Феномен потребления комплемента

Феномен составляют многочисленные реакции, объединенные одним принципом - лизис клеток с участием комплемента.

Прямой метод.

Реакции, основанные на лизисе клеток, достаточно многообразны и мы приводим одну.

РБЛ - реакция бактериального лизиса.

Метод не применяют.

Непрямой метод.

РНГем - реакция непрямого гемолиза.

Метод не применяют.

РСК - реакция связывания комплемента.

Для проведения реакции необходимо иметь:

1. Пробирки, штативы, пипетки, флаконы.

2. Растворитель - 0, 85 % раствор хлорида натрия.

3. Исследуемая сыворотка крови.

4. Комплемент.

5. Взвесь нативных эритроцитов барана.

6. Антиген известной специфичности.

Это сложная многокомпонентная, четырехэтапная, двухсистемная реакция. Клетками- мишенями являются нативные эритроциты индикаторной (гемолитической) системы.

1 этап. Определение рабочего разведения гемолитической сыворотки (таблица № 21).

В пробирках делают последовательные разведения гемолитической сыворотки в объеме 0, 5 мл. В эти же пробирки вносят 3 % взвесь отмытых нативных эритроцитов барана в

Таблица № 21.

Схема определения рабочего разведения гемолитической сыворотки

	Номера пробирок и количество ингредиентов, в мл
Ингредиенты
Гемсыворотка с 1: 100	0, 5	-	-	-	-	-	-
Растворитель	0, 5	0, 5	0, 5	0, 5	0, 5	0, 5	0, 5	0, 5
Получаемые разведения	1: 200	1: 400	1: 800	1: 1600	1: 3200	1: 6400	1: 12800
3 % взвесь эритроцитов	0, 5	0, 5	0, 5	0, 5	0, 5	0, 5	0, 5	0, 5
Результаты РНГА	++++	++++	++++	++++	+++	+	-	-
Рабочее разведение гемсыворотки	Титром гемсыворотки является 1: 1600, значит рабочим разведением является (1: 1600): 3=1: 533

 

объеме 0, 5 мл. Через 60 мин экспозиции учитывают результат РНГА.

Рассчитывают рабочее разведение сыворотки – это разведение гемолитической сыворотки, сконцентрированное в 3 раза от титра РНГА.

2 этап. Титрование комплемента.

Готовят ряд пробирок: в первую из них вносят 0, 05 мл комплемента в разведении 1: 10, во вторую - 0, 1 мл комплемента, в третью - 0, 15 мл, в четвертую - 0, 2 мл, в пятую - 0, 25 мл, в шестую - 0, 3 мл, в седьмую - 0, 35 мл, в восьмую - 0, 4 мл, в девятую- 0, 45 мл, в десятую - 0, 5 мл. Одиннадцатая пробирка контрольная, которая содержит 0, 5 мл растворителя.( таблица № 22).

Во все пробирки доливают растворитель до общего объема 0, 5 мл, а затем вносят во все пробирки по 1 мл индикаторной системы и оставляют на 30 мин при 37 ^о С. После этого, все пробирки просматривают и выбирают наибольшее разведение комплемента, вызывающее гемолиз - это титр комплемента.

Таблица № 22.

Схема титрования комплемента (количество пробирок сокращено)

Ингредиенты	Номера пробирок и количество ингредиентов, мл
Комплемент 1: 10	0, 05	0, 06	0, 07	0, 08	0, 09	0, 1	0, 14
Растворитель	0, 45	0, 48	0, 49	0, 4	0, 48	0, 5	0, 42	0, 5
Разведения	1: 100	1: 90	1: 80	1: 70	1: 60	1: 50	1: 40
Гемсистема	0, 5	0, 5	0, 5	0, 5	0, 5	0, 5	0, 5	0, 5
Экспозиция 45 мин при комнатной температуре
Результат	гемолиз	гемолиз	гемолиз	гемолиз	осадок	осадок	осадок	осадок
Рабочая доза комплемента	Титр комплемента составляет 1: 70, значит рабочая доза комплемента: (1: 70х30): 100= 1: 21

В реакцию берут разведение комплемента на 30 % выше, чем его титр, это рабочая доза комплемента.

3 этап. Приготовление индикаторной системы. К 3 % взвеси нативных эритроцитов барана добавляют равный объем гемолитической сыворотки в рабочем разведении. Смесь выдерживают 30 мин при 37^о С и осадок эритроцитов трижды отмывают растворителем при осаждении или центрифугировании при 500 об\мин в течение 10 мин. Осадок эритроцитов ресуспендируют до 3 % взвеси.

Постановка РСК. Титруют исследуемую сыворотку крови в пробирках от 1: 50 до 1: 12800 и делают контроли: на сыворотки (исследуемую, положительную и отрицательную), антиген, комплемент. Во все разведения сыворотки, кроме контроля сыворотки, вносят по 0, 5 мл антигена. В контроль сыворотки, комплемента и антигена вносят по 0, 5 мл растворителя. (таблица № 23).

Смесь встряхивают и во все пробирки добавляют по 0, 05 мл комплемента в рабочей дозе. Смесь оставляют на 60 мин при 37^о С

После экспозиции в каждую пробирку вносят по 1, 0 мл индикаторной системы. Смесь встряхивают и выдерживают 60 мин при 37^о С.

. При наличии в сыворотке гомологичных антител, комплемент расходуется на комплекс антиген-антитело первой системы. Это проявляется отсутствием лизиса индикаторных эритроцитов. При отсутствии антител в сыворотке комплемент не расходуется и тогда взаимодействует со второй системой (индикаторной). При этом эритроциты лизируются в первых пробирках.

Реакция связывания комплемента позволяет определять антитела, микробы, вирусы, растворимые антигены, однако он трудоемок и вытеснен при некоторых инфекциях другими методами.

 

Таблица № 23.

Схема постановки РСК

Дополнительные сведения Ингредиенты	Номера пробирок и количество ингредиентов, в мл
Разведения исследуемой сыворотки	Контроли
сыворот- ка (+)	сыворот- ка (_ )	компле- мент	исслед. сывор.	антиген
Растворитель	0, 5	0, 5	0, 5			0, 5	0, 5	0, 5
Исслед. сыворотка 1: 50	0, 5	-	-				0, 5
Разведения	1: 100	1: 200	1: 400				1: 100
Антиген	0, 5	0, 5	0, 5	0, 5	0, 5	0, 5	-	0, 5
Комплемент	0, 5	0, 5	0, 5	0, 5	0, 5	0, 5	0, 5	0, 5
Заведомо отриц. сыв.					0, 5
Заведомо полож. сыв.				0, 5
Экспозиция 60 мин при 37о с
Гемсистема	1, 0	1, 0	1, 0	1, 0	1, 0	1, 0	1, 0	1, 0
Экспозиция 60 мин при 37о С
Результат РСК	осадок	осадок	осадок	осадок	гемолиз	гемолиз	гемолиз	гемолиз
Результат анализа	Исследуемая сыворотка содержит антитела, на что указывает осадок в первых пробирках с сывороткой и положительным контролем, при отрицательной реакции (гемолиз) в других контролях

 

Феномен иммунофлюоресценции

Объединяет большую группу методов и реакций, основанных на использовании свечения в люминисцентном микроскопе антител, меченых флюорохромом.

Непрямой метод.

РИФП - реакция иммобилизация прямая.

Для проведения реакции необходимо иметь:

1. Предметные стекла.

2. Иммунные сыворотки, меченые флюорохромом.

3. Антиглобулиновые сыворотки, меченые флюорохромом.

4. Исследуемый материал (микробы, культуры и пр.).

5. Растворитель - 0, 85 % раствор хлорида натрия.

На обезжиренное предметное стекло делают мазки исследуемого материала или мазки-отпечатки. Препараты подсушивают, фиксируют смесью Никифорова. На мазок наносят иммунную сыворотку, специфичную в отношении предполагаемого в материале микроба, меченую флюорохромом. Препарат ставят во влажную камеру на 30 мин при 37^о С, а затем промывают в растворителе и ополаскивают в дистиллированной воде 10 мин, сушат при 18-20^О С и исследуют в люминисцентном микроскопе с иммерсионной системой.

Если микробы в мазке есть, то вокруг них будут скопления зеленого специфического свечения, а фон может равномерно слабо светиться. Это меченые антитела окружили гомологичную клетку. Оценку интенсивности специфического свечения ведут по 4-кресной системе: ++++ или +++ яркая флюоресценция, ++ и + слабая флюоресценция клеток.

Непрямой метод.

РИФН - реакция иммунофлюоресценции непрямая.

На обезжиренное предметное стекло наносят мазки из исследуемого материала или делают отпечатки из культур клеток или органов. Препарат подсушивают, фиксируют и наносят на мазок иммунную сыворотку, гомологичную по специфичности определяемому микробу. Препарат помещают во влажную камеру на 30 мин при 37^о С, затем хорошо промывают растворителем для удаления свободных компонентов сыворотки, ополаскивают в воде дистиллированной 10 мин, сушат при комнатной температуре и вносят меченую сыворотку против иммуноглобулинов иммунной сыворотки.

Эта видовая антисыворотка предварительно метится флюорохромом или используют коммерческую меченую антисыворотку.

Препарат помещают во влажную камеру на 30 мин при 37^о С, затем хорошо отмывают растворителем и прополаскивают дистиллированной водой, сушат и просматривают в люминисцентном микроскопе.

Если в исследуемом препарате содержится микроб, то с ним взаимодействуют антитела иммунной сыворотки и остаются фиксированными на мазке. Меченая антисыворотка будет взаимодействовать с Fc-фрагментами антител иммунной сыворотки и ее антитела также будут фиксированы на мазке. Это проявится специфическим свечением вокруг микробов. Если микробов нет, то антитела не фиксируются, характерного свечения не будет (результат отрицательный). При этом необходимы контроли: незараженный материал, гетерогенная культура, гомологичные микробы (положительный контроль). С помощью этого метода можно определять антитела в сыворотке при известном микробе в мазке.

Торможение метода.

РИФТ - реакция иммунофлюоресценции торможение.

На обезжиренное предметное стекло наносят два мазка-отпечатка или делают мазки из исследуемого материала. Их подсушивают, фиксируют и добавляют к опытному мазку одновременно иммунную сыворотку, специфичную к предполагаемому микробу, и вторую – эту же иммунную сыворотку, только меченую флюорохромом. В контрольный мазок вносят иммунную сыворотку, меченую флюорохромом. Препарат выдерживают 30 мин во влажной камере при 37^о С, отмывают и прополаскивают дистиллированной водой, просушивают и просматривают под люминисцентным микроскопом с иммерсионной системой.

Если в материале был микроб, то произойдет конкуренция меченых и немеченых антител за связывание с ним. Результатом их конкуренции будет снижение интенсивности специфического свечения в опытном мазке по сравнению с контролем, где одна меченая сыворотка. Если антигена нет, то свечение будет отсутствовать в обоих мазках.

Феномен преципитации

Это взаимодействие растворимых антигенов и антител с образованием агрегатов, что проявляется помутнением среды (образованием преципитата).

Осадочный метод.

Это реакции преципитации в растворе электролита, с медленно осаждающимся осадком (преципитатом).

РКПА - реакция кольцепреципитации Асколи.

Иммунную сыворотку в небольших разведениях (1: 2-1: 10) наливают в коническую пробирку в количестве 3-5 мл. По стенке этой пробирки пастеровской пипеткой осторожно наслаивают на сыворотку равный объем растворимого антигена (экстракт микробов). Для разведения ингредиентов применяют 0, 85 % раствор хлорида натрия.

При наличии в материале антигена на месте встречи двух компонентов через несколько минут появляется помутнение - беловатое кольцо преципитата. Если антигена нет, то не будет и преципитата.

Эту реакцию широко применяют при определении сибиреязвенных бактерий на кожевенно-меховых изделиях. Кусочки кожи с мехом выстригают, измельчают, заливают растворителем 1: 10 и кипятят 30 мин. Экстракт используют в РКПА для определения термоустойчивого сибиреязвенного антигена.

Диффузионный метод.

Эта группа реакций преципитации ставится в агаровом геле, результат взаимодействия растворимых антигена и антител проявляется в виде беловатой полоски на границе их встречи в геле - преципитат.

РПГ - реакция преципитация в геле.

Реакцию ставят на чашках Петри, залитых пептонным агаровым слоем. Посередине помещают полоску фильтровальной бумаги, предварительно смоченной антитоксической сывороткой. После подсушивания, на расстоянии 1 см от края полоски делают посевы культур дифтерийного микроба бляшками до 1 см, с двух сторон полоски бумаги. Среди культур должен быть заведомо токсигенный штамм (положительный контроль) и штамм нетоксигенный (контроль отрицательный). Посевы помещают в термостат на 24 ч.

Если культуры были токсигенные, то между полоской бумаги и бляшкой культуры возникает белая линия преципитации, которая совпадает с линией преципитации положительного штамма. Если культуры не токсигенные, то линии преципитации не будет. Преципитат образуется благодаря диффузии антител и антигена в разные стороны в агаре. В месте их встречи появится белая полоска преципитации.

РПО - реакция преципитации по Оухтерлоне.

Еще одна разновидность преципитации в геле. В агаре на чашке Петри определенными пробойниками вырезают 4 небольшие лунки, расположенных в виде квадрата, на расстоянии 0, 5 см. В первую лунку вносят иммунную сыворотку. Во вторую лунку рядом - известный антиген (контроль положительный), гомологичный иммунной сыворотке, которая в 1 лунке. В третью лунку, напротив первой лунки, вносят нормальную сыворотку (отрицательный контроль). В 4 лунку, рядом с первой, но с другой стороны от нее по сравнению со второй лункой, вносят испытуемый на антиген экстракт. Чашка ставится во влажную камеру на сутки при 37^о С - при необходимости и более суток.

Если в испытуемом экстракте присутствует антиген, то полоски преципитации в геле распределятся между 1 и 2 лунками (контроль), 1 и 4 лунками (опыт) под углом к третьей лунке (отрицательный контроль). Если антигена нет, то будет всего одна полоска между 1 и 2 лунками (положительный контроль).

РИЭФ - реакция иммуноэлектрофореза.

Представляет собой сочетание электрофоретического разделения компонентов с иммунопреципитацией.

На стеклянную пластину наносят слой агара толщиной в несколько мм. В застывшем агаре проделывают небольшую лунку и вносят в нее исследуемый экстракт на антиген. Включают слабый ток и антиген начинает ускоренно двигаться в сторону анода, что и является электрофорезом. Движение антигена продолжается несколько часов. Затем поперек движения антигена прорезают узкую канавку и заполняют ее антисывороткой к антигену, предполагаемому в материале. Антитела сыворотки диффундируют во все стороны, в том числе - навстречу антигену.

Если в экстракте есть антиген, то наблюдаются белого цвета дуги преципитации, где произошло взаимодействие антиген-антитело. Пластину можно отмыть, окрасить на белки и сравнить со стандартом. Таким образом, если использовать известный антиген, можно определять антитела, а при известной антиглобулиновой сыворотке определять классы ИГ.

РВИЭФ - реакция встречного иммуноэлектрофореза.

Используется принцип движения компонентов реакции в электрическом поле. На стеклянной пластине, залитой агаром, делают лунки на расстоянии 1 см. В одну из них вносят экстракт на антиген, в другую - антисыворотку. Подключают слабый электрический ток. Антиген движется к аноду, а антитела - к катоду, т.е. навстречу друг другу. При этом методе происходит быстрое их сближение и реагирование (за 60 мин).

Если в экстракте есть антиген, то при встрече с антителами будет их взаимодействие, что проявится линией преципитации белого цвета. Пластину можно отмыть и покрасить для более четкого просмотра линий. Если антигена нет, линий преципитации не обнаруживается. В реакции нельзя использовать антигены, имеющие кислую реакцию.

Феномен нейтрализации

Основан на взаимодействии антител с микробами или его факторами метаболизма.

Метод иммобилизации.

Группа реакций основана на обездвиживании подвижных микробов.

РИТ - реакция иммобилизации трепонем.

В одну пробирку вносят 0, 5 мл антисыворотки, предварительно прогретой при 56^о С в течение 15 мин, а во вторую пробирку- 0, 85 % раствор хлорида натрия. В обе пробирки добавляют по 0, 5 мл тканевой культуры хорошо подвижных трепонем. Пробирки слегка встряхивают и выдерживают 60 мин при 35^о С. Затем пастеровской пипеткой наносят на предметное стекло каплю из первой пробирки и из второй, раздельно. Накладывают покровные стекла и просматривают под микроскопом в темном поле. В первой пробирке будут наблюдаться обездвиженные трепонемы. Процент иммобилизации трепонем можно подсчитывать по формуле: (А-В): А, где А - количество подвижных трепонем в контроле, В - в опыте.

РИВ - реакция иммобилизации вибриона.

В две пробирки вносят по 0, 5 мл бульонной культуры хорошо подвижных холерных вибрионов для определения их специфичности. В одну пробирку вносят 0, 5 мл холерной антисыворотки, например, типа Огава в разведении 1: 5, во вторую 0, 85% раствор хлорида натрия. Пастеровскими пипетками наносят на предметное стекло две капли: из опытной и контрольной пробирок, покрывают покровными стеклами и просматривают в темнопольном микроскопе.

Если вибрион по специфичности соответствует сыворотке, то активность его движения заметно падает и через несколько минут прекращается. В это время в контрольной капле движение вибриона продолжается. Если антисыворотка была гетерологичной, то на движении вибрионов это не отразится.

Метод нейтрализации

Основан на нейтрализации вируса антисывороткой, что изменяет свойства вириона, например, по отношению к эритроцитам.

РТГА - реакция торможения гемагглютинации.

Реакция может быть направлена на определение антител к вирусу в сыворотках или на обнаружение вируса в материале.

Для реакции необходимо:

1. Эритроциты кур.

2. Гемагглютинирующий вирус.

3. Антисыворотка к вирусу.

4. Раствор Альсевера - растворитель.

5. Забуференный раствор 0, 85 % хлорида натрия

6. Пипетки, пластины типа Такачи, пробирки.

 

1. Определение антител в сыворотке.

В стерильный флакон (250 мл) вносят 50 мл раствора Альсевера. В стерильный шприц на 50 мл с иглой 7-9 см насасывают 15 мл раствора Альсевера из флакона и делают пункцию сердца взрослой курицы, набирая 15 мл крови в шприц. Иглу снимают, шприц покачивают, перемешивая жидкость. Затем кровь выливают во флакон. Эритроциты отмывают в растворе Альсевера и делают в этом же растворе 4 % взвесь.

Геммагглютинирующий вирус готовят из вирусной суспензии, получая взвесь цельного гемагглютинирующего вируса (ГВ).

Первым подготовительным этапом является определение титра ГВ, путем титрования вируса. В микротитраторах типа Такачи в двух паралллельных рядах делают разведения вируса от 1: 5 до 1: 2560. Для этого, капельницей вносят растворитель рН 7, 2 по 0, 05 мл (две капли) во все лунки, начиная со второй. В первую лунку вносят гемагглютинирующий вирус (ГВ) в разведении 1: 5 в объеме 0, 1 мл. С помощью микротитровальных петель объемом на 0, 05 мл или дозатора делают разведения, как обычно. Затем в каждую лунку вносят по капле 0, 5 % взвеси эритроцитов курицы. Пластины легко встряхивают и оставляют на 30 мин для оседания эритроцитов.

За титр ГВ принимают последнее его разведение, где отмечена полная гемагглютинация. Для РТГА используют 4 гемагглютинирующих единицы. Для этого разведение ГВ, дающее титр реакции, следует сконцентрировать в 8 раз (разделить на 8). После этого необходимо сделать контроль правильности выбора 4 полученных единиц. Для этого делают несколько последовательных разведений, начиная с 4 ГЕ (в первой лунке), далее 2 ГЕ (вторая лунка), 1 ГЕ в третьей лунке и 0, 5 ГЕ в четвертой лунке. Во все лунки вносят эритроциты. Если ГЕ выбраны правильно, то реакция вирусной гемагглютинации будет наблюдаться в первых трех лунках.

Постановка опыта. Микрокапельницей вносят со 2 по 10 лунку микропланшета по 0, 025 мл растворителя (опытный ряд) и со 2 по 5 лунку второго ряда контрольного. Затем в первые лунки двух рядов добавляют по 0, 05 мл исследуемой сыворотки в разведении 1: 5.

С помощью петель с головками на 0, 025 мл или дозаторов титруют сыворотку как обычно. Затем во все лунки первого ряда вносят по 1 капле суспензии ГВ, содержащей 4 ГЕ, а в контрольный ряд - по 0, 025 мл растворителя.

Пластины оставляют на 30 мин при комнатной температуре. После этого, во все лунки двух рядов закапывают по 1 капле 0, 5 % взвеси эритроцитов курицы и пластины вновь оставляют на 60 мин. Начинают учет с контрольного ряда, где эритроциты оседают в виде маленького колечка или пуговочки. Если в сыворотке присутствуют антитела, гомологичные ГВ, то в первых лунках первого ряда будет нейтрализация вируса антителами.

Это должно проявиться отсутствием гемагглютинации в первых лунках. В последующих лунках первого ряда сыворотка теряет концентрацию (учитывая последовательные ее разведения) и не может нейтрализовать весь вирус, поэтому в этих лунках будет наблюдаться положительная реакция гемагглютинации - в виде зонтика. Если антител не было, то во всех лунках будет гемагглютинация.

2. Обнаружение вируса.

Вируссодержащий материал вносят в 1-е лунки двух рядов микропланшета по 0, 025 мл. Во все остальные лунки этих рядов, включая и первые лунки, добавляют по 0, 025 мл 0, 85 % раствора хлорида натрия. Делают раститровку вируса, как описано выше. Далее во все лунки первого ряда вносят по 0, 025 мл известной иммунной сыворотки против предполагаемого вируса, в разведении 1: 20. Во второй ряд (контроль) вносят по 0, 025 мл растворителя. Смесь оставляют на 30 мин при 37^о С, затем во все лунки двух рядов добавляют по 0, 025 мл 1 % взвеси эритроцитов курицы. Учет реакции ведут через 60 мин экспозиции при 37^о С.

В контрольном ряду вирусная гемагглютинация будет наблюдаться, например, до 8-ой лунки. В опыте могут быть два варианта. Если гемагглютинирующий вирус не соответствует по специфичности сыворотке, то в этом случае титр гемагглютинации в первом ряду лунок будет соответствовать второму ряду. Если вирус гомологичен известной иммунной сыворотке, то произойдет из взаимодействие, следовательно, взаимная нейтрализация, Поскольку ГВ в этих лунках не будет, это проявится укорочением числа лунок с реакцией гемагглютинации в первом ряду, по сравнению с лунками второго ряда. Например, в 1 ряду гемагглютинация составит 5 лунок.

Реакция применяется в вирусологических исследованиях для поиска антител или вируса в соответствующем материале.

Метод гашения действия.

Метод основан на нейтрализации вируса и его болезнетворного действия.

РН - реакция нейтрализации.

Для проведения метода требуются

1. Вирус с выраженной инфекционной активностью.

2. Антисыворотка известная или исследуемая.

3. Биологический объект (лабораторное животное, культуры тканей, эмбрионы).

4. Растворители (физиологический раствор при работе с животными, среда 199, Игла, Эрла - для работы с культурой клеток).

 

Вируссодержащий материал (ВСМ) предварительно титруют, определяя конечное разведение, которое может вызвать повреждение тканей или инфицирование животных или эмбрионов.

Готовят 10-кратные разведения ВСМ в пробирках, используя для каждого разведения отдельную пипетку. Для этого, в пробирки вносят 1 мл растворителя и в первую пробирку 0, 1 мл ВСМ. Из первой пробирки переносят во вторую 0, 1 мл вируссодержащей жидкости, перемешивают, переносят 0, 1 мл в третью и т.д. Каждое разведение вируса из пробирки вносят в несколько лунок, содержащих пласт клеток, по 0, 2 мл. Наблюдают за культурой клеток 2-3 суток. Титр вируса выражают в 50 % дозе - ТКИД50, это гибель 50 % клеток.

Постановка опыта. В пробирках делают последовательные разведения испытуемых сывороток в объеме 0, 5 мл. Во все лунки вносят по 100 ТКИД ВСМ, выдерживают смесь 1-2 ч при комнатной температуре, затем каждое разведение вносят в пласт клеток в лунках. Если вирус был нейтрализован антителами, то размножения в культуре не последует - это проявится отсутствием ЦПД (цитопатического действия). Там, где вирус оставался нативным, отмечено ЦПД.

Вариант с животными. Например, проводят выявление антител в сыворотках людей с подозрением на бешенство. К 10-кратным разведениям ВСМ в пробирках добавляют равный объем исследуемой сыворотки в разведении 1: 10. Параллельно делают контрольный ряд (нормальная сыворотка). Пробирки оставляют на 1 ч при 37^о С. Смесь вводят в мозг молодым взрослым белым мышам и наблюдают 30 суток. Мыши, зараженные смесью вируса с антителами, не болевают, а зараженные смесью вируса с нормальной сывороткой погибают от энцефалита.

Цветная проба. Антисыворотки смешивают с вирусом по 0, 4 мл (ТКИД50). Через 2 ч вносят 0, 2 мл смеси в лунку с культурой клеток и наслаивают сверху вазелин 0, 2 мл для изоляции от кислорода воздуха. На протяжении 6-8 дней регистрируют изменение цвета среды. В лунках, где был внесен нейтрализованный вирус, цвет среды изменится от красного к желтому. Там, где вирус был живым, клетки погибли, а цвет среды оставался красным.

Феномен иммуноконъюгации

Основан на конъюгации метки разной природы на одном из компонентов реакции антиген-антитело или на дополнительном агенте.

РИА - радиоиммунологический анализ.

Прямой метод.

В лунки двух рядов полистироловых планшет вносят исследуемый на антиген экстракт, в концентрации 0, 05 мкг, выдерживают 12 ч при комнатной температуре, отмывают планшет физиологическим раствором, содержащим 5 % по объему фосфатного буфера и 2 % твина-20. В качестве конъюгата используют иммунный глобулин, который соответствует по специфичности предполагаемому антигену, меченный J ¹²⁵.

Вносят конъюгат во все лунки двух рядов. Выдерживают 60 мин при 37^о С, трижды отмывают растворителем и определяют дозаторами остаточную долю связавшейся метки, против той, которая была на конъюгате.

Непрямой метод.

Полистироловые планшеты, применяемые для ИФА, нагружают антигеном в рабочей дозе (предварительно выбирается доза, связывающая 50 % метки). Для этого, растворимый антиген (вируссодержащую жидкость) заливают в лунки микротитратора пипетками по 0, 1 мл и оставляют на ночь при комнатной температуре. На другой день лунки с антигеном трижды отмывают растворителем для удаления свободного антигена.

В лунки с сорбированным антигеном вносят по 0, 1 мл разведения испытуемой на антитела сыворотки. Разведения сыворотки предварительно готовят в пробирках и по 0, 1 мл вносят в лунки планшета, начиная с последней пробирки (вносят в последнюю лунку) и т.д. Планшету оставляют на 40 мин при 37^о С, трижды отмывают растворителем для удаления свободных компонентов сыворотки.

Предварительно готовят конъюгат. Из антисыворотки кроличьей против сывороточных белков человека получают глобулин, путем высаливания 40 % сульфатом аммония. От соли глобулин очищают одним из методов, например, пропуская через сефадекс G50. Затем этот глобулин добавляют к смеси J ¹²⁵ и хлорамина Т в равных объемах, через 2 мин реакцию останавливают с помощью NaHSO₃ и проводят разделение меченого глобулина и свободных компонентов на сефадексе-G25. Меченый глобулин консервируют 0, 2 % азида натрия.

Заранее приготовленный конъюгат вносят во все лунки планшет по 0, 1 мл, выдерживают в течение 40 мин при 37^о С, а затем трижды отмывают лунки растворителем. Далее в лунках плпншет следует проводить определение доли связанного йода по сравнению с количеством его в конъюгате.

Торможение метода.

В лунки полистироловых планшет вносят антиген в рабочей дозе, выдерживают 12 ч при комнатной температуре, отмывают трижды растворителем.

В лунки с антигеном вносят по 0, 1 мл исследуемой сыворотки, разведения которой предварительно приготовлены в пробирках (как описано выше). Планшеты выдерживают 40 мин при 37^о С, отмывают растворителем. Затем во все лунки добавляют по 0, 1 мл иммунного глобулина, меченого J ¹²⁵, специфичного к сорбированному антигену. Планшет выдерживают 40 мин при 37^о С, отмывают трижды растворителем. Определяют остаточную дозу метки в лунках, по сравнению с конъюгатом.

Если в исследуемой сыворотке были антитела, то они блокировали антиген в лунках и последующее внесение меченого иммунного глобулина не приводит к связыванию его с антигеном. Это проявляется отсутствием метки в лунках, где были антитела исследуемой сыворотки. Если антител нет, то внесение меченых антител приведет к связыванию их антигеном, что проявится появлением метки во всех лунках. Это отрицательный результат.

⇐ Предыдущая123456789Следующая ⇒

Поделиться: