Тема: Сырье и состав питательных сред для биотехнологического производства клеток

План лекции:

1. Потребность микроорганизмов в питательных веществах

2. Источники питательных веществ в среде

3. Природные питательные среды

Чтобы культура микроорганизмов могла нормально расти, размножаться и осуществлять биосинтез ка­кого-то вещества, необходимы оптимальные условия окружаю­щей среды: химические факторы — состав и концентрация пита­тельных веществ, присутствие активаторов и ингибиторов; физи­ческие факторы — температура, давление, реакция, плотность, подвижность среды, освещение, радиация и т. д. При нарушении оптимальных границ этих факторов нарушается обмен веществ, прекращается или ограничивается рост и размножение куль­туры.

Питательные среды. Источниками углерода в питательной среде для гетеротрофных микроорганизмов могут быть углеводы (моносахариды, полисахариды), спирты, кислоты, углеводоро­ды и др. Концентрация этих веществ в среде может изменяться от десятых долей процента до 20%. Абсолютное содержание источника углерода для получения определенного количества нужного метаболита или биомассы рассчитывают, используя экспериментально определенные экономические коэффициенты выхода.

Источниками азота в питательной среде могут быть белки, пептиды, аминокислоты, соли аммония или аммиака, нитраты, а также атмосферный азот. Количество азотсодержащих веществ для образования биомассы можно вычислить, если известно со­держание азота в данной биомассе и вероятный урожай ее. Обычно принимают, что 5% азота остается в питательной среде неиспользованным.

В качестве источника фосфора обычно используют фосфаты. Кроме того, к питательной среде добавляют соли К, Mg, Fe и различные органические вещества.

Потребность микроорганизмов в соответствующих веществах выясняют, культивируя их на синтетических средах, которые со­стоят из компонентов чистых веществ. Изменяя количество од­ного из компонентов среды и сохраняя остальные на оптималь­ном уровне, можно установить, какие вещества и в каких кон­центрациях необходимы для культивирования соответствующе­го микроорганизма. В лабораториях аэробные микроорганизмы культивируют в пробирках или колбах, которые помещают в спе­циальные качалки.

Готовя синтетические среды, необходимо обеспечить полно­ценный комплекс минеральных веществ. Кроме калия, фосфора, магния и других элементов, которые добавляют в питательную среду в сравнительно больших количествах, иногда для нор­мального развития культуры необходимо незначительное коли­чество некоторых элементов. Так, несколько микрограммов ко­бальта, марганца и меди на 100 г питательной среды изменяют образование витаминов группы В в биомассе дрожжей. Чтобы выяснить воздействие этих микроэлементов на рост культуры микроорганизмов и биосинтез различных веществ, опыты необ­ходимо проводить в среде, приготовленной на бидистиллированной воде из перекристаллизованных солей, при использовании посуды из особого стекла или особой пластмассы.

Содержание биологически активных веществ в питательной среде

Биологически активные вещества	Концентрация, мкг/л
	минимум	оптимум
Биотип Фолиевая кислота Парааминобензойная кислота Тиамин Пиридокснн Паитотенат Са Рибофлавин Никотиновая кислота L-аланнн Холив Инозит Пуриновые и пирнмидиновые основания	0, 002—0, 01 0, 02 0, 01 0, 1—0, 3 0, 1 5—10	0.1—1, 0 0, 5-0, 5 0, 02 1—100 10—1000 20—1000 10—1000 100—1000 500—1000 1000—2000 2000-6000 5000—10000

Так как витамины являются очень активными веществами, их концентрация в питательной среде невелика (табл. 4). Опти­мальное количество витаминов и других активных веществ для определенных культур микроорганизмов варьирует в очень ши­роких пределах. Если соответствующие микроорганизмы куль­тивируют на твердой среде, к ней добавляют 1, 5—2% агара.

В лабораториях часто применяют природные питательные среды. Для культивирования некоторых микроорганизмов исполь­зуют мясной отвар в виде мясо-пептонного бульона или мясо-пептонного агара, солодовое сусло, молоко и т. п.

Большинство гетеротрофных микроорганизмов хорошо раз­вивается на среде с дрожжевым экстрактом или автолизатом, которые добавляют к синтетической среде.

Для выращивания дрожжей, бактерий и плесневых грибов широко используют солодовое или пивное сусло, которые со­держат 8—12% сахара, главным образом в виде мальтозы, дек­стрины, азотсодержащие, минеральные вещества, витамины и другие необходимые компоненты. Природные питательные среды готовят также из экстрактов молока, картофеля, бобов или ово­щей, из плодовых или ягодных соков и т. д.

В промышленности для культивирования микроорганизмов обычно применяют полусинтетические или природные субстраты.

Источником углерода часто бывает меласса, источником би­ологически активных веществ — кукурузный, дрожжевой экст­ракты и др. Дозировки этих природных продуктов в среду необ­ходимо регулировать в соответствии с оптимальными граница­ми концентраций наиболее важных активных веществ для дан­ной культуры.

Если на клетки микроорганизмов воздействуют слишком вы­сокие концентрации веществ в растворе, может произойти плаз­молиз — часть воды выйдет из клеток и протоплазма отойдет от клеточной стенки. Это явление можно наблюдать в микроскоп если, например, поместить дрожжевые клетки в каплю 2— 5%-ного раствора NaCl. Большинство бактерий легко переносят0, 5—3%-ную концентрацию солей, а галофильные микроорга­низмы выдерживают даже 29%-ную концентрацию. Следует от­метить, что по осмотической активности 20%-ный раствор соли эквивалентен 60%-ному раствору сахара, т. е. поваренная соль осмотически в 3 раза активней.

Информацию о влиянии некоторых веществ на рост дрожжей дает табл. 5.

Влияние вредных примесей на рост и размножение хлебопекарных дрожжей

	Рост за-	Рост пол-		Рост за-	Рост пол-
	держива­ется	ностью останав-		держива­ется	ностью останав-
Примеси		ливается	Прнмеси		ливается
	пЛй концентрации		при концентрации
	ингибиторов, %		ингибиторов, %
Органические ки-			Нитриты	0, 0005
слоты			Формалин	0, 09	—
щавелевая	0, 001	0, 1	Фтористый натрий	0, 002	■ —
муравьиная	0, 0085	0, 2	Тяжелые металлы
уксусная	0, 02	0, 2	медь	—	0, 005
масляная	0, 005	0, 05	серебро	—	0, 000001
молочная	1, 35	—	мышьяк	—	0, 0005
Сернастый ангид-	0, 0025	—
рид

Большое значение в жизни микроорганизмов имеет кислород. Для аэробных микроорганизмов он жизненно необходим, а для анаэробных является ядом.

Промежуточное положение занимают факультативно ана­эробные микроорганизмы, Например спиртовые дрожжи, кото­рые нормально растут в среде без особого воздушного аэриро­вания. Метанокисляющие бактерии, используемые для биосин­теза витамина Bi2, не переносят присутствия кислорода, поэтому в начале процесса ферментации через культуральную жидкость продувают СО₂ для деаэрации и перемешивания. При производстве хлебопекарных и кормовых дрожжей среду интен­сивно аэрируют, продувая за 1 мин через каждую единицу объема среды 1—2 ед. объема воздуха, причем последний дол­жен быть тонко диспергирован в среде. В среднем можно счи­тать, что в аэробных условиях при окислении глюкозы до СО₂ на каждый грамм глюкозы нужен 1 г кислорода.

Потребление кислорода в среде зависит от концентрации клеток. Чем она выше, тем больше требуется кислорода. Выби­рая режим аэрации, надо обеспечить такую скорость растворе­ния кислорода, которая полностью соответствовала бы его рас­ходу.

Обеспечивая культуру аэробных микроорганизмов кислоро­дом, надо добиться его максимального растворения в среде. Как известно, при давлении 0, 1 МПа (1 кгс/см2) и температуре 30°С в I л дистиллированной воды максимально возможное количе­ство растворенного кислорода равно 7, 54 мг.

Скорость адсорбции кислорода можно характеризовать урав­нением

 

 

где С — фактическая концентрация растворенного кислорода, мМоль/л;

С —концентрация максимально возможного количества растворенного кислорода;

Ку — константа скорости растворения кислорода или коэффициент масса-обмена; коэффициент адсорбции, сульфитное число, Моль Оа/(л-мин) при давлении 0, 1 МПа [на практике широко применяют кг О2/(м3-ч) или мг О*/(л мин)].

Коэффициент Kv для каждой системы аэрации можно опре­делить, например, по сульфитному методу. Для этого аппарат заполняют раствором сульфита натрия в воде и затем аэрируют этот раствор в присутствии ионов меди. Кислород реагирует с сульфитом по уравнению

O₂+ 2Na₂SO₃ - 2Na₂SO₄

Остаточное количество сульфита оттитровывают йодом.

2Na₂SO₃+ J₂ +H₂O -♦ Na₂SO₄ + 2HJ;

 

где С — разность концентрации' сульфита за время t в 5-миллвлитровом об­разце.

Сульфитное число характеризует систему аэрации и интен­сивность растворения кислорода. Коэффициент массообмена кислорода Кv зависит от мощности мешалки, объема жидкости в аппарате, количества воздуха, подаваемого к мешалке, а так­же от частоты вращения мешалки, ее размеров и формы. Кон­центрацию растворенного кислорода в среде можно определить полярографически.

Условия питательной среды характеризует окислительно-восстановительный потенциал, выраженный в милливольтах или чаще отрицательным логарифмом давления молекулярного во­дорода гН₂- Для анаэробных микроорганизмов наивысшее зна­чение гН₂ равно 12, наименьшее — 0. Для аэробных микроорга­низмов, например для видов Azotobacter, гН₂ равно 29, 6, для дрожжей — 10—30. За время роста аэробных микроорганизмов редокс-потенциал уменьшается, так как потребляется кислород и в среде накапливаются восстановленные продукты.

Большинство используемых в промышленности микроорга­низмов по отношению к температуре являются мезофилами: их развитие происходит при 25—37°С. Психрофильные микроорга­низмы растут в интервале 0—15°С, а термофильные — в интер­вале 55—75°С. Все перечисленные группы имеют промежуточ­ные формы. Обычно при повышении температуры процессы био­синтеза интенсифицируются, если это повышение не ингибирует определяющие биосинтез ферменты. Для биосинтетических про­цессов желательно использовать термофильные микроорганиз­мы. Большинство вегетативных микроорганизмов гибнет при температуре 70°С за 1—5 мин.

В микробиологическом синтезе большое значение имеет ре­акция среды (рН). Для каждой культуры микроорганизмов есть свой оптимум, максимум и минимум рН. Ацидофильным микро­организмам (некоторые дрожжи, плесени, бактерии) необходим рН 1, 5—4, 5, нейтрофильным — рН 6, 5—8, 0, базофильным — рН 8, 5—9, 5. Большинство микроорганизмов лучше всего разви­вается в нейтральной среде при рН 7, 0.

На рост и биосинтез микробных культур влияют также различные ядовитые вещества.

Стерильность. Стерильной называют среду (например, пита­тельный раствор, поверхность или помещение), в которой отсут­ствуют живые формы микроорганизмов. Стерильность обеспечивают, обрабатывая соответствующий объект физическими (тем­пература, облучение, фильтрация) или химическими средствами. В результате клеточные коллоиды микроорганизмов необратимо коагулируют. Чем выше температура и влажность клеточной массы, тем выше летальность. Так, яичный белок влажностью 50% коагулирует при 56°С, влажностью 25% —при 76°С, влаж­ностью 5%—при 149°С. Коагуляцию белков вызывает также присутствие ионов металлов, причем коагулирующий эффект за­висит от их валентности и атомной массы. В присутствии трех­валентных ионов тяжелых металлов белки коагулируют более полно, чем в присутствии двухвалентных. Органические вещест­ва, например спирт, фенол, формалин и их производные, также вызывают коагуляцию белков.

Гибель микроорганизмов способны вызвать химические ве­щества, которые специфически или неспецифически связывают­ся с белками, инактивируя определенные группы активных фер­ментов. К таким неспецифическим веществам относятся хлор, иод, формалин, а к специфическим — антибиотики, сульфамид­ные препараты и т. д. Летальное или бактериостатическое воз­действие некоторых химических веществ (например, полимиксина) связано с их концентрированием на поверхности клеток или ферментов и созданием глубоких изменений в процессах прони­цаемости и транспорта веществ.

На практике чаще всего используют влажную и сухую сте­рилизацию жаром, а также стерилизацию фильтрованием. При­мером влажной стерилизации может служить стерилизация по­суды и сред автоклавированием.

Чем выше температура, тем короче стерилизация. В процес­се термической стерилизации происходит необратимая денату­рация белков клеток, и вместе с этим ферменты теряют свою активность. Если вода кипит при нормальном давлении, ее тем­пература равна 100°С, при повышении давления температура кипения также повышается

Взаимосвязь давления и температуры кипения

 

Давление	Температура, °С
кПа	кгс/см»
	0, 35 0, 7 1, 05 1, 4

Производственные установки стерилизуют паром при давле­нии 150—200 кПа (1, 5—2 кгс/см2) в течение часа. Если аппара­тура сильно инфицирована, дополнительно применяют форма­лин. В этом случае используют комбинированную термическо-химическую стерилизацию.

Вегетативные формы микробных клеток убивают кипячением (температура 100°С) или пастеризацией растворов (температу­ра ниже 100°С). Летальный эффект можно увеличить добавле­нием карбоната натрия (2%). В этих условиях в течение 10 мин инактивируются также и споры.

Сухая стерилизация менее эффективна, чем влажная терми­ческая. В сухой атмосфере (сушильный шкаф) при температуре 165—170°С споры гибнут в течение 2 ч. В этих условиях проис­ходит не только денатурация, но и обугливание белков. После сухой стерилизации лабораторной посуды оберточная бумага становится коричневой.

Дезинфекция — уничтожение патогенной микрофлоры с по­мощью химических веществ. На практике используют различ­ные группы дезинфицирующих веществ:

1. галогены и их производные (0, 5—5%-ный раствор хлор­
ной извести, 7%-ный раствор иода в спирте и др.);

2. соединения тяжелых металлов (растворы ртути, серебра
или меди 1: 1000);

3. фенол и его производные (в виде 1—5%-ной суспензии);

4. летучие дезинфицирующие вещества (спирты, формаль­дегид, хлороформ, β -пропиолактан, окись этилена и др.).

Бактерициды (фунгициды) — вещества (или физические фак­торы), уничтожающие бактерии (грибы). Если соответствующий фактор не убивает клетку, а только ограничивает ее развитие, то он является бактериостатическим (по отношению к бактериям) и фунгистатическим (по отношению к грибам). К бактерио- и фунгистатическим веществам относится ряд медикаментов, на­пример сульфамидные препараты, парааминобензойная кислота, антибиотики и др. Бактерио- или фунгиститическое воздействие могут оказать также высушивание, замораживание и небольшие дозы облучения. На практике для стерилизации поверхностей и воздушного пространства помещений чаще всего используют из­лучение ультрафиолетовых ламп.

Для стерилизации газов и жидкостей иногда используют ме­тод холодной стерилизаций — фильтрацию, в основе которой ле­жит механическое и' электростатическое осаждение клеток ми­кроорганизмов на поверхности фильтра. В лабораторной црактике широко используют фильтры Зейтца, которые представляют собой прессованные асбесто-целлюлозные диски. Применяют также и мембранные диски из коллодия, ацетатной целлюлозы н других подобных материалов. Обычно диаметр пор мембранных фильтров колеблется от 1 до 0, 005 мкм. Фильтрацией можно задержать даже вирусы. Для задержки микроорганизмов ис­пользуют также фаянсо-фарфоровые фильтры

Фильтрацию жидкостей как метод холодной стерилизации используют также в промышленности в том случае, если какой-либо компонент среды (витамин, фермент) не переносит терми­ческую обработку. Для этих целей можно применять асбесто-целлюлозные пластинки типа СФ (ГОСТ 480—41).

Для стерилизации воздуха в микробиологической промыш­ленности используют стеклянную и простую вату, ткань Петриянова, базальтовое волокно или фильтры из активного угля. Иногда для стерилизации воздуха применяют комбинирование термической обработки, фильтрации и ультрафиолетового облу­чения. Для очистки воздуха от микрофлоры можно использо­вать аппараты типа скрубберов, в которых сверху разбрызги­вается дезинфицирующее вещество—10%-ная гидроокись натрия или 15—20%-ный раствор серной кислоты. В этих аппаратах нельзя применять такие дезинфицирующие вещества, которые, попадая с потоком воздуха в ферментатор, помешали бы про­цессу биосинтеза.

В производстве стрептомицина, хлортетрациклина, эритро­мицина и других антибиотиков, а также энтобактерина — сред­ства борьбы с вредителями растений, ацетона, молочной кислоты и других веществ большую опасность представляют вирусы бактерий — фаги. Это внутриклеточные паразиты, которые, про­никая внутрь бактерий или актиномицетов (актинофаги), раз­множаются, используя для этого клеточные вещества, и приво­дят клетку к разрушению — лизису. Уже в 1898 г. Н. Гамалея наблюдал лизис бактерий, но только в 1915 г. английский бак­териолог Таурт установил, что агент, вызывающий лизис стафи­лококков, имеет инфекционную природу и не задерживается обычными бактериальными фильтрами.

Теперь выяснено, что фаги имеют форму булавы. У них есть головка диаметром 50—60 нм и вырост или хвост длиной при­мерно 100 нм (см. приложение 9 цветное). На конце хвоста на­ходится базальная пластинка с 5—6 тонкими выростами—ни­тями, которые действуют как органы адсорбции к телу бак­терии.

Как и у вирусов, в центральной части фагов располагается нуклеиновая кислота (ДНК или РНК), которую покрывает бел­ковая оболочка. Нуклеиновые кислоты и белки находятся при­мерно в равных соотношениях. Встретив бактерию, фаг присое­диняется к ее поверхности и через хвостовой отдел вводит в бактерию свою нуклеиновую кислоту. В результате изменяется обмен веществ в клетке бактерии, она прекращает продуциро­вать вещества, необходимые для роста и развития, и начинает продуцировать фаги в вегетативной форме. В каждой клетке число фагов может достигнуть нескольких сотен и даже тысяч.

После проникновения в клетку фаги размножаются очень быстро. Уже через 10 мин после инфицирования в каждой клет­ке культуры бактерий можно найти 2—3 фага, а через 20 мин — уже 100. После лизиса бактериальной клетки фаги выделяются из нее и переходят в зрелую форму. Клеточные фаги могут на­ходиться и в форме профагов. В этом случае они, находясь в скрытом состоянии, не уничтожают клетку, а при помощи своей ДНК, связанной с ДНК клетки, синхронно репродуцируются вместе с клеткой. Если клетки бактерий, содержащие профаги, попадают в неблагоприятные условия (воздействие ультрафио­летовых лучей или ядовитых соединений), профаги могут перей­ти в вегетативную форму, размножиться и лизировать клетку. Такие культуры бактерий, содержащие профаги, называют ли­бозогенными. В природе фаги широко распространены именно в виде лизогенных культур. Фаги многих бактерий и актиномице-тов выделены из почвы.

Для предотвращения фаговой инфекции стараются работать с фагоустойчивыми культурами. Их получают путем селекции, постепенно и систематически воздействуя на исходную культуру фагами или мутагенными факторами. Очень важно своевремен­но обнаружить присутствие фага и ликвидировать источник ин­фекции.

Фаги погибают под действием в течение 30 мин температуры 100°С и выше. В борьбе с фагами можно применять также хлорсодержащие соединения (гипохлорид или хлорную известь, хлор­амин и др.) в виде 0, 05—0, 1% -ных растворов или в виде аэро­золей. Особенно эффективен алкилметилбензиламмонийхлорид, который при концентрации активного хлора 0, 1% в течение 5—6с полностью инактнвирует фаги. При использовании аэрозолей влажность воздуха должна быть не менее 50%. В качестве эф­фективного противофагового средства используется 0, 02%-ный йодоформ (только он отрицательно воздействует на органы ды­хания), 0, 25% -ный раствор перманганата калия, 3, %-ный ра­створ перекиси водорода и 5%-ный раствор формалина.

Лекция №4

⇐ Предыдущая123456Следующая ⇒

Поделиться: