Определение устойчивости и чувствительности бактерий

К антибактериальным препаратам. Микробиологический

Контроль антисептиков, дезинфектантов, методов стерилизации

Системой мероприятий, направленных на предупреждение заноса микробов из внешней среды в ткани и полости человеческого организма, в питательные среды, культуры микробов и пр. при лечебных, диагностических, лабораторных и др. манипуляциях, можно создать безмикробные условия при работе с микроорганизмами, различными травматическими манипуляциями и пр.

Методы контроля эффективности стерилизации

1. Контроль действия высоких температур. В три пробирки с питательным бульоном поместить шелковые нити, смоченные смесью споровой и неспоровой культур. Первую пробирку подвергнуть автоклавированию, вторую - кипячению, третья - контроль. Посевы после этих процедур выдержать при 37⁰ С в течение 24 ч. Отметить рост культур.

2. Контроль перевязочного материала и хирургического инструментария. Проводят посев исследуемых образцов (смывы с хирургических инструментов, перевязочного или шовного материала и пр.) на три среды: сахарный бульон, тиогликолевую среду, жидкую среду Сабуро. Посевы инкубируют в термостате до 14 дней. При отсутствии роста на всех средах материал считают стерильным.

3. Изучение антибактериального действия УФ-лучей. Суспензию стафилококка в изотоническом растворе хлорида натрия в объеме 1 мл поместить на стерильное часовое стекло и облучить лампой БУФ-30 в течение 15 мин на расстоянии 10-20 см от центра лампы. Облученную и необлученную (контроль) культуры бактерий засевают в питательный бульон и инкубируют при 37⁰ С в течение 16-24 ч, после чего отмечают результат по росту культур. Отсутствие помутнения среды связано с гибелью бактерий при облучении. В контроле должно быть отмечено помутнение среды, что свидетельствует о росте бактерий.

4. Определение антимикробного действия антисептических и дезинфицирующих веществ.

А) Подготовить два вида тест-объектов: шелковые нити, смоченные культурой E.coli, и шелковые нити, смоченные спорообразующей культурой. Нити поместить в растворы 5 % фенола, 5 % лизола, 10 % хлорной воды на 5 и 60 мин, после чего отмыть и засеять их в питательный бульон. Инкубировать в термостат при 37⁰ С в течение 18-24 ч. Контрольные тест-объекты не обрабатывать химическими растворами.

Б) Диски из фильтровальной бумаги смочить растворами химических веществ, положить их на поверхность питательной среды в чашки Петри, засеянной тест-культурой газоном. Чашки инкубировать при 37⁰ С в течение 18-24 ч. Об антибактериальном действии судят по зонам задержки роста бактерий, образующихся вокруг дисков.

Антимикробное действие антибиотиков

Антибиотики - это очишенные высокоактивные биологические препараты микробного, животного и растительного или биотехнологического происхождения, предназначенные для биоцидного или биостатического действия на рост и размножение чувствительных к ним микробов.

Антибиотики - это особые биологические вещества, продуцируемые некоторыми видами микроорганизмов и другими живыми организмами, способные в малых дозах убивать или задерживать рост микробов. Каждый из антибиотиков имеет определенный спектр действия, очерченный кругом чувствительных к ним микроорганизмов. Антимикробную активность антибиотиков выражают в единицах действия - ED, которая обычно, составляет 1 мкг химически чистого препарата, за исключением пенициллина (0, 6 мкг), нистатина (0, 3 мкг), полимиксина (0, 1 мкг).

Резистентность бактерий – это следствие хромосомных или R-плазмидных генетических превращений. Видовая резистентность микробов определяется хромосомными генами. Так, Грам (+) бактерии малочувствительны к пенициллинам, т.к. они плохо проникают через наружную мембрану (кроме нейссериевых).У синегнойной палочки - это результат толстого слоя слизи. Бактерии могут быть лишены атакуемой, например, пенициллинами, мишени - отсутствие у микоплазм и L-форм бактерий клеточной стенки. На анаэробы не действуют аминогликозиды. а на аэробы не действует митронидазол и пр.

Штаммовая резистентность (R-плазмиды, транспозоны) микроорганизмов определяется быстротой распространения подвижных генов внутри популяции или вида. В этом случае антибиотики действуют как селекционирующий фактор - в его присутствии выживают лишь резистентные штаммы.

Чувствительность микробов к антибактериальному действию определяют методами диско-диффузионным или разведений антибиотиков.

1. Диско-диффузионный метод

Используют стандартные среды: АГВ № 1 и № 2 (отечественные), агар Miller-Hinon 2.

Cтандартные диски с антибиотиками промышленного производства используют до окончания их срока годности.

На поверхность подсушенной питательной среды в чашках Петри наносят 1 мл исследуемой бульонной культуры (18-24 ч роста) которую равномерно распределяют по чашке. Избыток культуры удаляют отсасыванием пипетками.

Чашки подсушивают 10-15 мин при комнатной температуре.

Диски с антибиотиками накладывают пинцетом (на расстояния 2 см от края чашки, не более 6 дисков на чашку). При возможности используют для наложения дисков устройство - диспенсер. Чашки ставят вверх дном в термостат и инкубируют при 37⁰ С в течение 18-24 ч.

Для учета результатов чашки помещают кверху дном на матовую поверхность, которую освещают под углом 45⁰. С помощью линейки измеряют диаметр зон задержки роста вокруг дисков, с точностью измерения до 1 мм. Диаметр зон измеряют по четкому контуру.

2. Метод серийных разведений

Данным методом определяют минимальную концентрацию антибиотика, которая может ингибировать рост исследуемой культуры бактерий.

Готовят основной раствор, содержащий определенную концентрацию антибиотика (мкг на 1 мл или ED на 1 мл) в специальном растворителе или буферном растворе. Из раствора делают 7 последовательных разведений в пробирках в объеме 1 мл на бульоне. К каждому разведению добавляют по 0, 1 мл исследуемой бактериальной культуры, содержащей 10⁶-10⁷ бактериальных клеток в 1мл. В последнюю пробирку вносят 1 мл бульона и 0, 1 мл культуры (контроль посева). Посевы инкубируют при 37⁰ С до следующего дня, после чего отмечают результаты, сравнивая степень помутнения бульона во всех пробирках с контролем.

Последняя пробирка с прозрачным содержимым указывает на задержку роста микробов под действием минимальной ингибирующей дозы антибиотика. Оценку чувствительности микробов проводят по таблице № 11.

Устойчивыми являются микроорганизмы, рост которых не подавляется концентрациями, антибиотиков, создаваемыми в организме людей при использовании предельно-допустимых доз. Соответственно чувствительными являются штаммы микробов, рост которых подавляют концентрации препаратов, обнаруживаемые в сыворотке больного, используя обычные дозы антибиотиков. Для определения антибиотикочувствительности следует делать разведения антибиотиков, согласно таблицы № 12

Определение антибиотика в крови у человека. В штатив устанавливают 2 ряда пробирок. В одном ряду делают последовательные разведения эталонного антибиотика, а в другом - исследуемой жидкости (крови). В каждую пробирку вносят взвесь тест-бактерий, которые были приготовлены в среде Хисса с глюкозой.

В качестве тест-бактерий используют S.aureus (определение пенициллина, тетрациклина, эритромицина) и E.coli для определения стрептомицина. После инкубации посева при 37^о С

в течение 18-24 ч отмечают рост культуры по помутнению среды и ее окрашиванию (таблица № 11 и 12).

Таблица № 11.

Антибиотики	Метод диска. Диаметр зон задержки роста в мм на среде АГВ	Метод серийных разведений, МИК мкг на 1 мл
	устойчивые	умерено устойчивые	чувствительные	устойчивые	чувствительные
Бнзпенициллин- стафилококки		21-28		-	0, 1
Ампициллин- стафилококки		21-28		-	1, 5
Карбенициллин-эшерихии		15-18
Метициллин		14-18		-
Оксациллин		16-19		-
Стрептомицин		17-19
Тетрациклин		17-20
Эритромицин		18-21

 

Таблица № 12.

Номер пробирки	Разведение анти- биотика в пробирке	Концентрация анти- биотика, мкг 1 мл	Доза исследуемой культуры	Рост бактерий, помутнение среды
	1: 100		0, 1	-
	1: 200		0, 1	-
	1: 400		0, 1	-
	1: 800	12, 5	0, 1	-
	1: 1600	6, 25	0, 1	+
	1: 3200	3, 12	0, 1	+
	Без антибиотика		0, 1	+ контроль

 

В качестве тест-бактерий используют S.aureus (определение пенициллина, тетрациклина, эритромицина) и E.coli для определения стрептомицина. После инкубации посева при 37^о С в течение 18-24 ч отмечают рост культуры по помутнению среды и ее окрашиванию.

Если максимальное разведение исследуемой жидкости, задерживающее рост S.aureus, например, было 1: 800, а минимальная концентрация эталонного антибиотика, которая могла задерживать рост этого микроба 0, 220 мкг в 1 мл, то произведение 800х0, 220 = 176 мкг в 1 мл, составляет концентрацию антибиотика в 1 мл.

Экология микроорганизмов

Микробиологическую оценку санитарно-гигиенического состояния объектов внешней среды проводят в бактериологических лабораториях ЦГСЭН с помощью методов санитарной микробиологии.

Целью санитарно-микробиологических обследований объектов внешней среды является установление их эпидемической безопасности. Для этого применяют методы определения общей микробной обсемененности, обнаружения санитарно-показательных и патогенных микроорганизмов (таблица № 13).

О микробной обсемененности судят по общему количеству микробов в единице или площади (1 см³ воды, 1 г почвы и т.д.).

Санитарно-показательная флора - это представители облигатной флоры кишечника и органов дыхания организма человека и животных. Они постоянно выделяются в процессе жизнедеятельности человека и животных с фекалиями или капельками слизи из воздушно-дыхательных путей. Они способны длительно сохраняться на объектах внешней среды при неспособности интенсивного размножения вне организма хозяина.

Таблица № 13.

Объект	Характер загрязнения	Санитарно-показательные микроорганизмы
Вода	фекальное	кишечная группа бактерий
Почва	промышленно-бытовые отходы	те же и клостридии
Пищевые продукты	фекальное, воздушно-капельное	кишечная группа бактерий, S.aureus
Предметы обихода	фекальное	кишечная гр. бактерий, S.faecalis, S.aureus
Воздух	воздушно-капельное	S.aureus, S. pyogenes.

 

О микробной обсемененности судят по общему количеству микробов в единице или площади (1 см³ воды, 1 г почвы и т.д.).

Санитарно-показательная флора - это представители облигатной флоры кишечника и органов дыхания организма человека и животных. Они постоянно выделяются в процессе жизнедеятельности человека и животных с фекалиями или капельками слизи из воздушно-дыхательных путей. Они способны длительно сохраняться на объектах внешней среды при неспособности интенсивного размножения вне организма хозяина.

Например, обнаружение E.coli на объектах внешней среды следует считать достоверным показателем фекальных загрязнений. Находки Closridium cвидетельствуют о возможно более давнем их фекальном загрязнении. Находки S.pyogenes могут cвидетельствовать о воздушно-капельном загрязнении, например, воздуха.

Микрофлора воды. Для отбора проб питьевой воды используют посуду или емкость, специально предназначенную одноразовую, приготовленную из материала не влияющего на жизнеспособность микробов. Посуда оснащена плотно закрывающимися пробкой и сверху защитным колпачком (фольга, плотная бумага).

Посуда открывается непосредственно перед отбором воды, удаляя пробку с колпачком. Ополаскивать посуду запрещено. Если отбор идет из крана, то его вначале обжигают, затем его полностью открывают и выпускают воду 10 мин. При отборе напор воды может быть уменьшен. Пробу воды отбирают непосредственно из крана.

При отборе воды при постоянном ее изливе через кран, обжигание не делают, а забор ведут с помощью силиконовых или резиновых шлангов. При наполнении емкость закрывают стерильной пробкой и колпачком. Доставляют воду в контейнерах-холодильниках при температуре 4-10⁰ С. Исследования проводятся не позднее 6 ч от забора воды.

1. Фильтрационый метод исследования воды. В верхнюю часть подготовленного фильтровального аппарата наливают точно отмеренное количество воды (водопроводная вода - 3 фильтра по 100 мл или 300 мл сразу на один фильтр). В нижней части этого прибора создают вакуум. После окончания фильтрования проб воронку снимают, фильтр осторожно приподнимают пинцетом за край и переносят не переворачивая на питательную среду Эндо в чашку Петри, избегая возникновения пузырьков воздуха между двумя поверхностями. На дне чашки делают надписи. Чашки ставят в термостат дном вверх и инкубируют при 37⁰ С в течение 24 ч.

Результат считается отрицательным, если на фильтрах не выросли колонии. Наличие типичного роста указывает на положительный результат и подсчитывают число колоний темно-красных, красных с металлическим блеском, с красным центром и отдельно розовых (лактозоотрицательные) колоний. Отбирают по 5 колоний каждого типа и пересевают на скошенный агар, инкубируя при 37⁰ С в течение 18 ч. Ставят с ними оксидазный тест. При положительном результате такие колонии не учитывают. Нетипичные лактозо (-) колонии пересевают с маннитом на 24 ч при 37⁰ С. Положительные по манниту культуры учитывают как общие колиформные бактерии.

Результат анализа следует выражать числом колониеобразующих единиц (КОЕ) общих колиформных бактерий, выросших на всех фильтрах и делят их на три.

Пример, при посеве 3 фильтров по 100 мл, выросло 2 колонии на 100 мл, а на остальных фильтрах роста не было. Число общих колиформных бактерий будет соответствовать 2: 3 = 0, 7 КОЕ в 100 мл. К общим колиформным бактериям относят Грам (-), не образующие спор палочки, не обладающие оксидазной активностью, ферментирующие лактозу или маннит с образованием кислоты и газа при 37⁰ С в течение 24-48 ч.

2. Титрационный метод. Метод выполняют при анализе воды с большим содержанием взвешенных частиц, в случае преобладания в воде посторонней микрофлоры, которая может препятствовать получению изолированных колоний на фильтре.

Метод основан на накоплении бактерий после их посева в определенном объеме воды в жидкую питательную среду с лактозой и идентификации колоний по их свойствам.

При исследовании питьевой воды засевают 3 объема по 100 мл (качественный анализ). При засеве 3-х объемов по 100 мл, 3-х объемов по 10 мл и 3-х объемов по 1 мл, выполняется количественный анализ. Каждый объем воды засевают в лактозо-пептонную среду. Посевы инкубируют при 37⁰ С в течение 18-24 ч. При наличие роста и газообразования в емкостях, производят высев на сектора среды Эндо петлей для получения изолированных колоний.

Посевы в емкостях без роста после 48 ч считают отрицательными. Посевы на среде Эндо инкубируют при 37⁰ С в течение 18-20 ч. Результаты указаны в таблице № 14.

Таблица № 14.

Расчет наиболее вероятного числа (НЧВ) бактерий в 100 мл питьевой воды

(приведена часть искомой таблицы)

Число положительных результатов в трех объемах воды	НВЧ бакте- рий в 100 мл	95 % доверительный интервал
0 0 1	0, 3	0 1, 4
0 0 2	0, 6	0, 1 2, 8
0 0 3	0, 9	0, 2 4, 2
0 1 0	0, 3	0, 1 1, 1
0 1 1	0, 6	1, 1 2, 8
0 1 2	0, 9	1, 2 4, 3
0 1 3	1, 2	0, 3 5, 7
0 2 0	0, 6	0, 1 2, 8
0 2 1	0, 9	0, 2 4, 3
0 2 2	1, 2	0, 3 5, 8
0 2 3	1, 5	0, 4 6, 3
0 3 0	0, 9	0, 2 4, 4
0 3 1	1, 3	0, 3 5, 9
0 3 2	1, 6	0, 3 7, 4
0 3 3	1, 9	0, 4 8, 9
1 0 0	0, 4	0, 1 1, 7

 

Дальнейшему исследованию подлежат сектора, где выросли лактозо (+) и (-) колонии. С выросшими культурами выполняют оксидазный тест.

При исследовании воды открытых водоемов засевают воду в объемах 1, 0 мл, 0, 1 мл, 0, 01 мл. Коли-титр воды измеряется минимальным количеством воды в мл, в котором могут быть обнаружены бактерии кишечной группы. Коли-индекс - количество бактерий кишечной группы, содержащихся в 1л воды.

Эти показатели определяют указанными методами.

Определение микрофлоры воздуха

Количественные методы определения микроорганизмов в воздухе основаны на методах седиментации (осаждении) и аспирации (фильтрование).

1. Аспирационный метод.

Это более точный метод. Посев микробов воздуха осуществляется с помощью приборов: аппарата Кротова, Дьякова, Речменского, Киктенко, ПАБ-1 и ПОВ1 и др.

Аппарат Кротова позволяет с заданной скоростью просасывать воздух через узкую щель плексиглазовой пластины, закрывающей чашку Петри с питательной средой. При этом, все бактериальные частицы, находящиеся в воздухе, равномерно фиксируются на поверхности среды, что достигается вращением чашки под входным отверстием. Просасывать следует определенное количество воздуха, после чего чашку инкубируют при 37⁰ С 18-20 ч.

После инкубации подсчитывают микробное число по формуле: х - (А ^. 1000 ): v, где А- количество выросших колоний, v- объем пропущенного воздуха в дм³, а 1000- искомый объем воздуха в дм³.

Микробное число операционных до работы не должно превышать 500, в родильных комнатах - 1000, в палатах для недоношенных детей - 750. Наличие S.aureus не допускается.

Для определения микробного числа применяют питательный агар, для обнаружения S. aureus - кровяной агар и желточно-молочно-солевой агар.

Определение микрофлоры почвы. Почву берут на глубине 10-15 см стерильным ножом, не менее 10 проб. Помещают их в стерильные банки. Из проб готовят навески в 30 г, вносят их в колбу с 270 мл воды и встряхивают. Из суспензии готовят разведения 10^-3, 10^-4, 10^-5. Из двух последних разведений берут по 0, 1 мл и смешивают с 40 мл 0, 7 % расплавленного и остуженного до 45⁰ С питательного агара и выливают в чашки Петри вторым слоем, которые уже содержали 2 % агар. Посевы инкубируют при 37⁰ С в течение 24 ч, подсчитывают число выросших колоний, определяя микробное число.

Определение коли-титра, перфрингенс-титра и титра термофилов почвы. Различные разведения почвенной суспензии засевают по 1 мл в пробирки со средой Кесслера и ставят в термостат при 37⁰ С в течение 48 ч. Для определения коли-титра поступают также как и при определении коли-титра воды.

Для определения перфрингенс-титра различные разведения почвенной суспензии по 1 мл засевают в пробирки со стерильным обезжиренным молоком. Посевы инкубируют при 43⁰ С в течение 24-48 ч и учитывают свертываемость молока. Из колоний делают мазки и окрашивают их по Граму, а далее микроскопируют. Затем определяют перфрингенс-титр по наибольшему разведению суспензии, дающей свертывание молока.

Для определения термофильных бактерий разведения почвенной суспензии вносят по 1 мл в чашки Петри, заливают расплавленным и охлажденным питательным агаром. Посевы инкубируют при 60⁰ С, подсчитывают число колоний, пересчитывают на 1 г почвы.

Определение микрофлоры пищевых продуктов. Вначале производят отбор пищевых и вкусовых продуктов, согласно ГОСТу 26668-85 (кроме молока). Визуально определяют внешний вид продуктов, подразделяя их на нормальные, подозрительные и испорченные по внешнему виду.

Пробы от продуктов отбирают асептическим способом в стерильную посуду с помощью стерильных инструментов, не менее 1 шт - от продукции в потребительской таре и до 1000 г (см3) - от продукции в транспортной таре.

Пробы от кусковой продукции берут ложкой, половником, пинцетом или другими инструментами. От кусковой продукции нетто более 1000 г отбирают (отрезают, вырезают) ножом (пилой и пр.):

n в нескольких местах режут ножом и с поверхности разреза и с глубины скальпелем берут необходимое количество кусков.

n срезают верхний слой продукта на 0, 5 -1 см и при помощи пробойника выдавливают слой продукта в широкогорлую посуду.

n от твердого продукта отбирают куски с помощью долота.

Отбор от жидкой или пастообразной продукции:

n из емкости более 1000 см3 отбирают пипеткой или половником.

n из емкости более 1000 см3 отбирают с разной глубины - 3 слоя в одну посуду.

n при отборе из крана, его обжигают, выпускают до 10 см3 жидкости и отбирают пробу.

 

Отбор сыпучих продуктов:

Отбирают после перемешивания половником.

Отобранные пробы пломбируют, опечатывают и транспортируют по правилам, которые установлены нормативно-технической документацией на каждый вид продукта.

Мясо и мясные продукты дважды пропускают через мясорубку, перемешивают, берут по 10 г, добавляют жидкость (ГОСТ Р 50454-92) до разбавления 1: 10, гомогенизируют. Берут стерильной пипеткой 1 см³ гомогената и вносят в пробирку, содержащую 9 см³ стерильной жидкости, перемешивают, набирают из пробирки 1 см³ смеси и переносят во 2-ю пробирку, содержащую 9 см³ стерильной жидкости (разведение в 10^-2) и повторяют процедуру до его разведения 10^-6.

Определение E.coli и колиформных бактерий. Переносят новой стерильной пипеткой 6 порций по 1 см³ гомогената (разделяя их на 2 трехкратные повторности) и в трехкратной повторности по 1 см³ каждого из пяти последующих разведений двух серий разведений вносят в пробирки, содержащие по 10 см³ селенитового бульона одинарной концентрации. Начинают посев с наибольшего разведения, постепенно переходя к наименьшему. Пробирки инкубируют при 30⁰ С в течение 48 ч. Отмечают пробирки с ростом бактерий.

Для расчета НВЧ (наиболее вероятного числа) бактерий выбирают три последовательно сделанных разведения:

n когда есть разведение, которое дает три положительные пробирки, то выбирают наибольшее разведение, дающее три положительные пробирки.

n три наибольшие разведения серии. Показатель НВЧ по трем пробиркам умножают на значение обратное разведению. Получается число бактерий колиформных на 1 г.

⇐ Предыдущая123456789Следующая ⇒

Поделиться: