Архитектура Аудит Военная наука Иностранные языки Медицина Металлургия Метрология Образование Политология Производство Психология Стандартизация Технологии |
МИКРООРГАНИЗМЫ — ПРОДУЦЕНТЫ ФЕРМЕНТОВ
Наиболее часто в качестве продуцентов амилолитических ферментов в спиртовом производстве используют микроскопические грибы, реже — дрожжеподобные организмы и споровые бактерии. МИКРОСКОПИЧЕСКИЕ ГРИБЫ Для получения амилаз широко применяют микроскопические грибы рода Aspergillus, видов: niger, oryzae, usamii, awamori, bata-tae, рода Rhizopus, видов: delemar, tonkinensis, niveus, japonicum и др., а также отдельные штаммы Neurospora grassa и Mucor. Микроскопические грибы очень широко распространены в природе; основное место их обитания — почва. Несмотря на наличие многих родов и видов микроскопических грибов, все они характеризуются нитевидным строением тела и специфическим строением плодоносящих органов. Тело гриба состоит из длинных переплетенных нитей сероватого или белого цвета, называемых гифами. Они распространяются по поверхности питательного субстрата, образуя мицелий, и частично врастают в него. Некоторые гифы, поднимающиеся над поверхностью в виде легкого пушка, имеют более сложное строение и представляют собой органы плодоношения, называемые конидие- или споран-гиеносцами. У мукоровых грибов на конце спорангиеносца находится шаровидное вздутие, окруженное оболочкой, внутри которого образуются споры. У аспергиллов конец конидиеносца имеет булавовидное утолщение, от которого отходят удлиненные клетки, называемые стеригмами; от стеригм отшнуровываются более мелкие круглые клетки — конидии. Отделившиеся конидии или споры, попадая в благоприятные условия, начинают прорастать, затем гифы ветвятся, образуя мицелий; при истощении питательных веществ в среде гриб переходит в стадию споро- или конидиеобразования. Споры и конидии микроскопических грибов содержат пигменты, что и придает зрелым культурам характерную окраску. На рис. 46 показана морфология микроскопических грибов. Для осахаривания на спиртовых заводах чаще используют аспер-гиллы: при поверхностном культивировании — Asp. oryzae и Asp. awamori, при глубинном культивировании — Asp. awamori 446 и иногда ВУД-Т2. На спиртовых заводах США применяют высокоактивный штамм Asp. awamori NRRL-3112. Аспергиллы — типичные аэрофилы, поэтому они могут развиваться только на поверхности твердой или жидкой среды или в жидкой, достаточно аэрируемой среде. Оптимальная температура для большинства аспергиллов 25...30 °С, для некоторых — до 35 °С. Большинство грибов при поверхностном культивировании могут переносить кратковременное повышение температуры до 40 °С и даже 45 °С без заметной потери активности ферментов. Оптимальная влажность среды для них около 65 %. Для питания аспергиллов необходимы углеводы, азотистые и минеральные вещества. В качестве источника углевода, кроме моносахаридов, многих олиго- и полисахаридов, могут служить спирты и органические кислоты, однако для накопления амилазы в среде обязательно должны присутствовать крахмал, декстрины или мальтоза. В средах, содержащих другие сахара, в том числе глюкозу, грибы не образуют амилазы. Источником азота могут быть белки и их гидролизаты, аммонийные соли и нитраты. Среда должна содержать соединения, в состав которых входят сера, фосфор, калий, магний и микроэлементы. Большинство микроскопических грибов усваивают серу из сульфатов, а фосфор — из фосфатов. Аспергиллы не нуждаются в готовых вита- Рис. 46. Микроскопические грибы: * — Asp. otyzae; 2 — Asp. awamori; 3 — Penicillium; 4 — Mucor; a — мицелий; б — конидие-носцы; в — конидии и споры минах и факторах роста, так как способны сами синтезировать их из более простых соединений, имеющихся в среде. Препараты ферментов из микроскопических грибов включают, как правило, широкий набор ферментов, поэтому могут полностью заменять зерновой солод. На спиртовых заводах стали широко применять высокоактивный по глюкоамилазе штамм Asp. awamori 466 и ВУД-Т2, выращиваемые на концентрированном кукурузном сусле (18 % сухих веществ). Готовая культура имеет активность до 250 ед. ГлА на 1 мл, других ферментов образует мало. ДРОЖЖЕПОДОБНЫЕ ОРГАНИЗМЫ Амилолитические ферменты синтезируют также некоторые дрожжи и дрожжеподобные грибы родов Saccharomyces, Candida, Endomycopsis и Endomyces. В спиртовом производстве нашли применение End. bispora и End. species 20-9, выращиваемые глубинным способом и продуцирующие главным образом активную глюкоамилазу; а-амилаз-ная активность проявляется слабо. Высокоактивный End. bispora имеет разветвленный мицелий, образует бластоспоры; гифы — септированные, зернистые; на твердых агаризованных средах образуют колонии с воздушным серовато-белым мицелием, на жидких питательных средах — гифы и некоторое количество бластоспор. Дрожжеподобные грибы в спиртовом производстве самостоятельно не применяют, так как они не содержат других ферментов, необходимых для нормального осахаривания сусла из крахмал содержащего сырья. Обычно их используют в смеси с ферментными препаратами из микроскопических грибов или бактерий. БАКТЕРИИ Активные амилазы способны синтезировать многие бактерии: Вас. subtilis, Вас. diastaticus, Вас. mesentericus, Вас. macerans и Вас. polymycus и др. Бактерии — продуценты амилолитических ферментов представляют собой палочки длиной 1, 2...1, 3 мкм и диаметром 0, 6...0, 8 мкм. Палочки соединяются по две, три, иногда образуют цепочки. Цикл развития бактерий короче, чем микроскопических и дрожжеподобных грибов. Например, культуру Вас. diastaticus выращивают в глубинных условиях при температуре 60 °С в течение 10... 12 ч. Бактерию Вас. subtilis-82, применяемую в настоящее время на спиртовых заводах как продуцент а-амилазы в смеси с препара- тами глюкоамилазы, выращивают в течение 48...60 ч при температуре 30...35 °С. Особенность бактерий — их способность образовывать высокоактивную термостойкую ос-амилазу, необходимую для разжижения и декстринизации крахмального клейстера на стадии под-варивания замесов и осахаривания сусла. НОМЕНКЛАТУРА ФЕРМЕНТНЫХ ПРЕПАРАТОВ Ферменты микробного происхождения применяют в спиртовом производстве в виде естественной культуры — сухой поверхностной или жидкой глубинной, а также в виде концентрированных препаратов. При определении названия ферментного препарата учитывают только основной фермент, активность которого в препарате превалирует. Название каждого препарата образуется из сокращенного названия этого фермента, вида микроорганизма-продуцента и оканчивается во всех случаях на «ин». Например, если продуцентом глюкоамилазы является Asp. batatae или Asp. awamori, то препарат называется соответственно глюко-бататин или глюкаваморин; если продуцент а-амилазы — Asp. oryzae или Вас. diastaticus, то препарат называется амилоризин или амилодиастатин. Для препарата, полученного глубинным культивированием, после названия ставится буква «Г», при поверхностном — «П». Условно количество фермента в стандартной глубинной или поверхностной культурах обозначается буквой «х». При этом под «стандартной культурой» понимается готовая культура продуцента, обладающая строго определенной активностью на единицу массы. Так, глубинную культуру End. bispora называют глюкоэн-домикопсин Гх, а поверхностную культуру Asp. oryzae — амилоризин Пх. Цифры перед буквой «х» в наименовании препарата показывают степень очистки фермента: Пх и Гх — это стандартная исходная культура продуцента без какой-либо очистки; П2х и Г2х — жидкий концентрат растворимых веществ исходной культуры, освобожденный от нерастворимой фазы, с содержанием сухих веществ 40...50 %; ПЗх и ГЗх — сухие ферментные препараты, полученные высушиванием экстракта из поверхностной культуры или культуральной жидкости при глубинном культивировании; ШОх и ПОх — сухие препараты, полученные осаждением ферментов из водных растворов органическими растворителями или высаливанием; Ш5х и П 5х — препараты ферментов, очищенных различными методами; П25х и Г25х — высокоочи-щенные, но не кристаллические ферментные препараты, содержащие до 20...25 % балластных веществ. Применение высокоочищенных препаратов от 10х до 25х в спиртовой промышленности нецелесообразно, так как они слишком дороги. Для осахаривания разваренной массы используют естественную культуру Гх или Пх или практически неочищенные концентрированные жидкие или сухие препараты П2х, Г2х, ПЗх и ГЗх.
ПРОИЗВОДСТВЕННЫЕ СПОСОБЫ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ Существует два способа культивирования микроорганизмов — продуцентов ферментов: поверхностный и глубинный. Первый способ, применяемый для культивирования микроскопических грибов, характеризуется развитием мицелия на поверхности твердого или жидкого субстрата. На жидком субстрате образуется пленка мицелия, продуцирующего не только амило-литические ферменты, но и органические кислоты, инактиви-рующие их, поэтому используют твердые субстраты с развитой поверхностью — пшеничные отруби, дробину барды, картофельную мезгу и др. Максимальная активность ферментов достигается при культивировании грибов на пшеничных отрубях. Дробина барды бедна питательными веществами, и активность ферментов в культурах грибов, выращенных на ней, в 4...5 раз ниже, чем на отрубях. Зрелая культура грибов вследствие обволакивания частиц отрубей мицелием имеет вид плотной войлокообразной массы. При поверхностном культивировании пшеничные отруби должны быть увлажнены и простерилизованы. В стерильных условиях готовят посевную культуру, но выращивают грибы в нестерильных условиях в кюветах, устанавливаемых в негерметичных растильных камерах. Теплоту, выделяющуюся в процессе роста грибов, удаляют продуванием через растильную камеру стерильного кондиционированного воздуха. Поверхностный способ выращивания микроскопических грибов имеет ряд преимуществ. Так как во время роста гриба отруби не перемешиваются, посторонние микроорганизмы не распространяются по всей их массе и вызывают лишь незначительное местное инфицирование, которое, как правило, не влияет на активность ферментов. Это, однако, не исключает необходимости тщательной стерилизации воздуха, среды и оборудования. Культуру на отрубях высушивают до содержания влаги 10...11 %. В таком виде она может храниться продолжительное время без значительной потери активности. Это позволяет организовать централизованное снабжение спиртовых заводов сухой культурой микроскопических грибов, что является одним из преимуществ поверхностного способа выращивания. Недостаток поверхностного способа — необходимость устанавливать множество кювет, работу с которыми трудно механизировать. Себестоимость культуры гриба-продуцента высока,
причем в основном из-за затраты большого количества ручного труда. Механизация процесса выращивания возможна путем создания непрерывнодействующих установок или бескюветных аппаратов с вертикальным толстым слоем питательной среды и интенсивным продуванием воздуха через этот слой. Глубинную культуру микроорганизмов выращивают на жидкой питательной среде- при энергичной аэрации в герметически закрытых аппаратах и в стерильных условиях. Процесс полностью механизирован. Стерильность глубинной культуры микроорганизма — продуцента ферментов положительно отражается на результатах сбраживания сусла дрожжами. ПОВЕРХНОСТНОЕ КУЛЬТИВИРОВАНИЕ МИКРОСКОПИЧЕСКИХ ГРИБОВ Питательные среды. При поверхностном культивировании твердой средой обычно служат пшеничные отруби, содержащие в достаточных количествах все вещества, необходимые для питания грибов. Лучшие результаты достигаются при содержании не менее 16 % крахмала в отрубях или в другой питательной среде. Получение посевного материала. Для засева производственной питательной среды может быть использован посевной материал трех видов: споры, мицелий и спороносящая культура, выращенная на твердой питательной среде. Споровый материал готовят поверхностным культивированием гриба на твердой или жидкой питательной среде в специальных аппаратах с кюветами. В первом случае гриб выращивают в пробирке на косом агаре до обильного образования спор, затем спорами засевают колбы со стерильными пшеничными отрубями, наконец, спороносяшую культуру передают в специальный аппарат. По окончании спорообразования в этом аппарате отбирают споры посредством специального вибросепаратора при тщательной аспирации. Споры фасуют в полиэтиленовые мешочки, стеклянные или дюралюминиевые банки, в которых они могут сохраняться при температуре от 8 до 24 °С около 1, 5 лет. Во втором случае из спор, собранных в пробирке с косым' Споры (конидии), полученные любым методом, обладают водоотталкивающей способностью и почти не смачиваются водой, л Это свойство приводит к неравномерности засева среды и, следовательно, к неодинаковой скорости роста культуры. Смачивае мость спор можно улучшить, если добавить в их водную суспензию 25...50 мг поверхностно-активного вещества, например ал-килбензолсульфата на 1 г спорового материала. При этом всхожесть спор остается без изменения. Для сокращения длительности культивирования микроскопических грибов в производственных условиях можно применять предварительное проращивание спор в течение 7 ч в жидкой питательной среде до появления ростовых трубочек. При этом продолжительность лаг-фазы сокращается на 8...9 ч и увеличивается оборачиваемость растильных камер. При использовании спорового материала упрощается технологический процесс, появляется возможность более полно механизировать его, а также сократить площадь цеха чистой культуры. Централизованное производство спорового материала для группы предприятий, работающих с данным штаммом гриба, выгодно создать в одном специализированном цехе чистой культуры. Положительный опыт подобной организации имеется в производстве лимонной кислоты биотехнологическим способом. Исследователями б. ВНИИПрБ было предложено засевать производственную питательную среду мицелием, полученным глубинным культивированием гриба или бактерий в колбах на качалке. При высокой производительности предприятия целесообразно выращивать посевной мицелий в небольших ферментерах, как это было предложено А. П. Левчиком и осуществлялось на Мичуринском экспериментальном ферментно-спиртовом заводе. На спиртовых заводах получило распространение приготовление посевного материала в виде поверхностной культуры гриба на пшеничных отрубях, которое складывается из следующих двух операций: выращивание спороносной культуры гриба в пробирках на сусло-агаре; засев спорами пшеничных отрубей в колбах и выращивание культуры гриба. Культуру получают из лаборатории чистых культур ВНИИПрБ. Исходная — музейная чистая культура хранится в холодильнике при температуре от 2 до 4 °С. Один раз в месяц пересевают споры музейной культуры из пробирки в пробирку с сусло-агаром с соблюдением правил проведения микробиологических работ. При этом первая засеянная пробирка является музейной, а остальные две-три пробирки используют для дальнейшего размножения. Засеянные пробирки помещают в термостат при температуре 30 °С и выдерживают в нем в течение 4...6 сут. При нормальном росте поверхность сусло-агара равномерно покрывается спороносящим мицелием. Культура гриба с плохим спороношением, медленно растущим мицелием, пушком вторичного роста в производство не допускается. Пробирки с вырос- шеи культурой вынимают из термостата и хранят в холодильнике. Перед посевом в колбы проверяют чистоту культуры высевом в чашки Петри и микроскопированием. Чистая культура на сусло-агаре служит исходным материалом для размножения грибов на пшеничных отрубях в колбах. Отруби смешивают с водопроводной водой в соотношении 1: 0 7 и переносят в несколько колб по 10...20 г в каждую. Колбы закрывают ватными пробками и стерилизуют в автоклаве при избыточном давлении 0, 15 МПа в течение 1 ч. После охлаждения до комнатной температуры в колбы вносят суспензию спор гриба, содержащую 150...200 тыс. спор в 1 мл. Для этого в пробирку с культурой гриба на сусло-агаре прибавляют 10 мл стерильной водопроводной воды и при помощи стерильной пипетки над огнем соскабливают конидии гриба. Полученную суспензию используют для посева (2...2, 5 % массы засеваемой среды или 0, 4...0, 5 мл на 10 г отрубей). Выращивание ведут в термостате при температуре 30 °С в течение 4...5 сут. Одну из колб предназначают для дальнейшего размножения чистой культуры, остальные колбы хранят в холодильнике до последующего цикла. В колбу, используемую для размножения, вливают 50...60 мл стерильной водопроводной воды и над пламенем стерильной пипеткой тщательно перемешивают. Расход чистой культуры при пересеве из колбы в колбу или банку составляет 5... 10 % массы засеваемой среды. Размножение посевного материала. Пшеничные отруби подготавливают так же, как и при получении чистой культуры. Отруби, стерилизованные в бюксах под избыточным давлением 0, 15 МПа в течение 1, 5 ч, переносят на специальный стол, предварительно вымытый и продезинфицированный. Охлаждение отрубей до температуры 40...42 °С проводят перемешиванием с соблюдением правил микробиологической чистоты. Затем их засевают спорами из колбы с чистой культурой (расход культуры 0, 5... 1 % массы отрубей). Суспензию спор готовят из расчета 1 часть культуры на 5 частей воды. Засеянные отруби распределяют по кюветам, предварительно простерилизованным при 120 °С в течение 2 ч, слоем толщиной 2...2, 5 см. Кюветы сверху закрывают крышкой, под которую подкладывают стерильную бумагу на отверстие по центру крышки накладывают стерилизованную ватную подушку, после чего кюветы помещают в термостат на 18...24 ч при температуре 30...32 °С. В дальнейшем кюветы устанавливают на стеллажи, расположенные в самой растильной камере, и ведут выращивание при 24...28 °С в течение 3...4 сут. Выросшую культуру затем помещают в комнату подсушки и в воздушно-сухом состоянии передают на хранение в кладовую, температура в которой не должна превышать +8 " С, но не ниже Посевной материал, приготовленный описанным способом, представляет собой спороносную культуру гриба, содержащую не менее 0, 7 млрд спор в 1 г, из которых 86...90 % способны к прорастанию. Посевной материал не должен содержать посторонней микрофлоры, подвергаться замораживанию, оттаиванию и увлажнению. Производственное культивирование. Технологическая схема получения культуры микроскопических грибов в растильных камерах на кюветах приведена на рис. 47. Этот способ связан с большими затратами ручного труда, однако пока применяется на заводах. Пшеничные отруби ковшовым элеватором / подают на автоматические весы 2, отсюда они поступают в загрузочный бункер 3, а из него — в стерилизатор 5. В этом аппарате отруби увлажняются водой, подаваемой через форсунки из бака 4 для стерильной воды. На 1 кг отрубей добавляют 0, 2 л воды и 7...8 мл соляной кислоты относительной плотностью 1, 19 или 2, 7...3, 0 мл серной кислоты плотностью 1, 84. Отруби стерилизуют острым паром при температуре 103... 105 °С (давление 0, 07 МПа) в течение 1...1, 5 ч, периодически включая мешалку. По окончании стерилизации влажность отрубей доводят до 58...60 %, охлаждают их до 40...42 " С и затем вносят культуру гриба, полученную в отделении чистых культур. Расход посевного подсушенного материала составляет 0, 5.„0, 6 % массы отрубей. Посевной материал вводят в виде водной суспензии, приготовляемой из культуры гриба в 5... 10-кратном количестве кипяченой воды. Рис. 47. Технологическая схема получения культуры микроскопических грибов в камерах на кюветах Засеянную среду тщательно перемешивают в течение 15...20 мин, выгружают на раскладочный стол 6 и распределяют по кюветам. Наполненные кюветы ставят в этажерки 7, перевозят их на тележках в растильную камеру 8, в которой поддерживают температуру 30...32 " С в течение 12... 16 ч (до начала интенсивного роста). В дальнейшем из кондиционера 9 в камеру подают вентилятором кондиционированный воздух температурой 26...28 " С и относительной влажностью 96...100 %. К концу выращивания культуры температуру снижают до 24...26 °С. Общая продолжительность выращивания 36...42 ч. В тех случаях, когда использование готовой культуры для осахаривания разваренной массы задерживается более чем на 2 ч, ее высушивают до влажности 18...20 %. При необходимости транспортировки на дальние расстояния культуру гриба дробят на шнеке-дробилке 10 и дезинтеграторе 11 до получения частиц размером не более 10 мм и высушивают в сушилке 18 теплым воздухом до содержания влаги не более 10... 12 %. Воздух нагревают в калорифере 20 и подают в сушилку вентилятором 19. Отработавший воздух удаляют вентилятором 17 и выбрасывают в атмосферу через циклон 14. Высушенную культуру шнеком 16 подают на весы 15 для фасования. Сюда же подаются уловленные в циклоне частички культуры, унесенные воздухом. Освободившиеся кюветы проходят через мойку 12, обеспложиваются в стерилизаторе 13 и возвращаются под загрузку. Готовую культуру гриба упаковывают в бумажные крафт-мешки. Каждый мешок снабжают этикеткой или биркой с указанием завода-изготовителя, наименования продукта, даты выпуска, номера партии, активности ферментов и массы. Хранят культуру в сухом помещении на деревянных стеллажах. Предложены технологические схемы производства поверхностных культур плесневых грибов с использованием механизированных растильных установок: с вертикальными каналами (установка была смонтирована на Мичуринском экспериментальном заводе и может быть использована на предприятиях средней мощности — до 2 т культуры гриба в сутки); непрерывнодейст-вующей конвейерно-пластинчатой, предназначенной для специализированных ферментных предприятий мощностью более 2 т культуры в сутки. ГЛУБИННОЕ КУЛЬТИВИРОВАНИЕ МИКРООРГАНИЗМОВ \ При глубинном культивировании микроорганизмы развиваются во всем объеме жидкой питательной среды. Так как подав-: ляющее большинство продуцентов ферментов — строгие аэробы, среду интенсивно аэрируют. В микроорганизмах протекают два-связанных процесса — синтез биомассы и синтез ферментов. Питательные среды. Для глубинного культивирования исполь зуют жидкие среды, содержащие твердые компоненты. При работе с комплексными средами, основанными на естественном сырье с добавлением отрубей, ростков, кукурузного жмыха, глю-тена, свекловичного жома, спиртовой барды, следят за тем, чтобы не было крупных комочков, так как они затрудняют стерилизацию и могут привести к закупорке коммуникаций. Поэтому перед смешением твердых компонентов необходимо проводить их просеивание или грубую фильтрацию (например, зерно-картофельной барды). Жидкую часть питательной среды (воду или фильтрат барды) обогащают питательными солями, гидролизатами белков, аминокислотами, источниками витаминов, различными углеводами. Содержание сухих веществ в жидких средах может колебаться от 1, 5 до 20 % в зависимости от продуцента и принятого режима культивирования. Ниже в качестве примера приведен состав питательных сред (%) для производственного культивирования двух микроорганизмов. Среда для Asp. batatae 61 Грубый фильтрат барды ' 96, 6 Мука кукурузная или пшеничная 1, 95 Кукурузный экстракт 0, 6 Селитра аммиачная (NH4NO3) 0, 5 Мел (СаСОз) °-2 Магнезит (MgO) ОД Растительное масло (пеногаситель) 0, 05 Среда для Asp. awamori 466 и для ВУД Т2 Кукурузный затор, осахаренный ячменным 1.2...3 солодом (1, 2...3 %) или бактериальной а-амилазой (1 ед. АС на 1 г крахмала) Содержание сухих веществ 18...20 В научно-исследовательских организациях постоянно проводится работа по улучшению эффективности производства ферментных препаратов, в основном по повышению активности зрелой культуры. Это достигается не только селекцией штаммов микроорганизмов, но и совершенствованием условий культивирования, в том числе и изменением состава питательной среды, поэтому приведенные среды могут подвергаться значительным изменениям при корректировании аэрации и других условий культивирования. Получение и размножение посевного материала. Для засева производственной питательной среды при глубинном культивировании посевной материал готовят глубинным или поверхностным способом. Вид посевного материала зависит от продуцента: для грибов это вегетативная мицелиальная масса или споронося-щая поверхностная, для бактерий — молодая растущая культура на начальной стадии спорообразования. Посевной материал получают постадийным увеличением массы культуры продуцента. При небольшой производительности цеха это сводится к одной или двум операциям, а для заводов большой производительности представляет собой многоступенчатый процесс. В качестве примера ниже приведена схема приготовления посевного материала для производственного культивирования микроорганизмов. Для Asp. awamori 466 Пробирка с исходной культурой на агаризованной питательной среде
Пересев водной суспензии культуры в колбы с жидкой питательной средой, содержащей 5 % кукурузной муки и 0, 5 % дрожжевого автолизата, культивирование на качалке в течение 48 ч
Пересев культуры в сосуды вместимостью 6 л (объем засева 10... 12 % к объему питательной среды), культивирование 48 ч
Пересев культуры в инокулятор на кукурузное сусло концентрацией 6 %, культивирование в течение 48 ч при температуре 27 " С, перемешивании мешалкой и подаче воздуха 16 м Дм ч).
Пересев культуры в производственный ферментер (количество засева 3 % к объему питательной среды) В связи с вводом штаммов микроскопического гриба Asp. awamori 466 или ВУД Т~2 усовершенствована и значительно упрощена схема приготовления спорового взамен вегетативного посевного материала. В простейшем виде она выглядит следующим образом. Пробирку с исходной культурой на агаризованной питательной среде пересевают водной суспензией в колбы со стерильными отрубями, которые выдерживают в термостате до полного созревания культуры. Из колб посевной материал в виде водной суспензии спор пересевается непосредственно в производственный ферментер, минуя инокулятор. В зависимости от объема ферментера количество посевных колб увеличивают в 2..4 раза. Спорового посевного материала вполне хватает для того, чтобы вырастить достаточно активную культуру при обычной продолжительности процесса. При этом получаются большой выигрыш в трудоемкости операций и более надежная защита от инфекции, так как в 2 раза сокращаются число операций и продолжительность выращивания посевного материала. Культивирование на всех стадиях должно проводиться при оптимальной температуре, аэрации и строго определенное время. Если возникают непредвиденные задержки в использовании, то посевной материал охлаждают до 8... 10 °С и хранят не дольше 4 ч, иначе качество его может резко ухудшиться. Посевной материал как на отдельных стадиях, так и готовый подвергают тщательному микробиологическому контролю. Он не должен быть инфицирован посторонней микрофлорой, в нем должно содержаться определенное количество спор или клеток на единицу массы, генетически заложенные в нем свойства продуцировать ферменты должны стойко сохраняться. Производственное культивирование. Известны следующие способы глубинного культивирования: периодический, непрерывно-циклический и непрерывно-проточный. Периодический способ характеризуется несменяемостью питательной среды в ферментере, состав которой в процессе развития постепенно изменяется. Процесс протекает по-стадийно: в ферментер набирают питательную среду и задают посевной материал; после размножения микроорганизмов и накопления продуктов их обмена зрелую культуру выгружают, а все оборудование, коммуникации и запорные устройства промывают, а затем стерилизуют паром. При непрерывноциклическом способе микроорганизмы, расположенные на неподвижной насадке в ферментере, омываются средой, протекающей в замкнутом контуре, до полного потребления ими питательных веществ. После этого зрелую культуру выгружают, начиная с последнего, аппараты промывают, стерилизуют и цикл повторяют с последнего головного ферментера. Богатая питательными веществами среда в ходе такой циклической ферментации постепенно истощается; по времени пребывания среды в зоне реакции этот процесс более продолжителен, чем периодический. Непрерывно-проточный способ культивирования микроорганизмов более совершенен. Суть его заключается в том, что микробная популяция развивается в проточной питательной среде. Способ имеет две разновидности: гомогенно-непрерывный и градиентно-непрерывный. В первом случае выращивание ведут в одном ферментере; при тщательном перемешивании среды и аэрации обеспечивается одинаковое состояние культуры во всем объеме жидкости. В ферментер при этом непрерывно поступает свежая среда, а из него также непрерывно вытекает избыток зрелой культуральной жидкости. Градиентно-непрерывное культивирование осуществляют в батарее ферментеров, соединенных переточными трубами. Засеянная среда с большим содержанием углеводов и других ингредиентов непрерывно перетекает из одного ферментера в другой и также непрерывно вытекает в виде готовой культуры. Непрерывным культивированием в проточных средах можно выращивать микроорганизмы в условиях, оптимальных для их стадии развития. При этом такие важные факторы, как концент- рация питательных веществ, количество продуктов обмена, рН, содержание растворенного кислорода, резко изменяющиеся при периодическом способе культивирования, поддерживаются постоянными на заданном уровне или изменяются по разработанной программе. Способы непрерывного культивирования в производстве ферментных препаратов для спиртового производства еще находятся в стадии производственных испытаний. Поэтому, к сожалению, в настоящее время на заводах до сих пор применяют периодическое культивирование микроорганизмов. Технологическая схема глубинного культивирования Asp. awamori для производства Глюкаваморина Гх-466 приведена на рис. 48. Посевной материал готовят в производственном инокуляторе 23, представляющем собой цилиндрический сосуд со сферическим днищем и крышкой. Аппарат имеет следующие узлы и арматуру: устройство для аэрации и перемешивания (форсунки или барботеры, двухъярусная мешалка); патрубок для подвода пара; посевной люк; пробоотборник; гильзы для термометра; патрубки для подачи питательной среды и спуска промывных вод, для манометра, подвода и отвода воздуха; люк для мойки и осмотра аппарата; линию спуска готового посевного материала; индивидуальный воздушный фильтр. Корпус аппарата имеет рубашку для охлаждения. При заполнении аппарата питательной средой открывают подачу пара на аэрирующее устройство и включают насос для питательной среды. В качестве питательной среды используют осахаренное сусло из кукурузной муки, приготовленное в смесителе 15, с содержанием сухих веществ 6 % по сахаромеру. Для этого в смеситель 15 набирают воду и при постоянной работе мешалки из осахарива-теля 11 насосом 19 перекачивают сусло. Соотношение сусла и воды должно быть 1: 2. После тщательного перемешивания питательную среду нагревают в контактной головке /7 до 85 °С путем многократного перекачивания насосом 16. Подогретую среду передают в подготовленный посевной аппарат. С целью предотвращения ценообразования перед подогревом в среду добавляют подсолнечное масло из расчета 0, 1...0, 15 % объема. Рис. 48. Апнаратурно-технологическая схема производства Глюкаваморина фильтр грубой очистки; 2 — компрессор; 3 — алагоотделитель; 4, 21 — теплообменники; 5— маслоотделитель; 6, 22 и 25 — фильтры; 7— шнек для подачи муки; <? — смеситель; 9, 16, 19, 27, 29—насосы; 10 — варочный аппарат; 11 — осахариватель; 12 — солододробилка; 13 — бак для солодового молока; /4 —дозатор; 15 — смеситель; 17, IS— контактные головки; 20 — стерилизатор; 23— инокулятор; 24— ферментер; 26— бачок для пеногасителя; 28 — скруббер В посевном аппарате 23 среда сначала подогревается до 100 °С острым паром, подаваемым через форсунку, линию передавливания и нижний спускной штуцер при открытой выхлопной воздушной линии. Затем вентиль на выхлопной линии закрывают, и температура среды поднимается до 121... 123 °С (давление 0, 1...0, 15 МПа). При такой температуре среда выдерживается в течение 60 мин. По окончании стерилизации давление в аппарате медленно снижается до 0, 03...0, 05 МПа. Затем в аппарат постепенно подается стерильный воздух для поддержания избыточного давления в нем 0, 02...0, 03 МПа, а в рубашку аппарата поступает холодная вода. После охлаждения массы до 27 °С засевают среду культурой, полученной на второй стадии, в количестве 0, 5... 1, 0 % через посевной люк с соблюдением условий стерильности при минимальном движении окружающего воздуха. Режим выращивания посевного материала: давление 0, 02...0, 03 МПа, температура 27...28 " С, расход воздуха 16 м3/(м3ч), частота вращения мешалки 5, 8 с~К Продолжительность выращивания посевного материала 24 ч. Через 12 ч после начала выращивания и перед посевом в ферментер с соблюдением условий стерильности из аппарата отбирают пробы для определения рН, посторонней микрофлоры, концентрации сухих веществ. Глубинную культуру выращивают в ферментере из нержавеющей стали в стерильных условиях при постоянном перемешивании и аэрировании среды. Процесс выращивания глубинной культуры состоит из следующих операций: подготовка ферментера к приему питательной среды, приготовление питательной среды, стерилизация питательной среды, охлаждение и засев питательной среды посевной культурой в ферментере, ферментация. Ферментер 24 снабжен рубашкой для обогрева и охлаждения, аэрирующим устройством, патрубками для подвода пара, посевной и спускной линиями, гильзой для термометра, штуцером для манометра, пробоотборником, пеногасительным бачком и индивидуальным воздушным фильтром. Подготовка ферментера к приему питательной среды состоит в мойке, осмотре, проверке герметичности и стерилизации при температуре 120... 125 °С в течение 60 мин. После снятия давления и охлаждения до температуры^ 27...28 °С в ферментер загружают питательную среду. Для приготовления питательной среды используют кукурузное| сусло с концентрацией сухих веществ 18...20 %, которое получают по следующей схеме: кукурузную муку через порционные! автоматические весы шнеком 7 загружают в смеситель 8, в который одновременно и при постоянной работе мешалки поступает вода температурой не более 45 °С. Соотношение муки и воды 1: (2, 5...3, 0). Полученную массу насосом 9 перекачивают в варочный аппарат 10, работающий под давлением. Масса в аппарате нагревается острым паром, который подводят снизу. Разваривание проводится при температуре 143...151 " С, давлении 0, 3...0, 4 МПа в течение 15...20 мин. Разваренная масса поступает в осахариватель 11, оборудованный змеевиком для охлаждения. Перед подачей массы в осахариватель добавляют воду в количестве 5 % объема разваренной массы. |
Последнее изменение этой страницы: 2017-03-15; Просмотров: 1933; Нарушение авторского права страницы