Хемиосмотический механизм сопряжения дыхания и фосфорилирования

Одним из наиболее сложных и интригующих в биологии, является вопрос о том, каким образом электрохимическая энергия переноса электронов трансформируется в энергию макроэргической связи молекул АТФ. В различных странах над решением этой задачи работали десятки лабораторий и к настоящему времени она, в целом, решена, хотя многие детали остаются не выясненными и требуют дальнейших исследований. Однако еще чуть более двух десятков лет тому назад в биоэнергетике существовало несколько взаимоисключающих подходов к решению проблемы сопряжения дыхания (переноса электронов на кислород) и фосфорилирования.

Длительное время исследователи, работающие этой области, пытались решить ее в рамках так называемой химической концепции энергетического сопряжения. Впервые она была сформулирована в 1946 г. Липманом, который предложил следующую схему окислительного фосфорилирования:

Ав + Фн ® Ав-Ф

Ав─ Ф + Во ® Ао≈ Ф +Вв

Ао≈ Ф +АДФ ® Ао + АТФ

В ходе этих реакций якобы образутся некий высокоэнергетический промежуточный продукт Ао≈ Ф, который расщепляется и отдает содержащуюся в нем энергию на образование АТФ (аналогично образуется АТФ в гликолизе или ГТФ в ЦТК). Однако, за прошедшее время были досконально исследованы состав, химическая структура и свойства дыхательных переносчиков, но ни кто не обнаружил их фосфорилированных форм. Однако, выяснилось, что разрушение внутренней мембраны митохондрий приводит к потере способности аккумулировать энергию, освобождаемую при переносе электронов по дыхательной цепи. Более того, установлено, что даже небольшое увеличение ионной проницаемости мембраны сопровождается утечкой энергии, рассеивающейся в виде тепла.

Попытки доказать, что целостность митохондриальной мембраны необходима для осуществления химического сопряжения, к успеху не привели и, постепенно, биоэнергетики пришли к выводу, что с позиции химической концепции проблему энергетического сопряжения в дыхательной цепи митохондрий решить невозможно. Первым это понял английский ученый Питер Митчелл. В 1961 году он предложил, а затем экспериментально доказал гипотезу, ставшую в последствии одним из крупнейших открытий сделанных в биологии.

Он братил внимание, что 2 реакции окислительного фосфорилирования должны замедлять друг друга, а для их протекания необходимо убирать воду, т.е. выполнять осмотическую работу.

 

AДФ-OH + HO-Ф ®АТФ + Н₂О

2Н₂ + О₂ ®2Н₂О

 

В соответствии с дальнейшим развитием гипотезы Митчелла, энергия, выделяющаяся при прохождении электронов от одного переносчика к следующему используется на перекачивание протонов (Н⁺) из матрикса через внутреннюю мембрану в межмембранное пространство (См. рис.), т.е. вода удаляется путем разделения ее на протоны и гидроксильные ионы по разные стороны мембраны. Гипотеза Митчелла основана на том факте, что некоторые компоненты электронтранспортной цепи переносят восстановительные эквиваленты в виде Н (убихинон, FMN в первом комплексе), а другие (железо-серные центры) – в виде электронов. Он предположил, что водород и электронпереносящие белки чередуются, образуя 3 петли. В каждой петле 2Н выносятся из матрикса митохондрий наружу, отдавая 2 протона в окружающую среду, а электроны затем возвращаются внутрь. В результате по обе стороны внутренней мембраны создаются, во-первых, разность концентраций протонов или химический градиент (потенциал) и, во-вторых, возникает асимметрия в распределении электрических зарядов: избыток положительных в межмембранном пространстве и избыток отрицательных в матриксе, т.е. электрический градиент.

 

 

 

По мере возрастания суммарного электрохимического градиента, для " закачивания" протонов в межмембранное пространство интактной митохондрии требуется все больше энергии. И в момент, когда величины энергии необходимой для перекачивания протонов и выделяющейся при переносе электронов в дыхательной цепи сравниваются, установится динамическое равновесие, при котором перекачивание протонов и суммарный переноса электронов от NADH на кислород прекратятся.

В реальных митохондриях, такое состояние практически не достигается, так как электрохимический протонный градиент постоянно уменьшается за счет утечки протонов обратно в матрикс, " вниз" по этому градиенту. Поскольку внутренняя мембрана непроницаема для ионов, это движение осуществляется через специальные мембранные каналы, перекрытые ферментом АТФ-синтетазой. И, подобно потоку воды, протекающему через турбину генератора и заставляющего эту турбину вращаться, поток протонов заставляет АТФ-синтетазу образовывать АТФ из АДФ и неорганического фосфата. Понятно, что любое нарушение целостности внутренней мембраны митохондрий дающее протонам возможность беспрепятственно проходить через нее, минуя мембранные каналы, будет иметь следствием разобщение дыхания и фосфорилирования.

Предложенный П. Митчеллом механизм получил название хемиосмотического сопряжения, поскольку процесс утилизации химической энергии (" хеми" ) вместо образования промежуточных высокоэнергетических соединений, фосфорилирующих АДФ (как это происходит при гликолизе или ЦТК) включает стадию преобразования химической энергии в осмотическую. Идея хемиосмотического сопряжения была настолько необычна, что лишь через несколько лет в результате накопления экспериментальных данных получила всеобщее признание, а ее автор был удостоен Нобелевской премии.

Механизмы перекачивания протонов компонентами дыхательной цепи еще не вполне ясны. Считается, что каждый комплекс действует как энергопреобразующее устройство, направляя энергию выделяющуюся при прохождении электронов на перемещение протонов через мембрану. Такое преобразование энергии можно прямо продемонстрировать, включив по отдельности любой изолированный комплекс в липосому - пузырек ограниченный искусственной, фосфолипидной мембранной. В присутствии подходящего донора и акцептора электронов такой комплекс будет переносить электроны, а это приведут к перекачиванию протонов через мембрану липосомы.

Ключевым элементом в механизме использования протонного градиента для фосфорилирования АДФ является фермент - АТФ-синтетаза. В интактных митохондриях дыхательная цепь и АТФ-синтетаза относительно недоступны для экспериментального исследования. Однако путем обработки митохондрий ультразвуком можно получить функционально активные субмитохондриальные частицы (СЧ) - обрывки крист, замкнувшиеся в маленькие пузырьки около 100 нм в диаметре.

		СЧ

 

 

На фотографиях таких частиц, сделанных с помощью электронного микроскопа, видно, что их наружная поверхность усеяна крошечными " ножками". В интактных митохондриях, напротив, эти грибовидные структуры локализованы на внутренней обращенной в матрикс стороне внутренней мембраны. Таким образом, субмитохондриальные частицы представляют собой как бы вывернутые на изнанку фрагменты внутренней мембраны: поверхности их, ранее обращенные в матрикс, обращены теперь к наружной среде. При добавлении к СЧ NADH, АДФ и неорганического фосфата эти частицы осуществляют перенос электронов с NADH на кислород, сопрягая это окисление с синтезом АТФ.

В 1960 гг. от поверхности СЧ удалось отделить и перевести в растворимую форму усеивающие мембранную поверхность крошечные грибовидные белковые структуры. Субмитохондриальные частицы без этих сферических структур были способны окислять NADH в присутствии кислорода, однако синтеза АТФ при этом не происходило. С другой стороны, выделенные структуры действовали как АТФ азы, т.е. гидролизовали АТФ до АДФ и неорганического фосфата. Когда сферические структуры (названные F1- АТФ азами) добавляли к лишенным их СЧ, те вновь становились способными сопрягать окисление и фосфорилирование. В последствии было показано, что F1- АТФ аза - это часть большого комплекса пронизывающего всю внутреннюю мембрану. Этот комплекс, получивший название АТФ -синтетазы (FоF1- АТФаза), имеет молекулярную массу 500 000 дальтон и составляет около 15% всего белка внутренней митохондриальной мембраны. Кроме F1- АТФазы которую называют фактор F1, АТФ-синтетаза включает фактор Fоили олигомицин чувствительный фактор, который представляет собой интегральный белок, имеющий внутреннюю пору или трансмембранный канал. Синтез АТФ происходит только тогда, когда протоны движутся через этот канал из межмембранного пространства в матрикс, по электрохимическому градиенту. Оба процесса жестко связаны. Протоны не способны " проскальзывать" без сопутствующего синтеза АТФ, а синтез АТФ происходит только при перемещении протонов через мембрану. В реальной митохондрии энергия, требуемая на фосфорилирование АДФ, будет тем больше чем выше концентрация АТФ и ниже концентрации АДФ и неорганического фосфата (т.е. чем больше величина коэффициента АТФ/АДФ). Протоны будут проходить через трансмембранный канал, а АТФ - синтетаза будет синтезировать АТФ до тех пор, пока величина коэффициента АТФ/АДФ не станет такой, что энергии требуемой на фосфорилирование одной молекулы АДФ нужно будет больше, чем ее выделяется при движении протона по электрохимическому градиенту. При таких условиях перенос протонов через трансмембранные каналы и синтез АТФ мог бы прекратится, однако в митохондриях живых клеток величина коэффициента АТФ/АДФ постоянно уменьшается в результате использования АТФ для совершения различных видов работы. Рассмотрим, что происходит в клетке при увеличении функциональной нагрузки и усилении использования АТФ. Снижение коэффициента АТФ/АДФ активирует процессы фосфорилирования. Чем выше скорость этой реакции, тем больше протонов перетекает в матрикс, снижая при этом электрохимический потенциал. Для того, чтобы восстановить электрохимический потенциал активируется транспорт электронов на кислород, т.е. усиливается дыхание. При снижении функциональной нагрузки коэффициент АТФ/АДФ напротив возрастает, а ток протонов и фосфорилирование АДФ тормозятся и, вследствие этого замедляются процессы дыхания. Благодаря наличию подобных молекулярных механизмов, получивших название дыхательного контроля, обеспечивается саморегуляция процесса окислительного фосфорилирования в клетке. Ключевую роль в дыхательном контроле играет коэффициент АТФ/АДФ.

Таким образом, трансформация энергии в митохондриях включает два равновесных процесса, а именно преобразование энергии окисления переносчиков водорода NADH в электрохимический градиент протонов, энергия которого в свою очередь используется для синтеза макроэргической связи в молекуле АТФ. Вследствие возвращения протонов в матрикс через канал АТФ-синтетазы в митохондриях интактных клеток постоянно происходит снижение крутизны протонного градиента, но в результате активации переноса электронов по дыхательной цепи протонный градиент сразу восстанавливаться (по принципу сообщающихся сосудов). Как уже говорилось, окисление NADH и перенос электронов будут, продолжается до тех пор, пока электрохимический потенциал не достигнет величины, при которой количество энергии требуемой на выкачивание из матрикса протонов и перенос их против электрохимического градиента в межмембранное пространство станет равным количеству энергии выделяющейся при электронном переносе.

Одним из экспериментальных доказательств существования хемоосмотического механизма сопряжения окисления и фосфорилирования является способность различных по своей химической структуре липофильных веществ, обладающих слабо выраженными кислотными свойствами разобщать дыхание и фосфорилирование. Эти соединения, получившие название разобщающие агенты или просто разобщители, функционируют как трансмембранные переносчики протонов (Н+-ионофоры) т.е. создают для них дополнительный путь (шунт) через внутреннюю митохондриальную мембрану в матрикс, минуя протонные каналы АТФ-синтетазы.

Механизм такого шунтирующего действия разобщителей следующий: липорастворимый анион разобщителя Р-движется от внутренней поверхности мембраны, заряженной отрицательно (внутренней мембраны митохондри) к внешней ее поверхности, заряженной положительно под действием электрического Поля. Накопление ионов разобщителя и наличие избытка протонов в межмембранном пространстве приведут к возрастанию концентрации протонированной формы, РН, которая находится в равновесии с анионом.

Р^- + Н⁺ ® РН

Далее образовавшийся таким образом электронейтральная молекула разобщителя направляется по градиенту концентрации к внутренней стороне мембраны, где резко снижена концентрация ионов водорода, и где, следовательно, молекула разобщителя будет диссоциировать на анион, выталкиваемый обратно на внешнюю сторону мембраны и протон, направляющийся в матрикс. В итоге один оборот молекулы разобщителя приводит к переносу через внутреннюю мембрану митохондрии одного протона.

Понятно, что синтез АТФ в этом случае не происходит, но элетрохимический градиент падает, и, следовательно, возрастает скорость транспорта электронов на кислород, т.е. дыхания. Вся выделяющаяся при этом энергия рассеивается в виде тепла. Это тепло не всегда бесполезно, поскольку затрачивается на поддержание температуры тела в экстремальных условиях. У некоторых млекопитающих, а также новорожденных детей имеется специальная так называемая бурая жировая ткань. Она богата жировыми клетками, содержащими большое количество митохондрий (отсюда необычный цвет ткани). Внутренняя мембрана митохондрий клеток такой ткани содержит особый транспортный белок, позволяющий протонам перемещаться в матрикс без активации АТФ-синтетазы. Поскольку в системе аэробного метаболизма (ЦТК-ОФ) утилизируются с образованием НАДН и ФАДН не только глюкоза и другие углеводы, но и жиры, митохондрии такой клетки с большой скоростью окисляют запасы жира, образуя много тепла и мало АТФ. Таким образом, природные разобщители превращают митохондрии бурой жировой ткани в генераторы тепла, или своего рода печки, разогревающие выходящего из зимней спячки животного. У новорожденного ребенка такие " печки" защищают наиболее чувствительные части тела от переохлаждения. Способность разобщителей ускорять процессы утилизации жиров пытались, и довольно успешно, использовать как средство против избыточного веса, но, к сожалению, такие препараты, в частности 2, 4-динитрофенол, обладают рядом побочных эффектов. Возможно появившиеся у нас в последнее время различные природные " сжигатели" жиров действуют аналогичным образом, но оказывают меньше побочных эффектов, свойственных синтетическим препаратам.

Общий энергетический баланс окисления глюкозы в аэробной клетке:

При расщеплении глюкозы в процессе гликолиза образуется две молекулы АТФ и две молекулы NADH, которые в случае функционирования клетки в условиях анаэробного метаболизма используются для образования из пировиноградной кислоты молочной, а при аэробном метаболизме NADH транспортируется в митохондрии, где из каждой такой молекулы образуется три молекулы АТФ. ПВК является субстратом ЦТК и дает в результате полного окисления 1 молекулу АТФ (ГТФ), 4 молекулы NADH или 12 молекул АТФ и 1 FADH, дающий в результате окислительного фосфорилирования 2 молекулы АТФ.

Общий баланс окисления глюкозы:

· Образование АТФ

гликолиз 2+2.3= 8

ЦТК+Окислительное фосфорилирование: 2.(1+14)=30

Всего: 8+30=38

· Изменение свободной энергии при окислении глюкозы до углекислого газа и воды: - 686 ккал/моль

· Изменение свободной энергии при синтезе молекулы АТФ из АДФ: 11-13ккал

· Общее изменение свободной энергии при синтезе 38 молекул АТФ.=+418(494) ккал

· КПД использования свободной энергии в интактной клетке: 418(494)/686.100% = 61% (72%)

·

КПД в стандартных условияхсоставляет 277, 4/686=40% (38х7, 3 ккал=277, 4 ккал)

Лекция 5.

⇐ Предыдущая3456789101112Следующая ⇒

Поделиться: