредных веществ в различных производственных средах.

При проведении стерилизации в потоке создается возможность снижения экспозиции нагрева до нескольких десятков секунд с одновременным повышением температуры до 130-140^оС. С учетом того, что образование пигментных веществ является функцией температуры и времени, применение кратковременной высокотемпературной стерилизации питательных сред позволяет избежать влияния этого негативного фактора. Однако, в вакцинном производстве, где объемы питательной среды, как правило, невелики (300-600 л), применение стерилизации в потоке нашло ограниченное применение.

Наиболее важными ростовыми соединениями, по мнению большинства авторов, являются аминокислоты. При этом главенствующую роль играют свободные аминокислоты. Так, установлено, что при культивировании пастерелл в питательной среде для нормального роста и достаточного накопления культуры необходимо присутствие таких аминокислот, как аспарагиновая, глутаминовая, лейцина, изолейцина, тирозина и фенилаланина. Также определено, что исследуемые штаммы не обладают биохимической активностью в отношении белков и липидов, что не совсем совпадает с данными других авторов, показывающих необходимость наличия в питательных средах этих высокомолекулярных соединений. По всей видимости, данный вопрос требует проведения отдельных исследований. Кроме того, имеются данные, что отдельные аминокислоты, не оказывая существенного влияния на накопление числа клеток, способствуют улучшению их морфологических характеристик. Так, отсутствие в питательной среде при культивировании бактерий рожи L-аргинина оказало негативное воздействие на их дальнейшие биотехнологические свойства. В то же время, установлено, что при культивировании коринебактерий валин в смеси с лейцином и изолейцином, находящиеся в питательной среде, ингибируют синтез фермента ацетолактсинтетазы, играющего важную роль в метаболизме микроорганизмов данного вида, в частности Corynebacterium glutamicum и Brevibacterium lactovermentum. L-глутамин не является незаменимой аминокислотой, однако играет важную роль биохимических процессах, выполняя роль нейромедиатора. Кроме того, установлено, что глутаминовая кислота в определенных дозах способна заменить метионин. Возможно, что аналогичными свойствами обладают и некоторые другие аминокислоты.

Наиболее универсальными и, как следствие, распространенными являются питательные среды на основе мясных бульонов, переваров и гидролизатов в сочетании с пептоном, а также другими жизненно необходимыми для микроорганизмов добавками. Так, рекомендовано использовать в составе питательных сред ферментативные гидролизаты мышц крупного рогатого скота и ферментолизат биомассы микроорганизмов. Выращенная при этом культура, в частности Bacteroides nodosus, отличалась высокой степенью накопления бакмассы, выработанная вакцина обладала достаточными иммуногенными свойствами. При этом себестоимость среды существенно снизилась за счет использования более дешевых компонентов. Положительные результаты получены и при добавлении ферментативного казеиново-дрожжевого гидролизата. Данная среда использовалась для культивирования микобактерий, лептоспир и других микробов. При этом авторы отмечают, что эффект от использования добавок достигается за счет высокого содержания в них липидов, в основном олеиновой и пальмитиновой кислот.

В последнее десятилетие достаточно широкое распространение получили среды, приготовленные из других видов белоксодержащих ингредиентов на основе рыбы, молочного и растительного сырья. Объединяющим моментом для этих сред является высокое содержание легкоусвояемых микробами аминокислот и низкомолекулярных полипептидов. Высокая степень расщепления белка в производстве сред достигается глубокой степенью гидролиза при помощи протеолитических ферментов пепсина, трипсина, протеаз и пептидаз. Глубина гидролиза и качество получаемого гидролизата зависят от вида используемого сырья, его предварительной подготовки, состава ферментной системы и соотношения непосредственно ферментов, температурных режимов и продолжительности процесса, а также ряда других технологических параметров, в частности прозрачности раствора, что достигается осветлением при помощи центрифуг, сепараторов и фильтрацией через селективные пластины из различных полимерных материалов.

С целью снижения стоимости сред проведены научные исследования, рекомендованы к применению и внедрены в реальное производство питательные среды с использованием отходов первичной переработки скота, в частности кровяные сгустки и поджелудочную железу, куриные эмбрионы, а также вторичные продукты молочной и комбикормовой промышленности, микробиологического и биохимического синтеза. При этом отмечено, что на фоне контрольных опытные образцы биопрепаратов отличала высокая степень роста числа бактериальных клеток в экспоненциальной фазе. Выращенные клетки имели типичную морфологию и высокие иммуногенные свойства.

⇐ Предыдущая 123 4 5 6 Следующая ⇒