Полуфабрикаты и основные питательные среды из них

⇐ ПредыдущаяСтр 5 из 6Следующая ⇒

Мясная вода. Мясо, очищенное от жира и сухожилий, пропускают через мясорубку и заливают двойным количеством холодной водопроводной воды, т. е. на 1 кг мяса берут 2 л воды. При желании уменьшить объем мясной воды (для хранения) можно мясо и воду взять и отношении 1: 1. Такую концентрированную мясную воду в дальнейшем для приготовления бульона надо развести в 2 раза. Если мясо низкого качества, то последующего разведения не требуется. Мясную воду вместе с мясом ставят на огонь и кипятят в течение 1 часа. Накипь снимают шумовкой до начала кипения. Настаивание мясной воды с мясом продолжительное время до кипячения не рекомендуется во избежание размножения бактерий. Лишь в тех случаях, когда требуется сброженная мясная вода, целесообразно настаивать мясную воду на мясе в течение 18—20 часов. Развивающиеся бактерии в той или другой степени сбраживают содержащийся в мясе гликоген. По окончании кипения дают мясной воде немного отстояться, фильтруют ее через полотно или фильтровальную бумагу, доливают водопроводной водой до первоначального объема, разливают по бутылям и стерилизуют при давлении в 1 атм. (120 °) 30 минут. После стерилизации на стенках бутыли и на дне получается осадок из свернувшихся белков. Поэтому перед приготовлением бульона мясную воду снова фильтруют. Мясная вода (мясной экстракт) содержит минеральные вещества, белки, углеводы, витамины.

Ход работы:

Мясо перемалываем, взвешиваем 100 г. фарша и кладем в кастрюлю. Мерным цилиндром (100 мл.) добавляем 200 мл воды, затем ставим на комфорку и доводим до кипения. Кипятим 30 мин и фильтруем бульон через марлевый фильтр.

Мясо-пептонный бульон. К мясной воде прибавляют 1% пептона и 0, 5% хлористого натрия, кипятят при помешивании. После растворения пептона устанавливают рН 20% раствором едкого натра сучетом того, что среда становится после стерилизации более кислой. Например, для получения в готовом бульоне рН 7, 5—7, 6 надо до стерилизации установить рН не ниже 8, 0. Если бульон предназначается для приготовления сахарного бульона или плотной среды (агара), следует устанавливать первоначальный рН не ниже 8, 2—8, 4. Для стабилизации рН рекомендуется к бульону добавлять фосфатные буферные смеси. Кипятят бульон на огне 30—40 минут в сосуде, закрытом крышкой. Отмечают уровень бульона и при выкипании приливают дистиллированную воду до первоначального объема. Можно сразу прилить 10% дистиллированной воды на выкипание. После окончательного установления реакции кипятят вторично, последнее кипячение лучше заменить автоклавированием при 1 атм. в течение 30 минут, для чего рекомендуется бульон разлить по бутылям. При этом очень хорошо осаждаются белки, что обеспечивает прозрачность бульона при последующей стерилизации.

После кипячения или автоклавирования оставляют среду для отстаивания до просветления жидкости, после чего осторожно сливают с осадка и фильтруют через полотняный фильтр или через 3—4 слоя фильтровальной бумаги. Осадок на фильтр не выливают. Разливать бульон сразу не рекомендуется. После автоклавирования его лучше оставить на некоторый срок в бутылях, за время хранения он хорошо отстаивается.
По мере надобности бульон фильтруют, разливают по пробиркам или флаконам и стерилизуют под давлением 1 атм. в течение 30 минут. После стерилизации, как и во всех остальных средах, необходима проверка окончательного рН.

Ход работы:

В плоскодонную колбу на 50 мл добавляют по 30 мл бульона, 10 мл 1% пептона и 10 мл 0, 5 % NaCl. Колбу помещают на водяную баню и кипятят при помешивании 30 мин с закрытой крышкой. Содержимое колбы выливают в мерный цилиндр, доводят дистиллированной водой до первоначального объема, затем выливают в колбу и доводят до кипения.

Перевар по Хоттингеру. 1 кг мяса, очищенного от жира и сухожилий, нарезают кусками примерно 1—2 см. Мясо опускают не большими порциями в кастрюлю с двойным количеством (по отношению к мясу) кипящей водопроводной воды; кипятят 15—20 минут, пока мясо не станет серым, что указывает на то, что белки свернулись. Мясо вынимают шумовкой и пропускают его через мясорубку. Устанавливают в жидкости рН 8, 0. Опускают фарш в жидкость и охлаждают до 40° в открытой кастрюле, затем добавляют поджелудочную железу (очищенную от жира, соединительной ткани и дважды пропущенную через мясо рубку) в количестве 10% к взятой жидкости (на 1 л жидкости 100 г железы) или сухой панкреатин в количестве 0, 5% и выше в зависимости от его активности. Хорошо размешивают, после чего снова подщелачивают смесь до рН 7, 8-8, 0 и повторяют такое подщелачивание через 30 минут. Отсутствие сдвига реакции смеси в сторону окисления указывает на недоброкачественность фермента. После установления рН смесь переливают в бутыль с плотной резиновой пробкой с таким расчетом, чтобы 1/3 бутыли оставалась свободной. Добавляют 1-3% хлороформа 10-30 мл на 1 л жидкости (в холодное время года меньше, чем в теплое), закрывают бутыль пробкой и несколько раз встряхивают так, чтобы хлороформ перемешался от дна бутыли к пробке и обратно, после чего на минуту вынимают пробку для освобождения от избытка паров хлороформа. Через 1-2 часа после добавления фермента опять проверяют реакцию и устанавливают рН 7, 4-7, 6. При этой реакции оставляют смесь для переваривания на 7-10-16 дней при комнатной температуре. Первые 3-4 дня переваривания ежедневно проверяют и исправляют реакцию. В эти дни также встряхивают перевар не менее 3 раз в сутки. В дальнейшем проверку реакции производить нецелесообразно, а встряхивать можно, реже; за 1-2 дня до окончания переваривания встряхивания совсем прекращают, чтобы перевар отстоялся. Конец переваривания характеризуется следующими признаками:

1) на дне бутыли собирается пылевидный осадок;

2) жидкость над осадком просветляется и принимает соломенно-желтый цвет;

3) перевар легко фильтруется;

4) реакция на триптофан с бромной водой должна быть положительной (в пробирку наливают 3-4 мл фильтрованного перевара, добавляют 3—4 капли бромной воды); при наличии триптофана жидкость принимает розово-фиолетовый цвет (сравнивают с контрольной пробиркой, где к перевару не прибавлена бромная вода);

5) гидролизатперевара доведен до содержания в нем 1100—1200 мг % общего азота.

По окончании гидролиза перевар фильтруют через полотняный или бумажный фильтр; разливают в бутыли и стерилизуют 30 минут при давлении 1 атм. (120 º )для хранения впрок. Перед употреблением фильтруют.

Ход работы:

К 30 мл мясного бульона добавляют 0, 5 г панкреатина, ставят колбу на водяную баню и доводят до кипения, затем охлаждают под струей холодной воды и подщелачивают 0, 1 раствором NaОН до рН 7, 8- 8, 0. Добавляют 0, 5 мл хлороформа под вытяжкой, хорошо закрывают резиновой пробкой и встряхивают. Затем под вытяжкой открывают колбу и оставляют на 30 минут выветриваться хлороформу при помешивании через 10 мин. Затем проверяют кислотность среды до рН 7, 4- 7, 6. Разливают по пробиркам, ставят в холодильник.

Лабораторная работа № 2

Тема: Плотные питательные среды и сухие питательные среды.

Консерванты и среды обогащения.

Плотные питательные среды

Питательные свойства плотной среды зависят исключительно от состава питательного бульона, из которого она изготовлена путем добавления агар-агара или желатины. Последние служат как желирующие вещества для создания плотности среды.

К мясо-пептонному бульону (МПБ) или бульону Хоттингера (рН 8, 2—8, 4) добавляют 2—2, 5% отечественного или 2% импортного мелко нарезанного агар-агара. К дрожжевому аутолизату необходимо добавить и 0, 5% поваренной соли. Концентрация агара в большой степени зависит от качества агар-агара.. Поэтому при употреблении новой партии агара необходимо проверить его желирующую способность. Если агар влажный, его следует до употребления подсушить.

Кастрюлю с бульоном и агаром ставят на огонь и кипятят до полного растворения агара. Во время кипячения необходимо все время помешивать во избежание пригорания. По окончании кипячения следует восстановить объем среды добавлением горячей дистиллированной воды. Проверяют и, если нужно, исправляют реакцию. При определении реакции в агаре или желатине температура этих сред должна быть не ниже 80°, так же как и температура воды, прибавляемой в пробирки компаратора. В противном случае агар или желатина очень быстро становятся плотными, что затрудняет определение. После установления реакции агар кипятят. Дают ему отстояться в теплом месте, после чего фильтруют в горячем состоянии через ватно-марлевый фильтр. Осадок на фильтр не выливают. Разливают в посуду, стерилизуют под давлением 1 атм. в течение 30 минут.

При приготовлении больших количеств агара (более 10 л) можно пользоваться другим способом его варки: кастрюлю с агар-агаром на любой питательной основе помещают в автоклав под текучий пар (100°) на 1 час. Текучим паром можно варить агар также в текучепаровом аппарате. Затем оставляют для медленного и равномерного отстаивания в теплом месте (можно оставить в автоклаве с потушенной горелкой) на 1 час, после чего проверяют реакцию, исправляют ее и фильтруют.

Можно после отстаивания дать агару застыть и на другой день срезать и удалить нижнюю его часть с осадком. Прозрачный слой измельчают ножом и расплавляют текучим паром при 100° (1- 1, 1\2 часа), после чего устанавливают реакцию и фильтруют. Если после расплавления срезанного агара в нем будет заметна муть, дают ему вновь отстояться в теплом месте, после чего осторожно сливают с осадка. Надо избегать подщелачивания готового агара, так как не исключена возможность выпадения осадка после подщелачивания при последующей стерилизации.

Прозрачный и светлый агар получают также путем просветления его яичным белком или кровяной сывороткой. На каждые 1—2 л агара, остуженного до 50 ^º, прибавляют белок одного куриного яйца или 25—50 мл кровяной сыворотки. Яичный белок нужно предварительно хорошо размешать с двойным объемом холодной воды. Употребляют только свежие яйца, в противном случае агар может сделаться еще более мутным. После прибавления белка или сыворотки агар тщательно размешивают и кипятят 10—15 минут па огне. Добавленный белок свертывается и адсорбирует взвешенные частицы. Крупнохлопчатый осадок легко отделяется фильтрованием. Фильтрованный агар разливают в посуду, стерилизуют в автоклаве под давлением 1 атм. в течение 30 минут. После стерилизации питательный агар, разлитый в пробирки, оставляют застыть столбиком, если он приготовлен не для немедленного использования, или скашивают (косой агар) для непосредственного употребления. Для скашивания пробирки с горячим агаром укладывают на покатой поверхности или под верхнюю часть пробирок подкладывают резиновую или стеклянную трубку. После остывания на агаровой среде собирается конденсационная жидкость, которая сохраняется некоторое время, если среду хранить в прохладном месте.

Рост микробов на влажном агаре лучше, чем на сухом. Последний следует расплавить и дать ему снова застыть, тогда выделится снова конденсационная вода. Однако многократное кипячение агара и особенно стерилизация снижают его плотность.

Для разливки в чашки Петри пользуются агаром из флаконов или пробирок. Непосредственно перед разливкой агар следует растопить на водяной бане или текучепаровом аппарате, а затем остудить до 50-55°. Чашки Петри должны быть стерильны. Срок годности чашек со средой до 48 часов. Хранить их следует на холоде.

Ход работы:

Наливают в пробирку мясо-пептонный бульон (1/2 пробирки), затем добавляют в нее 2% сухой агар-агар (предварительно замоченный в воде или бульоне до 2/3 объема пробирки). Смесь кипятят на водяной бане до полного растворения при помешивании, охлаждают пробирку в воде. Пробирки подписывают. Ставят в штатив в холодильник.

Сухие питательные среды

В последние годы в бактериологии широко пользуются сухими питательными средами. Это избавляет лаборатории от громоздкого процесса приготовления обычных сред, позволяет получать сравнимые результаты в разных лабораториях и, наконец, приближает к разрешению вопроса о стандартности питательных сред. Значение сухих сред возрастает в экспедиционных и полевых условиях.

Сухие питательные среды следует хранить герметически закрытыми и по возможности не на свету, так как препараты гигроскопичны и светочувствительны. Увлажнение, комкование и изменение цвета порошка свидетельствуют о понижении качества препарата. Сухие препараты, не содержащие глюкозы, даже при комковании могут не терять своих качеств, однако их пригодность следует проверить. При наличии же в сухой среде глюкозы комкование и изменение цвета порошка свидетельствуют о порче.

Технология приготовления питательных сред из сухих препаратов проста. Навеску, указанную па этикетке, всыпают в стеклянную колбу или бутыль с холодной дистиллированном водой. Смесь следует хорошо размешать до полного смачивания порошка водой. Затем в водяной бане или лучше в текучепаровом аппарате смесь нагревают до кипения, периодически помешивая. Кипятят до тех пор, пока порошок окончательно не растворится. Растворение на голом огне возможно, но требует большого внимания, чтобы не допустить пригорания среды. Перед разливкой следует среду хорошо перемешать. Сухие среды выпускаются основные, элективные и дифференциальные.

Сухой питательный агар (рН 7, 3—7, 6). К растворенному сухому агару (5—7, 5 г сухого агара на 100 мл) рекомендуется добавлять в качестве факторов роста небольшое количество дрожжевого аутолизата, мясной воды пли неразведенного триптического перевара мяса (около 1/3 растворяющей жидкости). Для выявления валообразования паратифозной В палочки, а также расщепления бактерий Зонне на круглые плоские варианты сухой агар растворяют дистиллированной водой, содержащей триптический перевар, в отношении 2: 1. Если после растворения агар недостаточно прозрачен, его фильтруют через ватно-марлевый фильтр. Разливают по пробиркам или флаконам. Стерилизуют под давлением 1 атм. в течение 20 минут.

Сухой питательный агар Д имеет в своем составе дрожжевой экстракт в качестве фактора роста. Прибавления дополнительных факторов роста не требуется. Способ приготовления не отличается от описанного для предыдущей среды.

⇐ Предыдущая 1 2 3 456 Следующая ⇒