Основные приемы осуществления хроматографического процесса

Для хроматографического разделения смесей веществ используются различные технологические приемы, основанные на разных принципах взаимодействия компонентов разделяемой смеси с хроматографическими материалами (сорбентами). Наиболее часто используются:

– ионообменная хроматография (сорбент представляет собой твердый носитель, содержащий ионизируемые в водных растворах функциональные группы, с которыми связываются компоненты разделяемой смеси);

– адсорбционная хроматография (сорбент представляет собой твердый носитель, на котором происходит обратимая сорбция компонентов разделяемой смеси за счет дисперсионного взаимодействия их с поверхностью твердой фазы. Разделение осуществляется за счет различия в константах равновесия связывания компонентов смеси с поверхностью сорбента);

– хроматография на молекулярных ситах (гель-проникающая хроматография, гель-фильтрация); сорбент представляет собой гранулы геля, имеющий поры определенного размера, в которые могут проникать молекулы компонентов с размером ниже размера пор и не могут проникать молекулы с большим размеров пор. Разделение достигается за счет

разной скорости перемещения частиц с разными размерами молекул, при этом частицы большего размера движутся с большей скоростью.

Такой вид хроматографии широко применяется при фракционировании компонентов клеточных экстрактов, и во многих случаях коэффициент специфичности этой процедуры высок. Однако для направленного применения гель-фильтрации в биотехнологии опять-таки необходимо располагать дополнительной информацией о размерах частиц целевого продукта;

– афинная хроматография (сорбент представляет собой твердый носитель, к которому химически присоединены функциональные группы, избирательно связывающие какой-либо из компонентов разделяемой смеси (по принципу «замка–ключа»); остальные компоненты раствора не взаимодействуют с носителем, а свободно выходят из колонки.

Обычно к инертному носителю прикрепляют субстраты или ингибиторы ферментов. Например, для белка плазминогена субстратом является аминокислота лизин (рис. 6, а)– ее и закрепляют на твердом носителе.

Через колонку пропускают сыворотку крови, и только плазминоген на ней закрепляется, а все остальные белки свободно проходят по колонке. Затем плазминоген смывают с колонки, используя аминокапроновую кислоту (рис. 6, б), которая также является субстратом для плазминогена, но отличается более высоком сродством.

Рис. 6. Афинная хроматография

После завершения очистки биотехнологических продуктов производят их обезвоживание и стабилизацию. Это необходимо для увеличения их сроков годности.

На эти заключительные стадии продукт поступает в виде более или менее разбавленного раствора, так что приходится решать задачу концентрирования этого раствора, которое представляет собой удаление воды и низкомолекулярных компонентов. Наиболее простым методом является упаривание, однако оно не применимо в случае получения биологически активных соединений. Таким образом, обычное упаривание применяется лишь для достаточно стабильных продуктов (низкомолекулярных продуктов биосинтеза, таких как аминокислоты и антибиотики). Во многих случаях оказывается необходимым получить продукт в сухом виде. Для этого используются различные технологические приемы сушки. В зависимости от свойств продукта применяют различные методы высушивания. Сушка термостабильных препаратов осуществляется на подносах, ленточном конвейере, а также в кипящем слое. Особо чувствительные к нагреванию препараты высушивают в вакуум-сушильных шкафах (при пониженном давлении и температуре) и в распылительных сушилках. В этом случае раствор продукта подают в специальный аппарат через форсунку, которая обеспечивает распыление раствора на капли малого размера. В направлении, противоположной подаче раствора продукта, подается турбулентный поток горячего воздуха.

К стабилизации свойств биотехнологических продуктов ведет добавление в качестве наполнителей различных веществ. Для стабилизации кормового белка добавляют отруби, кукурузную муку, обладающие дополнительной питательной ценностью. Для стабилизации ферментных препаратов используют глицерин и углеводы (КМЦ), которые препятствуют денатурации ферментов, а также ионы кобальта, магния, натрия и др.

 

6. Аппаратурное оформление биотехнологического процесса

Вопросами технического обеспечения биотехнологических процессов занимается биоинженерия. Для различных процессов существует огромное разнообразие аппаратуры: собственно для процесса ферментации, а также для выделения и получения готового продукта. Наиболее сложна и специфична аппаратура для ферментационной стадии. Технически наиболее сложным процессом ферментации является аэробный глубинный стерильный непрерывный (или с подпиткой субстратом). Аппараты для поверхностной и анаэробной ферментации менее сложны и энергоемки.

В современной литературе описаны сотни биореакторов, отличающихся по конструкции, принципу работы и размерам (от нескольких литров до нескольких тысяч кубометров). Многочисленность методов культивирования, чрезвычайное многообразие используемых биологических агентов привели к огромному разнообразию конструктивных решений, которые зависят от ряда факторов: типа продуцента и среды, технологии и масштабов производства, целевого продукта и пр. Принципиальное отличие биотехнологических процессов от чисто химических заключается:

– в чувствительности биологических агентов к механическим воздействиям;

– наличии межфазового переноса веществ (по типу " жидкость–клетки", " газ – жидкость–клетки" );

– требовании условий асептики;

– низких скоростях протекания многих процессов в целом;

– нестабильности целевых продуктов;

– пенообразовании;

– сложности механизмов регуляции биосинтеза.

Рассмотрим некоторые типы ферментационных аппаратов.

Аппараты для анаэробных процессов применяются в процессах конверсии растительного сырья, в том числе растительных расходов, а также различных других отходов. При метановом брожении для получения биогаза, а также в ряде других процессов (получения ацетона, шампанских вин) используют ферментационные аппараты (метантенки). Эти аппараты имеют различную конструкцию (от простой выгребной ямы до сложных металлических дайджестеров или железобетонных сооружений) и объемы (от нескольких до сотен кубометров). Данные аппараты оборудованы системой подачи сырья, системой теплообменных труб для стабилизации температуры, несложным перемешивающим устройством для гомогенного распределения сырья и биомассы продуцента, газовым колпаком и устройством переменного объема (газгольдером) для сбора образуемого биогаза.

Аппараты для аэробной поверхностной ферментации широко применяются для производства органических кислот (жидкофазные) и ферментов (твердофазные). Поверхностная жидкофазная ферментация протекает в так называемых бродильных вентилируемых камерах, в которыхна стеллажах размещены плоские металлические кюветы. В кюветы наливают жидкую питательную среду, высота слоя составляет 80–150 мм, затем с потоком подаваемого воздуха среду инокулируют порами продуцента. В камере стабилизируется влажность, температура и скорость подачи воздуха. После завершения процесса культуральная жидкость сливается из кювет через вмонтированные в днища штуцеры и поступает на обработку. При твердофазной ферментации процесс также протекает в вентилируемых камерах, но вместо кювет на стеллажах размещают лотки, в которые насыпают сыпучую твердую среду слоем 10–15 мм. Для лучшей аэрации среды подаваемый в камеру воздух проходит через перфорированное днище лотков.

Аппараты для аэробной глубинной ферментации наиболее сложны как конструктивно, так и с точки зрения их эксплуатации. Главная задача, возникающая при их конструировании, – обеспечение высокой интенсивности массо- и энергообмена клеток со средой. Массообмен определяется транспортом (переносом) кислорода и других биогенных элементов из среды в микробную клетку и отводом из нее продуктов обмена.

Главным показателем массообменных характеристик ферментатора служит коэффициент массопередачи кислорода, так как кислород является основным лимитирующим фактором аэробных ферментационных процессов. Расход кислорода на образование 1 кг биомассы, в зависимости от типа углеродосодержащего сырья и степени его восстановленности, может составлять от 0, 75 до 5, 00 кг. Клетки способны утилизировать кислород только в растворенном виде, поэтому необходимо постоянно поддерживать его концентрацию в культуре на уровне, оптимальном для конкретного продуцента. При этом скорость поступления кислорода к клеткам должна превышать скорость его включения в клетки и в околоклеточном пространстве не должно возникать так называемых «концентрационных ям». Кроме этого, концентрации клеток и растворенного субстрата должны быть равномерными по всему объему ферментатора. Поэтому перемешивание является также одним из основных факторов, обеспечивающих требуемую гидродинамическую обстановку в аппарате. При интенсивном перемешивании пузырьки воздуха дробятся в аппарате и, диспергируясь, увеличивают площадь контакта фаз «среда – клетка». Однако очень сильное перемешивание может вызвать механическое повреждение биологических объектов.

К настоящему времени разработано и применяется огромное количество разнообразнейших перемешивающих и аэрирующих устройств, и классифицировать их практически невозможно. Наиболее удачна, по нашему мнению, попытка классификации ферментационных аппаратов для аэробной глубинной ферментации по подводу энергии

для перемешивания (Виестур и др., 1986). Согласно этой классификации аппараты такого типа делятся на три группы по подводу энергии: 1– к газовой фазе (ФГ), 2 – к жидкой фазе (ФЖ), 3 – комбинированный подвод (ФЖГ).

Ферментаторы с подводом энергии к газовой фазе (рис. 7). Их общий признак – подвод энергии в аппарат через газовую фазу, которая является ее носителем. Ферментаторы характеризуются достаточно простой конструкцией (отсутствуют трущиеся, движущиеся узлы), высокой эксплуатационной надежностью, но имеют не очень высокие массообменные характеристики (коэффициент массопередачи кислорода менее 4 кг/м3·ч). Данные аппараты представляют собой вертикальную емкость, снабженную газораспределительным устройством одного из известных типов.

Барботажный – газораспределительное устройство данного типа обычно устанавливается в нижней части аппарата; подаваемый сверху через распределительную трубу воздух, пройдя через барботер, насыщает кислородом толщу среды. Коэффициент массопереноса кислорода невысок, 1–2 кг/м3·ч.

Барботажно-колонный – в нижней части корпуса такого аппарата устанавливается перфорированная пластина с диаметром отверстий 0, 0005 м или сопловой эжектор с диаметром сопла 0, 004 м.

Барботажно-эрлифтный аппарат характеризуется наличием внутри одного или нескольких диффузоров («стаканов») или нескольких перегородок для принудительного разделения восходящих и нисходящих потоков циркулирующей жидкости; эти элементы расположены равномерно по сечению аппарата или концентрично.

Газлифтный колонный ферментатор состоит из двух колонн разного диаметра, соединенных между собой; одна представляет собой барботажную колонну с восходящим потоком воздуха, другая – циркуляционную с нисходящим потоком. Воздух вводится в нижнюю зону аппарата, в барботажную колонну; камера, соединяющая колонны в верхней части аппарата, образует большую поверхность контакта фаз.

Трубчатый аппарат сконструирован по типу теплообменных труб; взаимодействие газа в трубе при высоких скоростях продувки более интенсивное, чем в большом объеме, поэтому массообмен интенсивнее.

Аппарат с плавающей насадкой позволяет интенсифицировать массообмен за счет увеличения поверхности контакта фаз и турбулизации жидкости при работе с большими скоростями подачи газовой и жидкой фаз. В аппарат введены секционные элементы в виде решеток, оборудованных лопастной насадкой; в центре аппарата находится труба, через которую вводится воздух, а жидкая фаза поступает противотоком сверху. Газ, поступая в лопастную насадку, сделанную обычно из полиэтилена, вращает ее; это существенно увеличивает поверхность контакта газовой и жидкой фаз.

Ферментаторы с вводом энергии жидкой фазой (рис. 8) наиболее сложны по конструкции и энергоемки, но обеспечивают более высокие по сравнению с группой ферментаторов ФГ значения коэффициента массопередачи кислорода, свыше 6 кг/м3·ч. В данных аппаратах ввод энергии осуществляется жидкой фазой, обычно самовсасывающими мешалками или насосами; в последнем варианте жидкость вводится в аппарат через специальное устройство (сопло, эжектор, диспергатор). Данные аппараты также можно подразделить на ряд типов.

Ферментаторы с самовсасывающими мешалками не требуют специальных воздуходувных машин, так как поступление в них воздуха происходит в результате разрежения в воздушной камере мешалки, соединенной с воздуховодом и с жидкостью, отбрасываемой лопатками мешалки.

 

В эжекционных ферментаторах возможна рециркуляция газовой фазы, что экономит субстрат, однако требуется наличие специальных насосов для перекачки газосодержащей культуральной среды. Применение эжекционного ввода газовых субстратов в ферментатор может интенсифицировать массообмен на порядок.

Струйные ферментаторы (с затопленной или падающей струей) оборудуются мощными насосами, которые забирают культуральную жидкость из нижней части аппарата и через напорный трубопровод подводят поток к аэрирующему устройству (по типу шахтного перепада или напорно-струйные). Струя жидкости под давлением свободно падает сверху и пронизывает аэрируемую жидкость до дна аппарата. Происходят интенсивная турбулизация и перемешивание жидкости. Внизу жидкость вновь засасывается насосом и снова подается вверх аппарата, т. е. возникает замкнутый контур циркуляции. Недостатком данных аппаратов являются потери энергии при перекачке жидкости, трудности проектирования в связи с отсутствием надежных методик расчета конструкций и режимов работы струйных и эжекционных устройств.

 

 

Рис. 7. Ферментаторы с подводом энергии газовой фазой (группа ФГ)

а – барботажный: 1-корпус, 2-воздухораспределитель, 3-карман, 4-коллектор;

б – барботажно-колонный: 1-корпус, 2-рубашка, 3-воздухораспределитель;

в – барботажно-эрлифтный: 1-корпус, 2-диффузор-теплообменник, 3-воздухо-распределитель;

г – газлифтный: 1-корпус, 2-диффузор, 3-диспергатор, 4-воздухораспределитель, 5-

теплообменник;

д – трубчатый: 1-пеногаситель, 2-емкость, 3-трубы, 4- корпус, 5-распределительная

перегородка;

 

Рис. 8. Ферментаторы с вводом энергии жидкой фазой (группа ФЖ)

 

 

а – с самовсасывающей мешалкой: 1-корпус, 2-мешалка, 3-циркуляционный контур-обменник;

б – эжекционный: 1-корпус, 2-насос, 3- эжектор, 4-диффузор-теплообменник, 5-

воздухозаборник;

в– струйный с затопленной струей: 1-эжектор, 2-теплообменник, 3-корпус, 4-насос,

5-рассекатель, 6-труба с насадкой;

г – струйный с падающей струей: 1-теплообменник, 2-насос, 3-корпус, 4-эжектор

 

Третья группа аппаратов – с подводом энергии газовой и жидкой фазы (группа ФЖГ). Основными их конструкционными элементами являются перемешивающие устройства всех известных типов, а также наличие в совокупности насосов и перемешивающих устройств. Это могут быть аппараты с группой самовсасывающих мешалок и насосом для перекачивания культуральной жидкости и другие сочетания перемешивающих и аэрирующих устройств. Коэффициент массопереноса кислорода в таких ферментаторах может в принципе иметь любой из известных значений. Ферментаторы периодического действия из групп ФЖГ применяют с 1944 г. в промышленности для получения антибиотиков, витаминов и других биологически активных веществ. Их конструкции обеспечивают стерильность ферментации в течение длительного времени (нескольких суток) при оптимальных условиях для роста и жизнедеятельности продуцента.

Прогресс в области получения клеточных и рекомбинантных культур выдвигает специальные требования к биореакторам. При этом на первый план выдвигаются такие показатели, как стабильность биологических агентов, повышенные требования к асептике, лимитация срезовых условий при перемешивании и др.

 

Список использованной литературы:

1. Биотехнология. Ю.О. Сазыкин, С.Н. Орехов, И.И. Чакалева – М.: «Академия», 2007 г. – 215 с.

2. Егорова Т. А. Основы биотехнологии: Учеб. пособие для высш. пед. учеб заведений / Т.А.Егорова, С.М.Клунова, Е.А.Живухина. — М.: Издательский центр «Академия», 2003. — 208 с.

3. Катлинский А.В., Сазыкин Ю.О., Орехов С.Н., Чакалева И.И., Курс лекций по биотехнологии / ММА им. И.М. Сеченова, 2005 г. – 150 с.

4. Османов В.К., Лекции по биотехнологии/Ниж ГМА, 2008 г. – 250 с.

5. Основы фармацевтической биотехнологии, Т.П. Прищеп, В.С. Чучалин, К.Л. Зайков, Л.К. Михалева, Л.С. Белова – Ростов н/Д.: Феникс, 2006 г. – 180 с.

6. Тимощенко Л.В., Чубик М. В. Основы микробиологии и биотехнологии: учебное пособие /Л.В. Тимощенко, М.В. Чубик. – Томск: Изд-во Томского политехнического университета, 2009. – 194 с.

7. Фармацевтическая биотехнология: учеб. пособие / В.А. Быков (и другие) под общ. редакцией акад. РАМН и РАСНХ, профессора В.А. Быкова – Воронеж: издательство Воронеж. гос. ун-та, 2009. – 439 с.

Интернет ресурсы:

8. www.biotechnolog.ru

9. Биотехнология: генная инженерия, промышленная биотехнология, клеточная инженерия – учебное пособие: [электронный ресурс]. – Режим доступа: http: //www. biotechnolog.ru

10. Биоинформатика, геномика, протеомика. биософт, имейджинг: [Электронный ресурс]. – Режим доступа: http: //www.bioinFormatix.ru

11. Интернет журнал «Коммерческая биотехнология»: [Электронный ресурс]. – Режим доступа: http: //www.cbio.ru

12. Общество биотехнологов России им. Ю.А. Овчинникова: [Электронный ресурс]. – Режим доступа: http: //www.biorosinfo.ru Remedium.ru:

13. Профессионально о медицине и фармации [Электронный ресурс]. – Режим доступа: http: //www.remedium.ru

14. Новости GMP – Стандарт GMP – Фармацевтические производства и технологии [Электронный ресурс]. – Режим доступа http: //www.gmpnews.ru

15. Ассоциация Российских фармацевтических производителей [Электронный ресурс]. – Режим доступа http: //www.arfp.ru

 

 

Лекция №3

Тема лекции: Геномика и протеомика, их значение в поиске новых ЛС. Основы генной и клеточной инженерии. Молекулярные механизмы внутриклеточной регуляции и их использование в биотехнологическом производстве.

 

Цель лекции: познакомиться с понятиями геномика и протеомика, их возникновением и технологией, а также узнать какое значение имеют геномика и протеомика для создания новых антимикробных фармацевтических препаратов; познакомиться с техникой и методами клеточной и генетической инженерии; изучить методы генетической инженерии при лечении болезней и создании лекарственных средств; изучить и понять механизмы внутриклеточной регуляции и их использование в биопроизводстве; узнать понятия индукция и репрессия, катаболитная репрессия; понять, что из себя представляет аллостерический центр и его функционирование.

 

План лекции:

1. Геномика

2. Протеомика

3. Геномика и антимикробные фармацевтические препараты.

4. Таргетный скрининг

5. Клеточная и генетическая инженерии

6. Метаболизм микробной клетки и его влияние на биотехнологию производства лекарственных средств

 

Оснащение лекции: презентация

Место проведения: аудитория 525

 

 

Успехи генетики, молекулярной биологии и биохимии привели к формированию в девяностых годах прошлого века двух новых фундаментальных дисциплин - геномики и протеомики. Бурное развитие этих дисциплин обеспечивает в наше время прогресс в ряде разделов биотехнологии, в том числе фармацевтической.

 

Геномика

Название геномика происходит от слова геном, то есть совокупности всех генов организма. Слово протеомика является производным от протеома – под последним подразумевается совокупность всех - структурных и каталитических белков в клетке эукариота или прокариота. Обе дисциплины можно считать как бы терминологическим оформлением современного этапа развития, соответственно, генетики и белковой химии, приближающим их к целостной клетке. И по времени возникновения и в методологическом аспекте главенствующее значение здесь занимает геномика. Неоднократно декларировалось, что протеомика базируется на геномике, являясь следующим, после нее этапом познания живого уже на белковом уровне.

Как уже упоминалось в предыдущих лекциях генетика начала XIX века получила позднее название формальной, поскольку исследования велись на уровне ген-признак (открытие знаменитых основополагающих законов Менделя). Существование гена было постулировано, но материальная его природа оставалась неизвестной. В пятидесятые годы ХХ века после появления и быстрого подтверждения справедливости концепции Уитсона и Крика о двойной спирали ДНК и о гене как участке ДНК, началось бурное развитие молекулярной генетики: были установлены размеры отдельных генов, функционально различные участки в гене и т.д. Параллельно биохимиками с участием генетиков было осуществлено установление матричного механизма белкового синтеза с передачей генетического кода от ДНК к белку.

Геномика ставит своей задачей полную генетическую характеристику именно всей клетки: установление количества содержащихся в ней генов и их последовательности, установление количества нуклеотидов в каждом гене, и что надо подчеркнуть, их последовательности, установление функций каждого гена применительно к метаболизму организма или, говоря более общими словами, применительно к его жизнедеятельности.

Иными словами геномика позволяет выразить сущность организма – его видовые (и даже индивидуальные) отличия от других организмов, его потенциальные возможности, предвидеть его реакцию на внешние воздействия, зная последовательность нуклеотидов в каждом из его генов и зная число генов.

Минимальные геномы у некоторых видов микроорганизмов состоят из нескольких сотен генов. Геном человека приближается к ста тысячам генов.

Размеры отдельных генов варьируют - примерно от одной тысячи пар нуклеотидов и выше.

Таким образом, количество пар нуклеотидов, составляющих индивидуальный геном измеряется как минимум сотнями тысяч, обычно же многими миллионами пар нуклеотидов.

Отсюда следует, что для полного знания генома организма надо определить последовательность (sequence) миллионов пар (А-Т, Г-Ц) нуклеотидов. Провести " секвенирование", согласно вошедшему в употребление выражению, целого генома можно только при автоматизации соответствующего оборудования. Хранить же полученные данные и пользоваться ими невозможно без компьютерной техники. Более того, для этого служат специальные базы (банки) данных. Некоторые из них имеют статус международных. Широкую известность имеют базы данных института геномных исследований (США), Гейдельбергского Университета (Германия). Общаясь с такими базами, исследователи, секвенирующие конкретный геном конкретного организма, могут сопоставить свои данные с тем, что уже известно, сделать объективные выводы в отношении своей работы, пополнить базы данных новыми сведениями и т.п. Геномика таким образом, теснейшим образом связана с биоинформатикой, которая базируется на базах данных и компьютерной технике.

Секвенирование сотен миллионов пар нуклеотидов при всей его автоматизации требует необычно большого количества исполнителей отдельных исследований. Хотя, работа их ни в коем случае не является механической, но все же имеет тенденцию к монотонности. Это привело к дискуссиям о наступившем периоде " индустриализации науки" и потере творческой самостоятельности ученых.

Необходимо иметь в виду, что разнообразие геномов (по последовательности нуклеотидов) не исчерпывается признаками принадлежности организма к определенному биологическому виду. Например, у микроорганизмов в геноме зафиксированы различия между отдельными штаммами одного и того же вида, используемыми как продуценты в биотехнологической промышленности. Такие различия обнаруживаются по разной последовательности нуклеотидов в аналогичных по функциям генах.

Внутривидовые различия в геномах могут обнаруживаться по всей лестнице живых существ, включая человека (в последнем случае индивидуальные различия выявляемые при анализе ДНК составляют, в частности, новый эффективный прием судебной экспертизы).

Таким образом, багаж сведений скапливающихся на базах данных, фактически не может иметь верхней границы.

В настоящее время в качестве ежесуточного итога работы многих десятков лабораторий в разных странах мира секвенируется приблизительно один миллион пар нуклеотидов.

Как все, недавно возникшие научные дисциплины, геномика дифференцируется по нескольким направлениям (специализируются, соответственно, и базы данных). Прежде всего, здесь должна быть упомянута структурная геномика. Ее задача - идентификация генов с помощью специальных компьютерных программ. Ведется поиск открытых рамок

считывания со старт-кодонами и терминирующими кодонами, то есть идентифицируются структурные гены. В результате, изучаемый геном характеризуется по молекулярной массе, количеству генов, нуклеотидной последовательности в каждом гене. У прокариот - в геноме-хромосоме, у эукариот - в каждой из хромосом.

Далее, следует назвать сравнительную геномику и соответствующие базы данных. Сравнительная геномика позволяет относительно быстро, связавшись с базой данных и получив ответ на свой запрос, установить, является ли изученный (по последовательности нуклеотидов) ген уникальным, или он уже был идентифицирован в другой лаборатории и сведения о нем поступили на базу данных. Сравнительная геномика позволяет получить сведения о степени гомологии родственных генов (степени гомологии по последовательности нуклеотидов в открытой рамке считывания). Сравнительная геномика дает возможность при систематической работе в этом направлении получить ответ на вопрос об эволюционной близости одного организма другому и на ряд подобных вопросов, относящихся к фундаментальной биологии. В тоже время здесь заложены возможности ответа и на вопросы практического характера. Так, например, если ведется поиск ингибиторов данного гена (вернее кодируемого им белкового продукта) у патогенного микроорганизма с целью создания на их основе лекарственных средств, важно знать есть ли ген с такой или близкой последовательностью нуклеотидов в организме хозяина. Это позволяет строить предположения о степени безопасности создаваемых лекарств. Количество примеров, демонстрирующих практическую значимость сравнительной геномики, может быть очень большим.

После структурной и сравнительной геномики должна быть названа функциональная или метаболическая геномика, как сформировавшаяся научная дисциплина. Ее целью является установление связи между геномом и метаболизмом, кластерами генов и многоступенчатыми метаболическими процессами, отдельными генами и конкретными метаболическими реакциями (здесь также есть специализированные базы данных). Применительно к функциональной геномике надо отнести понятие так называемых " модельных" организмов - прежде всего это некоторые микроорганизмы, т.е. прокариоты и низшие эукариоты с полностью секвенированным геномом и досконально изученным метаболизмом, то есть микроорганизмы, у которых прослежены связи между генами и кодируемыми этими генами белками - ферментными и структурными. Примерами таких модельных микроорганизмов могут служить Escherichia coli (прокариот) и Saccharomyces cerevisiae (так называемые пекарные дрожжи, у эукариот). Сопоставление гена у изучаемого организма с близким по степени гомологии геном у модельного организма позволяет делать заключение или, по крайней мере, строить предположения о функции гена-объекта исследования. Отсутствие гомологии указывает на необходимости специального изучения функций нового гена. Разумеется, это лишь схема хода рассуждений. Число модельных организмов с полностью секвенированным геномом и соотнесением функций генов к фенотипу постоянно растет.

Особое значение применительно к фармации, функциональная геномика имеет при установлении так называемой существенности отдельных генов. Под существенностью подразумевается необходимость гена (кодируемого им продукта) для жизнедеятельности клетки. Так при создании антимикробных лекарственных препаратов именно существенные гены (кодируемые этими генами продукты) должны быть мишенями для практически ценных антимикробных веществ. Следует сразу же заметить, что иногда ген приобретает значение существенности только в особых условиях, в которых может оказаться патогенный микроорганизм, однако, это особые случаи.

 

Протеомика

Название протеомики как научной дисциплины происходит от слова протеон. По аналогии с геномом протеон означает совокупность всех белков клетки. Возможность оперировать таким понятием и сама его целесообразность появилась в результате успехов генетики и белковой химии.

Если геномика имеет целью получить информацию о всех потенциальных свойствах клетки, которые не реализуются на данный момент, например, молчащие гены, то протеомика дает возможность охарактеризовать клетку именно в данный конкретный момент, зафиксировав все находящиеся в ней белки. Это, своего рода, моментальная фотография функционального состояния клетки на уровне ее протеона, то есть совокупности всех ферментных и

структурных белков, которые работают, в отличие от неэкспрессирующихся генов.

При этом, если геномика появилась прежде всего в результате развития техники секвенирования, то для протеомики такую же основополагающую роль играет техника двухмерного электрофореза - разделение белков в одном направлении по молекулярной массе, а в другом по изоэлектрической точке.

Сам по себе этот метод не является новым, однако, в настоящее время он в значительной мере усовершенствован, что позволяет следить в динамике за сотнями белков одновременно.

Образно говоря, это как бы киносъемка клетки на молекулярном (белковом) уровне. Кадры своеобразной киноленты последовательно фиксируют нарастание и падение количества индивидуальных белков клетки во времени, например, при ее переходе из одной фазы клеточного цикла в другую; при реакции клетки на изменения внешней среды; отражают посттрансляционные превращения белков и т.п.

Протеомика позволяет следить за белковыми взаимодействиями. Это относится, например, к передаче сигналов от поверхности клетки к факторам избирательной транскрипции в ядре. С ее помощью может быть преобразована, таким образом, не только технология скрининга иммуносупрессоров но и ингибиторов сигнальной трансдукции в целом.

Методы протеомики позволяют получить более полную, всестороннюю, картину взаимодействия с клеткой новых потенциальных антимикробных агентов. Работы по изучению динамики биосинтеза ферментов вторичного метаболизма у микроорганизмов при использовании протеомики могут быть переведены на новый, более высокий уровень. Это непосредственно связано с совершенствованием продукции многочисленных классов лекарственных веществ.

Возвращаясь к связи между протеомикой и геномикой следует подчеркнуть, что протеомика может быть названа продолжением именно функциональной геномики. В отличие от геномики, предметом изучения протеомики являются продукты, кодируемые генами, экспрессирующимися в данный момент.

⇐ Предыдущая3456789101112Следующая ⇒

Поделиться: