|
Архитектура Аудит Военная наука Иностранные языки Медицина Металлургия Метрология Образование Политология Производство Психология Стандартизация Технологии |
|
|
Архитектура Аудит Военная наука Иностранные языки Медицина Металлургия Метрология Образование Политология Производство Психология Стандартизация Технологии |
Разновидности иммунологических реакций
В данном разделе мы не в состоянии показать весь массив иммунодиагностических реакций, которых на сегодня более 200. Приводим выборочно реакции, в соответствии с систематикой (по одной или нескольким реакциям, практически по всем группам всех феноменов). Феномен агглютинации Прямой метод. Это процесс взаимодействия гомологичных антител и клеток (тканей, микроорганизмов, эритроцитов, тромбоцитов и пр.) с последующим выпадением комплекса в осадок (агглютинат). Для постановки РА-реакции агглютинации необходимо: 1. Растворитель- 0, 85 % раствор хлорида натрия. 2. Известную 2 % бактериальную взвесь. 3. Исследуемую сыворотку. 4. Предметные стекла, бактериологические петли, спиртовку. 5. Исследуемая культура. 6. Наборы агглютинирующих сывороток. Реакция агглютинации ставится в двух вариантах: в развернутом виде в пробирках и в виде ориентировочного метода – капельно на предметном стекле. 1. Развернутый вариант РА. В настоящее время реакция не применяется. 2. Капельный вариант РА. Применяют для быстрого определения антител в сыворотке крови путем постановки РА на предметном стекле при известном диагностикуме или типировании чистой культуры микробов при известной антисыворотке. Типирование культуры: на предметное стекло наносят каплю известной сыворотки в разведении 1: 10 (или по инструкции) и отдельно - каплю растворителя. В первую каплю вносят бактериальной петлей типируемую культуру микроба и распределяют ее по капле. Петлю прожигают на спиртовке и вновь набирают культуру, распределяя ее во второй капле. Петлю прожигают и ставят на место. Через несколько минут проводят учет результатов. Если типируемая культура гомологична по специфичности антителам в сыворотке, то будет наблюдаться агрегация, т.е. образование в капле хлопьев – это положительный результат. При определении антител, также делают две капли: одна из исследуемой сыворотки, а вторая – 0, 85 % раствор хлорида натрия. В обе капли вносят по 1 капле бактериального диагностикума (1 млрд взвесь). Через несколько минут будет проявление результатов ориентировочной РА. В случае присутствия в исследуемой сыворотке антител, которые гомологичны диагностикуму, будет наблюдаться хлопьеобразование (это положительный результат). При отрицательном результате (отсутствие антител в исследуемой сыворотке) обе капли остаются равномерно мутными. Непрямой метод. Ввиду значительного многообразия диагностикумов (латексных, эритроцитарных, Ко-, и др.), их необходимо классифицировать. Различия диагностикумов определяются природой иммунологически активного агента, нагруженного на нерастворимый носитель.
белковыенебелковые
Диагностикумы предназначены для выявления антигена и определения антител в различных выделениях человека, а также в биологических жидкостях с помощью простых и сложных иммунологических реакций. 1. РНГА - реакция непрямой гемагглютинации. Для постановки реакции необходимо иметь: 1. Диагностический препарат. 2. Растворитель - 0, 85 % раствор хлорида натрия, содержащий 2 % фосфатного буфера, рН 7, 2 и нормальную лошадиную сыворотку в объеме 0, 4 %. 3. Полистироловые панели, микропластины типа Такачи, градуированные пипетки, колбы, флаконы, пробирки, штативы. 4. Инактиватор для исследуемых сывороток. 5. Формалинизированные эритроциты барана, 50 % взвесь. Постановка РНГА. Это двухкомпонентная реакция, осуществляется в 2 вариантах: в полистироловых панелях (макровариант), в микропластинах типа Такачи (микровариант). 1. Макровариант. Постановка реакции осуществляется в 2 этапа. 1 этап. Готовят как обычно последовательные разведения сыворотки крови пациента в объеме 0, 5 мл в лунках полистиролового планшета. Для этого во все лунки одного ряда планшета вносят растворитель по 0, 5 мл, а в первую лунку 0, 5 мл исследуемой сыворотки в разведении 1: 50. Из первой лунки 0, 5 мл смеси переносят во вторую лунку, перемешивают и 0, 5 мл переносят в третью и т.д. Последнюю лунку оставляют контрольной (без сыворотки). Сыворотку можно переносить пипеткой или дозатором на 0, 5 мл. 2 этап. Антигенный эритроцитарный диагностикум (АЭД) добавляют во все лунки по 0, 5 мл 0, 5 % взвеси или по инструкции. Учет результатов через 1, 5- 2, 0 ч (см. таблицу № 17). 2. Микрометод. Готовят последовательные разведения исследуемой сыворотки в объеме 0, 05 мл в микропланшете типа Такачи, как указано раньше. Перенос 0, 05 мл по лункам осуществляется дозатором или смесителем с объемом головки на 0, 05 мл. Последняя лунка - контроль. Во все лунки вносят по одной капле (0, 025 мл) 0, 5 % диагностикума. Учет реакции гемагглютинации через 1, 5- 2, 0 ч. В первом и во втором случаях вместо исследуемой сыворотки можно титровать другой исследуемый материал - на антиген (копроэкстракт, мочу и пр.), а добавлять антительный эритроцитарный диагностикум (АТЭД). Таблица № 17. Схема постановки развернутого варианта РНГА
В первом и во втором случаях вместо исследуемой сыворотки можно титровать другой исследуемый материал - на антиген (копроэкстракт, мочу и пр.), а добавлять антительный эритроцитарный диагностикум (АТЭД). Результаты РНГА учитывают по следующей схеме: 1. Агглютинат на ++++. Эритроциты покрывают все дно лунки широким " зонтиком". 2. Агглютинат на +++. Эритроциты покрывают почти все дно лунки. 3. Агглютинат на ++. Осадок небольшой, в центре лунки. 4. Агглютината на дне нет или он в виде маленькокого колечка. Это отрицательный результат. Агглютинат в виде зонтика получается при положительном результате, когда антитела исследуемой сыворотки вступят в реакцию с антигенным диагностикумом. Если в сыворотке антител нет, то во всех лунках будет отрицательная реакция в виде маленького колечка. С помощью РНГА можно определять до 15 тыс клеток (чумный микроб), до 1 млн клеток (эшерихии, протей и пр.) и более микробных тел или от 0, 01 до 0, 0001 мкг в мл растворимого антигена. Недостаток метода: из всей массы активных антител или антигенов определяется только их часть, так называемые полноценные или агглютинирующие. РНГА разработали в 1945 г. Миддлебрук и Дюбо. Капельную постановку РНГА проводят в соответствии с описанной для РА, исключая типирование, диагностикум применяют не бактеральный, а АЭД. Реакция Ко-агглютинации (РКоА). Известна возможность поверхностного белка А золотистого стафилококка штамма Covan 1 соединяться с сайтом на Fc-фрагменте IgG человека, морской свинки и др. При этом Fab-фрагменты IgG с активным центром антител является свободным и доступным для взаимодействия с микробами, токсинами и пр. Таким образом, получают направленный антительный диагностикум, поскольку в остальных случаях приготовления диагностикумов антитела будут располагаться на носителе неупорядоченно. Суточную культуру штамма Covan 1 смывают с агара 0, 85 % раствором хлорида натрия и дважды отмывают путем центрифугирования при 3000 об. в мин в течение 15 мин, доводя взвесь бактерий до 10 %. Фиксируют и убивают клетки путем кипячения 1 мин. К объему 10 % взвеси стафилококка добавляют равный объем иммунной сыворотки в разведении 1: 20, специфичной к определяемому агенту в исследуемом материале (например, шигеллам зонне), истощенной (адсорбируемой) взвесью стафилококка сапрофита, с целью удаления антистафилококковых антител. Смесь инкубируют при комнатной температуре в течение 30 мин и дважды отмывают при центрифугировании. Осадок стафилококка следует ресуспендировать, а затем консервировать азидом натрия до 0, 1 %. Таким образом, был приготовлен антительный Ко-диагностикум. На предметное стекло наносят две капли: первая капля - этоиспытуемый на шигеллы зонне копроэкстракт, а вторая капля – 0, 85 % раствор хлорида натрия. В обе капли вносят по 1 капле приготовленного Ко-диагностикума. В течение 40-60 сек появляются хлопья (это положительная реакция в случае присутствия в материале шигелл зонне). В контроле будет равномерная муть. В случае отсутствия шигелл зонне (в нашем примере), то в опыте будет такая же равномерная мелкодисперсная муть, как и в контроле. Торможение метода. Это сложные двухэтапные, многокомпонентные реакции. РТГА - реакция торможения гемагглютинации. Эта реакция относится к торможению прямой группы реакций, применяется в основном в вирусологии и также относится к феномену нейтрализации, где она и будет описана. РТБА - реакция торможения бактериальной агглютинации. Реакция не применяется. РТНГА 1 - реакция торможения непрямой гемагглютинации 1. (Синонимы: РНАг - если диагностикум антительный, РНАт - если диагностикум антигенный). Метод выполняют в 4 этапа. 1 этап. Предварительно выбирают рабочую дозу антисыворотки, путем постановки обычной РНГА с АЭД. Определяют титр данной антисыворотки (максимальное разведение, дающее положительный результат с АЭД). В качестве рабочей дозы используют разведение, которое в 3-4 раза концентрированнее, чем титр РНГА. 2 этап. Готовят последовательные разведения исследуемого материала на антиген как обычно, в объеме 0, 25 мл в количестве 6 лунок в полистироловых панелях, оставляя шестую лунку контролем для диагностикума. В контрольный ряд вместо исследуемого материала вносят растворитель. 3 этап. Затем во все лунки двух рядов вносят антисыворотку к предполагаемому антигену в объеме 0, 25 мл в рабочей дозе. Смесь встряхивают и оставляют на 30 мин при комнатной температуре. 4 этап. После экспозиции во все лунки добавляют по одной капле 5 % взвеси антигенного эритроцитарного диагностикума, гомологичного по специфичности антисыворотке. Панель встряхивают и оставляют на 1, 5-2, 0 ч при комнатной температуре. В случае присутствия в материале антигена происходит нейтрализация в лунки антител известной антисыворотки, где антиген еще в значительной концентрации. В этих лунках будет отрицательной реакцией (таблицы 18 и 19). В последующих лунках будет превалировать антисыворотка, поскольку антиген уменьшается ввиду его разведений в лунках. Это должно проявиться положительной реакций (РНГА). При отсутствии антигена в материале все лунки будут положительными по РНГА. В последующих лунках будет превалировать антисыворотка, поскольку антиген уменьшается ввиду его разведений в лунках. Это должно проявиться положительной реакций (РНГА). При отсутствии антигена в материале все лунки будут положительными по РНГА.
Таблица № 18. Выбор рабочей дозы антисыворотки для РТНГА 1
Таблица № 19 Схема постановки РТНГА 1
РТНГА-2 (реакция торможения непрямой гемагглютинации). 1 этап. Готовят несколько идентичных рядов последовательных разведений известной антисыворотки в объеме 0, 25 мл в полистироловых панелях. Количество рядов соответствует количеству проб на антиген и еше один - контрольный ряд. 2 этап. Во все лунки первого ряда вносят по 0, 25 мл экстракта исследуемого материала на антиген, а во все лунки второго ряда - растворитель по 0, 25 мл. Панели с лунками осторожно встряхивают и оставляют на 30 мин при комнатной температуре. 3 этап. После этого во все лунки двух рядов вносят по одной капле 5 % взвеси АЭД, соответствующего по специфичности антисыворотке. Учет результатов проводят через 1, 5-2, 0 ч (таблица № 20). В случае присутствия антигена в материале он нейтрализует антисыворотку и титр РНГА в первом ряду будет короче на несколько лунок, чем в контрольном ряду. В случае отсутствия антигена в материале титр РНГА в первом и во втором рядах будет идентичным. Эти реакция (как и вся группа реакций метода) позволяет выявлять всю сумму антигена или антител, имеющих специфичность, в отличие от РНГА, где выявляются агенты, которые имеют только полноценные свойства. Таблица № 20. Постановка РТНГА-2
Эти реакция (как и вся группа реакций метода) позволяет выявлять всю сумму антигена или антител, имеющих специфичность, в отличие от РНГА, где выявляются агенты, которые имеют только полноценные свойства. При использовании антительного диагностикума возможно выявление антигена в РНГА и антител в сыворотке с помощью РТНГА. При использовании антигенного диагностикума возможно определять антитела в сыворотке при помощи РНГА и антигена в материале при помощи РТНГА. Это должно расширять ценность диагностикумов и выявляемость инфекционных больных. Сорбционный метод. Составляют сложные многокомпонентные двухэтапные реакции. РОГ - реакция определения гаптена. 1 этап. Готовят последовательные разведения (лучше в пробирках) исследуемого материала на антиген в объеме 0, 5 мл на растворителе. 2 этап. Во все разведения вносят по 0, 025 мл 0, 5 % взвеси АТЭД. Смесь выдерживают 1, 5-2, 0 ч и учитывают результат. После учета реакции отбирают пробирки с отрицательной РНГА, отмывают антительный диагностикум в этих пробирках путем центрифугирования при 3000 об\ мин в течение 5 мин. 3 этап. К осадкам добавляют 0, 5 мл иммунной сыворотки в рабочей дозе, по специфичности идентичной АТЭД. Результат учитывают через 1, 5 - 2, 0 ч. В случае присутствия в материале неполноценного антигена, он будет реагировать с антительным диагностикумом, но не агглютинировать его. Внесение иммунной сыворотки резко изменит картину: взаимодействуя с неполноценным антигеном, сорбированном на диагностикуме, антитела добавленной иммунной сыворотки будут агглютинировать этот комплекс и будет получен положительный результат РНГА. Если неполноценного антигена (неагглютинирующего) в материале нет, то дополнительное введение иммунной сыворотки не приведет к агглютинации антительного диагностикума, т.е. РНГА будет отрицательной. Метод разработан Ю.В. Канатовым (1984 г.) и имеет определенное значение при поиске чумного гаптена (неполноценного антигена) в заброшенных гнездах. В отличие от РНГА (выявляет полноценный антиген) и РТНГА (выявляет всю сумму антигена: полноценного и неполноценного), РОГ определяет только неполноценный антиген. Как видно, реакции не дублируют друг друга, но дополняют и расширяют диагностическую ценность методов и эритроцитарных диагностикумов. |
Последнее изменение этой страницы: 2017-03-17; Просмотров: 478; Нарушение авторского права страницы
Диагностикумы
иммуноглобулиновыеантительные антигенные