Модуль III Слагаемые биотехнологического процесса

Модуль III Слагаемые биотехнологического процесса

Лекция №1

Тема: Схема производственного биотехнологического процесса

План лекции:

1.Слагаемые биотехнологического процесса

2. Основные стадии биотехнологического процесса

Продукты биотехнологии получают по индивидуальным технологиям со своими биологическими агентами, сырьем, числом стадий производства и их технологическими режимами. Тем не менее, можно представить себе обобщенную типовую схему биотехнологических производств.

Схема состоит из стадий, в каждой из которых сырье претерпевает определенные технологические воздействия и последовательно превращается во все более сложные полупродукты и, наконец, в конечный продукт. Общий вид такой типовой схемы представлен на рисунке.

 

Типовая схема, основные стадии и технологические процессы в биотехнологических производствах

Основная стадия биотехнологического производства. Основной стадией является собственно биотехнологическая стадия, на которой с использованием того или иного биологического агента (микроорганизмов, изолированных клеток, ферментов или клеточных органелл) происходит преобразование сырья в тот или иной целевой продукт.

Обычно главной задачей биотехнологической стадии является получение определенного органического вещества.

Однако биотехнологическая стадия, как правило, включает в себя не только синтез новых органических соединений, но и ряд других биотехнологических процессов, перечисленных далее.

Ферментация — процесс, осуществляемый с помощью культивирования микроорганизмов.

Биотрансформация — процесс изменения химической структуры вещества под действием ферментативной активности клеток микроорганизмов или готовых ферментов. В этом процессе обычно не происходит накопления клеток микроорганизмов, а химическая структура вещества меняется незначительно. Вещество как бы уже в основном готово, биотрансформация осуществляет его химическую модификацию: добавляет или отнимает радикалы, гидроксильные ионы, дегидрирует и т.п.

Биокатализ — химические превращения вещества, протекающие с использованием биокатализаторов-ферментов.

Биоокисление — потребление загрязняющих веществ с помощью микроорганизмов или ассоциации микроорганизмов в аэробных условиях.

Метановое брожение — переработка органических отходов с помощью ассоциации метаногенных микроорганизмов в анаэробных условиях.

Биокомпостирование — снижение содержания вредных органических веществ ассоциацией микроорганизмов в твердых отходах, которым придана специальная взрыхленная структура для обеспечения доступа воздуха и равномерного увлажнения.

Биосорбция — сорбция вредных примесей из газов или жидкостей микроорганизмами, обычно закрепленными на специальных твердых носителях.

Бактериальное выщелачивание — процесс перевода нерастворимых в воде соединений металлов в растворенное состояние под действием специальных микроорганизмов.

Биодеградация — деструкция вредных соединений под воздействием микроорганизмов – биодеструкторов.

Обычно биотехнологическая стадия имеет в качестве выходных потоков один жидкостной поток и один газовый, иногда только один — жидкостной.

В случае, если процесс протекает в твердой фазе (например, созревание сыра или биокомпостирование отходов) выходом является поток переработанного твердого продукта.

 

Лекция №2

Тема: Требования к продуцентам

План лекции:

1. Понятие микроорганизмы-продуценты

2. Требования предъявляемые к микроорганизмам продуцентам

3. Селекция

4. Генная инженерия

В биотехнологии обычно используются чистые культуры микроорганизмов-продуцентов, так как это позволяет получить продукт с заранее известными свойствами. Применяются штаммы микроорганизмов – микроорганизмы одного вида, выращенные в определенных условиях, вследствие чего обладающие определенными свойствами, которые отличаются от других чистых культур данного вида.

Не все микроорганизмы могут быть использованы в промышленных условиях, а лишь те микроорганизмы-продуценты, обладающие способностью под воздействием внешних факторов (состава среды, условий культивирования, температуры, рН среды и т.д.) образовывать в больших количествах преимущественно то соединение, которое является главным (целевым) продуктом данного производства.

К микроорганизмам-продуцентам предъявляется ряд обязательных требований. Микроорганизмы должны:

- расти на дешевых и доступных питательных средах;

- максимально усваивать питательные вещества среды;

- обладать высокой скоростью роста биомассы и давать высокий выход целевого продукта;

- проявлять синтетическую активность, направленную в сторону получения желаемого продукта; образование побочных продуктов должно быть незначительным;

- быть генетически однородными, стабильными в отношении продуктивности, требований к питательному субстрату и условиям культивирования;

- быть устойчивыми к фагам и другой посторонней микрофлоре;

- быть безвредными для людей (не обладать патогенными свойствами) и для окружающей среды;

- обладать хорошей способностью выделения.

Сверхсинтез, то есть способность микроорганизма синтезировать определенный продукт в количествах, превосходящих физиологические потребности, часто встречается в природе. Микроорганизмы с такими свойствами первыми были использованы в хозяйственной деятельности человека, и таким образом был проведен стихийный отбор наиболее продуктивных форм.

В промышленности применяют три вида штаммов: природные штаммы, нередко улучшенные естественным или искусственным отбором; штаммы, измененные в результате индуцированных мутаций; штаммы культуры, полученные методами генной или клеточной инженерии.

Часто путем отбора не удается получить высокоактивные продуценты, поэтому возникает задача изменения природы организма в нужном направлении. Для этого используют методы селекции.

Селекция – это направленный отбор мутантов, то есть микроорганизмов, наследственные признаки которых претерпели изменения в нужном для человека направлении.

Природные штаммы микроорганизмов не обладают способностью выделять и накапливать в питательной среде такое количество нужного продукта, которое обеспечило бы низкую его стоимость и требуемый объем производства. Поэтому задачей селекции является не только усиление природной способности микроорганизмов продуцировать определенное вещество (ферменты, антибиотики, аминокислоты и т.д.), но во многих случаях и создание продуцента «заново» из штамма дикого типа, способного синтезировать вещество, но не способного его продуцировать. Эти задачи осуществляются получением у природных штаммов наследственных изменений – мутаций, влияющих на фенотип (физиологические и морфологические признаки) клетки. Спонтанные (происходящие случайным образом) мутации помогают микробным популяциям приспосабливаться к новым условиям существования. Мутации приводят к усилению природной способности микроорганизмов синтезировать и продуцировать определенное вещество, а также к появлению новой способности – синтезировать вещество в избытке (сверх своих потребностей) и продуцировать его. Для ускорения селекции используют индуцированный мутагенез, применяя мутагенные факторы физической, химической и биологической природы. К универсальным физическим мутагенам относятся ультрафиолетовое облучение (УФО), рентгеновские лучи и др.; химические факторы мутагенного воздействия - азотистый иприт, нитрозамины, четыреххлористый углерод и другие химикаты; биологическими мутагенами являются фаги (вирусы микроорганизмов).

Таким образом, селекционированные штаммы микроорганизмов обладают определенными ценными наследственно закрепленными свойствами.

Однако мутации образуются случайным образом, поэтому более широко используется генная или генетическая инженерия – генетическая рекомбинация in vitro (в пробирке). Рекомбинация - это обмен генами между двумя хромосомами. Рекомбинантными ДНК называют молекулы ДНК, полученные вне живой клетки, в пробирке, путем соединения природных или синтетических фрагментов ДНК с молекулами, способными реплицироваться (удваиваться) в клетке. Этот подход был разработан на бактериях, в частности на кишечной палочке, в клетки которой вводили гены животных и человека и добивались их репликации. Метод рекомбинации in vitro заключается в выделении ДНК из разных видов, получении гибридных молекул ДНК и введении рекомбинантных молекул в живые клетки с целью проявления нового признака, например, синтеза специфического белка.

Возможности получения новых штаммов микроорганизмов, обладающих способностью к сверхсинтезу целевого продукта, рассмотрим на примере продуцента антибиотика пенициллина. Изначально штамм Penicillium chrysogenum (NRRL-1951) производил 60 мг/л пенициллина. После спонтанной мутации возник новый штамм (NRRL-1951ּ В25) с выходом пенициллина 150 мг/л. После рентгеновского облучения был отобран мутант (Х-1612), дающий 300 мг/л пенициллина. После нескольких циклов мутагенеза и селекции, в которых помимо УФО применяли иприт, удалось вывести высокопродуктивный штамм (Е-15ּ 1), который производил 7 г/л пенициллина. Таким образом, 21 цикл мутагенеза и селекции в течение более двух десятков лет позволил увеличить выход пенициллина в 55 раз. В настоящее время новые штаммы микроорганизмов-продуцентов дают выход более 20 г/л пенициллина.

Лекция №3

Лекция №4

Вопросы для самопроверки

1. Назовите основные стадии роста микроорганизмов.

2. Что необходимо для выращивания любой клеточной культуры?

3. Какие продукты микробного брожения и метаболизма Вы знаете?

4. Какие соединения - первичными или вторичные метаболиты – необходимы для роста микроорганизмов?

5. Перечислите отходы пищевой промышленности, широко используемые в качестве сырья для биотехнологического производства.

6. Назовите компоненты, которые обязательно должны присутствовать в питательной среде.

7. Для чего в состав питательных сред вводят источники азота и фосфора?

8. Что такое ферментация (культивирование)?

9. Перечислите способы культивирования микроорганизмов.

10. В чем особенности периодического способа ферментации?

11. Где применяется данный способ?

12. Каковы особенности промежуточных способов культивирования?

13. В чем преимущество непрерывного способа культивирования?

14. В чем отличие хемостата от турбидостата?

15. Что такое иммобилизованные клетки, и каковы преимущества их применения?

16. Расскажите об особенностях культивирования животных и растительных клеток.

Лекция №5

Лекция № 6

Микробиологические клетки

В современной мировой практике с помощью микробиологического синтеза получают около 60% всего объема производимых аминокислот. Это обусловлено прежде всего его высокими технологическими показателями, а также возможностью организовать в пределах одного предприятия получение как кормовых препаратов, так и особо чистых индивидуальных аминокислот, пригодных к использованию в пищевой промышленности и медицинской промышленности.

Преимуществом микробиологического синтеза является и то, что используемые микроорганизмы образуют аминокислоты в биологически активной L-форме. Организацию промышленного производства L-аминокислот с помощью микроорганизмов осуществляют по двум технологическим схемам. Они различаются в основном, стадией получения культуральной жидкости. В первой предполагается производство культуральной жидкости в две стадии (двуступенчатый способ), во второй – в одну ступень (одноступенчатый способ). В двуступенчатом способе первой ступенью является образование предшественника и биосинтез фермента; на второй стадии происходит процесс трансформации предшественника в аминокислоту с помощью ферментных систем, выращенных на первой стадии.

Одноступенчатый способ синтеза с помощью микроорганизмов получил наибольшее распространение. Он основан на культивировании определенного штамма – продуцента целевой аминокислоты. Такие мутантные штаммы получают либо методом генной инженерии, либо путем воздействия различных мутагенов физической и химической природы на исходную культуру микроорганизма с последующей селекцией штамма по заданным признакам.

Так, производство лизина осуществляют с помощью штаммов Brevibacterium flaum и corynebacterium glutamicum. Практически весь лизин, производимый в мире микробиологическим синтезом, расходуется на обогащение кормов сельскохозяйственных животных и птицы. В России широкое распространение имеют кормовые препараты лизина в виде ЖКЛ (жидкий концентрат лизина) и ККЛ (кормовой концентрат лизина). Помимо этого получают высококонцентрированные кормовые и высокоочищенные кристаллические препараты для пищевой и медицинской промышленности. ЖКЛ и ККЛ содержат всю сумму веществ, присутствующих в культуральной жидкости и твердые нерастворимые частицы исходной среды, а также другие соединения, в том числе витамины группы В, РР и др. Препарат ККЛ содержит 15-20% лизина; препарат, называемый «высококонцентрированный кормовой препарат» содержит 70% лизина; кристаллические высокоочищенные препараты лизина содержат 97-98% лизина.

Вместе с тем некоторые микроорганизмы являются продуцентами ряда витаминов и используются в биотехнологии для их получения. Например, Propionibacterium freudenreichii подвид shermanii служит продуцентом витамина В12.Продуцентом β - каротина – предшественника витамина А – является мицелиальный гриб Blakesleea trispora. Способностью выделять рибофлавин обладают некоторые аскомицетные грибы, например Ashbya gossypii и Eremothecium ashbyii.

Полученные микробиологическим путем витамины используют как кормовые добавки для сельскохозяйственных животных, а также при дополнительной очистке в качестве пищевых добавок и витаминных препаратов в пищевой промышленности и фармакологии, соответственно.

Среди вторичных метаболитов, образуемых микроорганизмами, наибольшее значение имеют антибиотики. Химические соединения, получаемые с помощью микроорганизмов, находят широкое применение в медицине, ветеринарии и в сельском хозяйстве для борьбы с заболеваниями животных и растений. В настоящее время количество разнообразных антибиотиков превысило шесть тысяч, причем число новых препаратов ежегодно возрастает. Продуцентами антибиотиков служат различные группы микроорганизмов. Мицелиальные грибы синтезируют такие широко известные антибиотики, как пенициллины, цефалоспорины. Стрептомицеты служат продуцентами стрептомицина, хлоромфеникола, тетрациклиновых антибиотиков и актиномицина, а бактерии Bacillus brevis образуют грамицидин.

К низшим фотоавтотрофным организмам, имеющим эукариотический тип клетки, обитающих преимущественно в водной среде или приспособившихся к жизни в почве и некоторых наземных местообитаниях, относятся водоросли.

Пищевые качества водорослей не уступают таковым высших растений. Биомасса их отличается высоким содержанием полноценных белков (включающих все необходимые для питания человека и животных аминокислоты, в том числе незаменимые), витаминов и других физиологически активных веществ.

Водоросли используются также в земледелии как удобрения, фиксаторы атмосферного азота, продуценты кислорода и органических веществ (в том числе типа антибиотиков), регуляторы влажности, агенты, улучшающие структуру почвы и повышающие почвенное плодородие. В животноводстве они применяются в качестве белково-витаминных добавок в рацион животных, источников микроэлементов и ростовых веществ, способствующих повышению продуктивности сельскохозяйственных животных.

Водоросли используются как промышленное сырьё для получения альгиновых кислот и альгинатов, агар-агара, каррагенана, сорбита, маннита, этилового и метилового спиртов, органических кислот, эфиров, разнообразных ферментов, витаминов, антибиотиков и др. физиологически активных веществ. Возрастает значение водорослей в медицине как регенераторов лечебных грязей, источников получения уникальных медпрепаратов (заменителей крови, растворимых хирургических нитей, противодиабетических и противоопухолевых препаратов, соединений, способствующих выведению радиоактивных веществ из организма при лучевой болезни и др.).

Обладая многими полезными для человека свойствами, водоросли вместе с тем могут приносить значительный ущерб народному хозяйству, вызывая биокоррозию промышленных и строительных материалов, порчу произведений искусства, памятников архитектуры, вызывают «цветение» воды, сопровождаемое выделением токсических веществ, кислородной недостаточностью, массовой гибелью беспозвоночных и рыб.

Растительные клетки

Культура растительных клеток является искусственно созданной биологической системой, функционирующей in vitro и сохраняющей многие черты, присущие интактному растению. Несмотря на некоторое снижение биосинтетической способности, культивируемые клетки растений синтезируют гораздо большее количество метаболитов по сравнению с микробными клетками.

Многие продукты вторичного обмена культур клеток были получены в промышленных или лабораторных условиях. Например, сердечные гликозиды — из культуры ткани наперстянки, стероиды — из диаскореи дельтовидной, алкалоиды — из культуры ткани мака, а также из раувольфии змеиной и т. д., всего более ста веществ, имеющих существенное значение для промышленности и медицины. Основными проблемами, осложняющими получение целевых продуктов из культуры растительных клеток, являются создание генетически стабильных штаммов и выделение метаболитов из млечников или вакуолей, где они обычно накапливаются.

При помощи методов генной инженерии созданы клетки или растения-регенераты с новыми свойствами. В последние годы достигнуты большие успехи, связанные с генетической трансформацией клеток, в том числе и растительного происхождения. Схема трансформации включает в себя получение протопласта, введение в него необходимой генетической информации, формирование полноценной растительной клетки, клонирование и регенерацию. В данной схеме «трансформированный протопласт — суспензионная культура — каллусная культура — целое растение»— наиболее тех-синтезировали химерные белки, состоящие из А- или В-цепи инсулина, присоединенной через метионин к р-галактозидазе. При помощи бромциана, специфически расщепляющего белки по остатку метионина, выделяли индивидуальную цепь инсулина. Далее цепи соединяли в единую активную молекулу инсулина. Образование дисульфидных цепей in vitro явилось лимитирующей стадией всего процесса, причем выход был незначительным. В связи с этим был разработан метод получения проинсулина человека с последующим созреванием его in vitro. Были синтезированы несколько десятков олигонуклеотидов, соединенных затем при помощи ДНК-лигазы. Полученные двухцепочечные фрагменты ДНК, соответствующие гену, кодирующему человеческий инсулин, были встроены в плазмиду, а затем перенесены в Е. coli

Полученные рекомбинантные клетки синтезировали проинсулин, который затем in vitro превращали в зрелый инсулин. В настоящее время генно-инженерный инсулин широко применяется в медицинской практике.

Интерфероны — низкомолекулярные белки, обладающие выраженной противовирусной активностью. Кроме того, интерфероны проявляют фармакологический эффект при таких заболеваниях, как гепатит В, рассеянный склероз, некоторые локализации опухолей. Различают три класса интерферонов по месту их синтеза в клетках человека и животных: а-интерферон из лейкоцитов, р-интерферон из фибробластов и у-интерферон из тимуса. а-Интерферон является простым белком, р- и у-белки — гликозилированы. Интерферон является одним из самых эффективных средств лечения вирусных инфекций, но он видоспецифичен и может быть получен только из клеток человека. Технология выделения и очистки интерферонов малоэффективна прежде всего из-за крайне малого выхода конечного продукта. Поэтому получение генно-инженерного продукта является перспективной альтернативой традиционным методам выделения интерферона. Значительным событием явилась удачная попытка введения гена интерферона в дрожжевые клетки. Замена промотора гена человеческого интерферона на ген дрожжевой алкогольдегидрогеназы обеспечила эффективную экспрессию гена интерферона. Замена бактериальной клетки в качестве реципиента на дрожжевую сыграла огромную роль для всей генно-инженерной техники вообще и для получения интерферонов в частности.

Генно-инженерные вакцины. Вакцинация человека и животных основана на выработке антител в ответ на введение антигена — ослабленного или инактивированного вируса. Применение живых вакцин чревато заражением, а инактивация вирусов может резко снизить их иммуногенность. Антигенные свойства вирусных частиц определяются в основном их белковыми компонентами, поэтому выделение индивидуального вирусного белка дает возможность получения вакцины, лишенной указанных выше недостатков.

Вирусные белки могут быть получены генно-инженерным методом. Для синтеза вирусных белков используют клетки высших эукариот, имеющих полноценный аппарат созревания сложных белков. Синтетические пептиды могут реагировать с антителами против целой вирусной частицы. Целенаправленный синтез таких пептидов, содержащих аминокислотные последовательности, характерные для фрагментов тех или иных вирусных белков, является перспективным направлением для создания эффективных синтетических вакцин.

Культура клеточных суспензий. Под суспензионными культурами понимают выращивание в жидкой среде отдельных клеток или небольших групп с использованием аппаратуры, обеспечивающей аэрацию и перемешивание.

Для получения суспензионных культур используют каллусную ткань рыхлого типа, которая легко фрагментируется на отдельные клетки и небольшие агрегаты при помещение ее в перемешиваемую жидкую среду. С этой целью при культивировании каллуса из среды исключают цитокинины или снижают их концентрацию, а увеличивают концентрацию ауксинов.

Наиболее простой принцип - накопление, периодическое культивиро­вание суспензий. В этом случае размножение популяции клеток осущест­вляются в закрытой системе в постоянном объеме питательной среды. Обычно начальная плотность клеточной популяции составляет 0, 5x105— 2, 5х 1 о5 клеток на мл питательного раствора. Сосуды с суспензией закреп­ляют на платформе шейкера (встряхивателя) или устанавливают на качалки ротационного типа. В этих условиях обеспечивается аэрация и, кроме того, нарастающая масса клеточных агрегатов распадается на отдельные Фрагменты. В лабораторных условиях обычно используют сосуды объемом 100—250 мл с небольшим объемом питательной среды - 20—70 мл. Крупномасштабное культивирование осуществляют в сосудах объемом до нескольких декалитров с продуванием жидкой среды стерильным воздухом.

 

Другие методы выращивания клеточных культур - непрерывное культи­вирование с поддержанием баланса между разбавлением питательной среды и удалением части суспензии. Было обнаружено, что если при нако­пительном культивировании клеточных суспензий в фазе логарифми­ческого роста культуры в сосуд добавляют свежую среду, то деление клеток возможно поддерживать неограниченно долго. Это и послужило основой создания систем, позволяющих осуществлять непрерывное культиви­рование.

Непрерывные культуральные системы подразделяют на полу проточные и проточные.

ПОЛУПРОТОЧНЫЙ РЕЖИМ ВЫРАЩИВАНИЯ

При этом производится отбор определенной части клеточной суспензии через интервалы времени и разбавление оставшейся части суспензии свежей средой. Через суспензию пропускают стерильный воздух. Культуру размешивают магнитной мешалкой. Культивирование может продолжаться в течение нескольких месяцев.

ПРОТОЧНЫЙ РЕЖИМ ВЫРАЩИВАНИЯ

При этом осуществляется непрерывное снабжение свежей средой с удалением равного объема клеточной суспензии. В таком режиме автоматизированные ферментеры (культуральные сосуды) могут функционировать в течение нескольких лет. Ферментеры, используемые для производства больших клеточных масс, могут иметь объем до 1500 л.

Практическое использование культуры клеточных суспензий: для изуче­ния дифференциации клеток, их биосистематических особенностей и популяционных взаимоотношений; для промышленного получения необходимых продуктов клеточного метаболизма.

Вопросы для самоконтроля.

1.Типы предприятий биотехнологической промышленности, особенности их размещения.

2. Общая характеристика продукции биотехнологических производств.

3. Выделение целевых продуктов из клеточной биомассы.

4. Классификация процессов брожения по конечным продуктам.

 

Модуль III Слагаемые биотехнологического процесса

Лекция №1

123456Следующая ⇒

Поделиться: