Приготовление посевного материала

Рис.2. Выращивание посевного материала1.пробирка с продуцентом на скошенном агаре

2. большое количество колб для выращивания молодой культуры (проверяют чистоту культуры под микроскопом. 3. инокулятор, мешалка 4. посевной аппарат (с контролем)

 

 

Культуру продуцента хранят

v в запаянных ампулах

v в жидком азоте

v на твердых носителях – пшено, ячмень, рис.

v в лиофилизированном состоянии – лучше хранятся споры, чем живые клетки

v в ампулах в лиофилизированном состоянии на носителе (пшено, желатин - альгинат натрия)

v в пробирке на скошенном агаре – срок хранения до нескольких месяцев.

Такое количество стадий нужно для получения чистой культуры.

Многоэтапное выращивание посевного материала – обязательный принцип биотехнологического производства.

Среда для выращивания посевного материала обычно не совпадает по составу с ферментационной средой, т.е. при выращивании посевного материала среда может быть обогащена для быстрого роста биомассы.

Культивирование

Стадия культивирования микроорганизмов является наиболее сложной и ответственной.

Технология микробиологического синтеза обязательно включает в себя в качестве основной стадию промышленного культивирования соответству-ющего микроорганизма-продуцента (ферментация). В условиях промышленного производства такое культивирование проводят по одному из следующих двух способов:

1. культивирование на твердых питательных средах или на поверхности тонкого слоя жидкой питательной среды ( поверхностный способ выра-щивания продуцента),

2. культивирование соответствующего продуцента в большом объеме жидкой фазы, содержащей все необходимые для нормального роста и развития микроорганизма питательные вещества ( глубинный способ выращивания продуцента).

 

 

Поверхностный метод выращивания продуцентов, предложенный И. Такамине еще в 1894 г., состоит в культивировании микроорга­низмов на поверхности увлажненных стерилизованных отрубей, размещенных в кюветах, к которым иногда добавляют солодовые ростки, древесные опилки, свекловичный жом. Инкубацию микроорганизмов ведут в специальном термостатируемом цехе при постепенном контроле в нем температуры, влажности и подачи воздуха.

В последние 15 лет для выращивания продуцентов ферментов; чаще используют более экономный — глубинный метод культивирования (рис. 3). В промышленных условиях для этих целей применяют ферментеры из нержавеющей стали, снабженные приспособлениями для перемешивания и подачи в жидкую питательную среду стерильного воздуха. Сначала ферментер заполняют питательной средой, автоклавируют, а затем засевают чистой культурой, подаваемой из специального генератора. Для предотвращения инфекции в ферментере поддерживают повышенное давления

 

 

Воздух Рис. 3. Принципиальная технологическая схема глубинного культивирования микроорганизмов (по А.А.Свитцову и др., 1986):

 

1 – смеситель питательной среды; 2 — стерилизатор в непрерывном режиме потока питательной среды; 3, 4 — теплообменники; 5 — посевные аппараты; б, 10, 12 — фильтры для очистки воздуха; 7 — ферментер; 8, 9 — насосы; 11 — компрессор

 

Промышленное культивирование и очистка целевого продукта – процессы много ступенчатые. Общая схема ферментации представлена на рисунке 4.

Микроорганизмы можно выращивать

Ø в ферментере периодического действия

Ø в ферментере периодического действия с добавлением субстрата

Ø в непрерывной культуре

 

Стадия ферментации является основной стадией в биотехнологическом процессе, так как в ее ходе происходит взаимодействие продуцента с субстратом и образование целевых продуктов. Эта стадия осуществляется в биохимическом реакторе (ферментаторе) и может быть организована различными способами в зависимости от особенностей используемого продуцента и требований к типу и качеству конечного продукта. Ферментация может происходить в строго асептических условиях или без соблюдения правил стерильности (так называемая «незащищенная» ферментация); на жидких и твердых средах, анаэробно и аэробно. Аэробная ферментация может протекать, в свою очередь, поверхностно или глубинно (во всей толще питательной среды). Культивирование биологических объектов может осуществляться в периодическом и проточном режимах, полунепрерывно с подпиткой субстратом.

В ходе периодической ферментации выращиваемая культура проходит ряд последовательных стадий: лаг-фазу, экспоненциальную, замедления роста, стационарную и отмирания (рис. 5). При этом происходят существенные изменения физиологического состояния биообъекта, а также ряда параметров среды. Целевые продукты образуются в экспоненциальной (первичные метаболиты – ферменты, аминокислоты, витамины, т. е. вещества, которые требуются для роста культуры клеток) и стационарной (вторичные метаболиты – антибиотики, алкалоиды, гормоны, токсины – низкомолекулярные вещества, не требующиеся для роста культуры, но необходимые для функционирования зрелой популяции, часто выполняющие защитную функцию) фазах, поэтому в зависимости от целей биотехнологического процесса в современных промышленных процессах применяют принцип дифференцированных режимов культивирования. В результате этого создаются условия для максимального производства того или иного целевого продукта.

Непрерывная ферментация биообъектов осуществляется в условиях установившегося режима, когда микробная популяция и ее продукты наиболее однородны, т. е. в стационарной фазе. Применение непрерывных процессов ферментации создает условия для эффективного регулирования и управления процессами биосинтеза. Системы непрерывной ферментации могут быть организованы по принципу полного вытеснения или полного смешения.

 

 

Рис. 5. Кривая роста микроорганизмов в ходе периодической ферментации: 1 – лаг-фаза; 2 – фаза экспоненциального роста; 3- фаза линейного роста; 4- фаза замедления роста; 5- стационарная фаза; 6- фаза отмирания

 

Первый пример – так называемая тубулярная культура: процесс ферментации осуществляется в длинной трубе, в которую с одного конца непрерывно поступают питательная среда и инокулят, а с другой – с той же скоростью вытекает культуральная жидкость и целевые продукты. Данная система проточной ферментации является гетерогенной и реализуется, как правило, без перемешивания. При непрерывной ферментации в ферментаторах полного смешения (гомогенно-проточный способ) во всей массе ферментационного аппарата создаются одинаковые условия. Применение таких систем ферментации позволяет эффективно управлять отдельными стадиями, а также всем биотехнологическим процессом и стабилизировать продуцент в практически любом требуемом экспериментатору или биотехнологу состоянии.

Обеспечение процесса ферментации с точки зрения инженерной реализации сводится к дозированному поступлению в ферментатор потоков (инокулята, воздуха или газовых смесей, питательных биогенных элементов, пеногасителей) и отвода из него тепла, отработанного воздуха, культуральной жидкости, а также к измерению и стабилизации основных параметров процесса на уровне, требуемом для оптимального развития продуцента и образования целевого продукта. В ходе ферментации образуются сложные смеси, содержащие клетки, внеклеточные метаболиты, остаточные концентрации исходного субстрата. При этом целевые продукты, как правило, находятся в этой смеси в небольших концентрациях, а многие из них легко разрушаются. Все это накладывает ограничения на методы выделения и сушки биологических препаратов.

Получение готовой продукции

Постферментационная стадия обеспечивает получение готовой товарной продукции и также обезвреживание отходов и побочных продуктов. Культуральная жидкость, образующаяся в процессе ферментации, представляет собой сложную многофазную систему: в водной фазе содержатся клетки продуцента, продукты их жизнедеятельности, непотребленные компоненты питательной среды, мельчайшие капельки жира и пузырьки воздуха. В свою очередь, водная фаза культуральной жидкости (нативный раствор) включает большое количество органических и неорганических веществ, коллоидных фракций белков, сухой остаток культуральной жидкости – до 17 % и более, содержание биомассы в культуральной жидкости достигает 8–10 %. Концентрация целевого продукта чаще всего не превышает 1, 5 %, что составляет менее 10 % сухого остатка.

В зависимости от целевого назначения конечного продукта (для здравоохранения, технических целей, сельского хозяйства и т. д.), локализации конечного продукта (клетка или культуральная жидкость) и его природы на постферментационной стадии применяют различную аппаратуру, методы выделения и очистки. Наиболее трудоемко выделение продукта, накапливающегося в клетках.

Первым этапом постферментационной стадии является фракционирование культуральной жидкости и отделение взвешенной фазы – биомассы. Наиболее распространенный метод для этих целей – сепарация, осуществляемая в специальных аппаратах – сепараторах, которые работают по различным схемам, в зависимости от свойств обрабатываемой культуральной жидкости. Основные проблемы возникают при необходимости выделения мелковзвешенных частиц размером 0, 5–1, 0 мкм и менее (бактериальные клетки) и переработки больших объемов жидкости (производство кормового белка). Для повышения эффективности процесса сепарации применяют предварительную специальную обработку культуры – изменение pH, нагревание, добавление химических агентов.

⇐ Предыдущая234567891011Следующая ⇒

Поделиться: