Классификация процессов брожения по конечным продуктам. Мко – возбудители различных типов брожения.

Молочнокислое брожение одно из распростра-ненных бродильных процессов. Это брожения осу-ществляют мко, относящиеся к родам Lactobacillus, Streptococcus, Leuconostoc. Данные виды объединены в гр. молочнокислых мко по способности утилизировать лактозу, глюкозу и галактозу с образов. молоч. кислоты в качестве основного продукта метаболизма.

По биохимич. закономерностям и составу прод-уктов метаболизма различают гомоферментатив-ное и гетерофермент. молочнокис. брожение.

1. Гомофермент. брожение - основной продукт является молочная кислота. Суммарное уравнение процесса: С ₆Н ₁₂О ₆ + Н ₃РО ₄ + 2 АДФ → 2СН ₃СНОНСООН + 2 АТФ + 2 Н ₂О

Промежуточные реакции катаболизма глюкозы протекают по гликолитическому пути. Мко, спосо-бные ассимилировать лактозу, характеризуются наличием фермента β -галактозидазы.

Ключевая реакция процесса восстановления ПВК до молоч. кислоты катализируется двумя стереоспе-цифичными лактатдегирогеназами. Коф-ерментами L- и О-лактатдегирогеназ является НАД, аллостерическим эффектором, повышающим активность фермента фруктозо-1, 6-дифосфат. Сни-жение концентрации субстрата приводит к подав-лению активности лактатдегидрогеназ, в результа-те чего бактерии трансформируют ПВК в муравьи-ную, уксус. кислоты, этанол и др. продукты мета-болизма, накапливая дополн. запас энергии.

Аналогичные процессы имеют место при сме-щении рН питательной среды в слабощелочную сторону. Т.о, деление на гомо- и гетерофермента-тивные культуры являются весьма условным.

2.Гетероферм. брожение характеризуется образованиием СО₂; укс., пропионовой и других орган.кислот; этанола и других метаболитов, являющихся производными ПВК. Данный тип молочнокислого брожения подразделяют на брожение идущее с выделением СО₂ и без.Суммарные уравнения имеют вид:

- в первом случае: С ₆Н ₁₂О ₆ + Н ₃РО ₄ + АДФ →

СН ₃СНОНСООН + АТФ + СО₂ + СН ₃СН ₂ОН

- во втором случае: С ₆Н ₁₂О ₆ + 5 Н ₃РО ₄ + 5 АДФ →

2 СН ₃СНОНСООН + 5 АТФ + 3 СН ₃СООН

Процесс спиртового брожения используется в БТ для получения этанола и глицерина. Суммарное уравнение процесса имеет вид:

С ₆Н ₁₂О ₆ + 2 Н ₃РО ₄ + 2 АДФ → 2 АТФ + 2 СО₂ + С ₂Н ₅ОН

Кроме этанола и СО₂, всегда образуются побоч-ных продукты: глицерин, уксусной кислота и др.

По механизму утилизации углеродного субстра-та возбудители спирт. брожения делятся на 3 гр:

1)Мко, расщепляющие сахара по пути гликолиза до ПВК с восстанем до этанола. Клюючевыми реакциями пр-са являются декарбок-силирование ПВК и восст-ние ацетальдегида до этанола. Это бактерии рода Clostridium, Thermoa-naerobacter и др. термофилы, вызывающие спирт. брожение.

2)Мко, способные расщеплять углеводы до ПВК по пути Энтнера-Дудорова. К этой гр. относятся Zymomonas mobilis, некоторые виды Pseudomonas.

3)Мко, расщепляющие углеводы по гексозомо-нофосфатному пути до ксилулозо-5-фосфата. Это Гетероферментативные молочнокислые мко.

Ацетоно-бутиловое брожение. Бактерии рода Clostridium вызывают брожения смешанного хара-ктера, протекающие в строго анаэробных условии-ях. Продуктами брожения, могут быть кислоты (масляная, уксусная, молочная); спирты (бутинол, изопропанол, этанол); ацетон и газы (Н₂ и СО₂).

Процессы брожения называют по основным конечным продуктам. Наиболее распространенным является бутанол-ацетон-изопропиловое брожение. Этот тип брожения в обычных условиях вызывает боль-во видов клостридий, в первую очередь Cl.acetobutylicum. Бактерии Cl.butylicum вызывают бутанол-изопропиловое брожение, Cl.butylicum - масляноуксусное брожение.

В. 2. Влияние субстрата и продуктов метаболизма на скорость роста микроорганизмов.

Основополагающим принципом при разработке моделей, описывающих влияние концентрации субстрата на удельную скорость роста культуры, является положение о существовании лимитирующего субстрата даже в сбалансированных по составу питательных средах. Лимитирующий субстрат – это вещество, концентрация которого определяет интенсивность протекания ключевых реакций конструктивного метаболизма клетки и, как следствие, скорость роста культуры.

Наиболее распространенная количественная модель была предложена Моно (ввел понятие урожайности – экономического коэффициента):

μ = μ _max [S] / (K_s + [S]),

Форма уравнения взята по аналогии с уравнением Михаэлиса-Ментена из кинетики ферментативного катализа на основании концепции «узкого места», т.к. все реакции в клетке протекают с участием ферментов, то скорость роста в целом будет определяться некоторой стадией метаболизма (узким местом).

Модель Моно дополняет экспоненциальную модель роста, устанавливая взаимосвязь между текущими значениями концентрации биомассы и субстрата:

d[X]/dτ = μ [X] = μ _max [X][S] / (K_s + [S]),

Большинство существующих в настоящее время моделей данного типа основываются на уравнении Моно и направлены на его уточнение по двум направлениям:

1). Учет торможения роста культуры избытком субстрата:

μ = μ _max [S] / (K_s + [S] + S²/K_i),

2). Уточнение физического смысла константы K_s:

- зависимость величины K_s от концентрации субстрата или биомассы:

μ = μ _max [S]; μ = μ _max [S] / (K_s*[X]+ [S]),

K_s ([S₀] – [S])+ [S]

- зависимость величины K_s от возраста культуры:

μ = μ _max [S] / (В*K_s + [S]),

Существует ряд моделей, альтернативных рассмотренным выше:

1). Модели, основанные на представлениях об «эндогенном» метаболизме, в результате которого лишь часть субстрата расходуется на образование биомассы, а остальные используются на поддержание метаболизма клетки:

-d[S] / dτ = (-d[S] / dτ )_рост + (-d[S] / dτ )_энд.

S

2). Модели, основанные на представлениях о росте и размножении культуры как о результате необратимого взаимодействия клеток и молекул субстрата по схеме:

X + S 2X + P; d[X] / dτ = K*[X]*[S].

В ряде случаев практический интерес представляет рассмотрение зависимости скорости роста от концентрации продуктов метаболизма (кинетика торможения, рост культур в периодических условиях) независимо от концентрации субстрата или совместно с последней. Наиболее простой является модель Хиншельвуда, основанная на представлениях о тормозящем действии продуктов на скорость роста клеток в экспоненциальной фазе:

d[X] / dτ = K_р*[X]*(1 – К_т [P]).

Известны случаи (например, при направленном синтезе антибиотиков), когда процесс роста биомассы описывается комбинированными моделями, включающими и уравнение Моно, и скорость гибели клеток:

d[X] / dτ = K_р*[X]*(1 – К_т [P]).

Современные представления о кинетических закономерностях роста микроорганизмов в присутствии продуктов метаболизма, основаны на работах Н.Д.Иерусалимского, обосновавшего зависимость удельной скорости от концентрации продуктов с использованием принципа «узкого места» метаболизма.

Уравнение Иерусалимского аналогично по форме уравнению Михаэлиса-Ментон:

μ = μ _о К_р / (K_р + [Р]),

Поскольку ограничиться действием продукта без учета концентрации субстрата практически невозможно, чаще используется уравнение Моно-Иерусалимского:

μ = μ _о К_р*[S] / (K_s + [S])*(К_р + [P]),

Существуют модели, основанные на представлениях о кинетике торможения роста микроорганизмов продуктами метаболизма по типу полного или неполного конкурентного ингибирования:

Микробиологические клетки

В современной мировой практике с помощью микробиологического синтеза получают около 60% всего объема производимых аминокислот. Это обусловлено прежде всего его высокими технологическими показателями, а также возможностью организовать в пределах одного предприятия получение как кормовых препаратов, так и особо чистых индивидуальных аминокислот, пригодных к использованию в пищевой промышленности и медицинской промышленности.

Преимуществом микробиологического синтеза является и то, что используемые микроорганизмы образуют аминокислоты в биологически активной L-форме. Организацию промышленного производства L-аминокислот с помощью микроорганизмов осуществляют по двум технологическим схемам. Они различаются в основном, стадией получения культуральной жидкости. В первой предполагается производство культуральной жидкости в две стадии (двуступенчатый способ), во второй – в одну ступень (одноступенчатый способ). В двуступенчатом способе первой ступенью является образование предшественника и биосинтез фермента; на второй стадии происходит процесс трансформации предшественника в аминокислоту с помощью ферментных систем, выращенных на первой стадии.

Одноступенчатый способ синтеза с помощью микроорганизмов получил наибольшее распространение. Он основан на культивировании определенного штамма – продуцента целевой аминокислоты. Такие мутантные штаммы получают либо методом генной инженерии, либо путем воздействия различных мутагенов физической и химической природы на исходную культуру микроорганизма с последующей селекцией штамма по заданным признакам.

Так, производство лизина осуществляют с помощью штаммов Brevibacterium flaum и corynebacterium glutamicum. Практически весь лизин, производимый в мире микробиологическим синтезом, расходуется на обогащение кормов сельскохозяйственных животных и птицы. В России широкое распространение имеют кормовые препараты лизина в виде ЖКЛ (жидкий концентрат лизина) и ККЛ (кормовой концентрат лизина). Помимо этого получают высококонцентрированные кормовые и высокоочищенные кристаллические препараты для пищевой и медицинской промышленности. ЖКЛ и ККЛ содержат всю сумму веществ, присутствующих в культуральной жидкости и твердые нерастворимые частицы исходной среды, а также другие соединения, в том числе витамины группы В, РР и др. Препарат ККЛ содержит 15-20% лизина; препарат, называемый «высококонцентрированный кормовой препарат» содержит 70% лизина; кристаллические высокоочищенные препараты лизина содержат 97-98% лизина.

Вместе с тем некоторые микроорганизмы являются продуцентами ряда витаминов и используются в биотехнологии для их получения. Например, Propionibacterium freudenreichii подвид shermanii служит продуцентом витамина В12.Продуцентом β - каротина – предшественника витамина А – является мицелиальный гриб Blakesleea trispora. Способностью выделять рибофлавин обладают некоторые аскомицетные грибы, например Ashbya gossypii и Eremothecium ashbyii.

Полученные микробиологическим путем витамины используют как кормовые добавки для сельскохозяйственных животных, а также при дополнительной очистке в качестве пищевых добавок и витаминных препаратов в пищевой промышленности и фармакологии, соответственно.

Среди вторичных метаболитов, образуемых микроорганизмами, наибольшее значение имеют антибиотики. Химические соединения, получаемые с помощью микроорганизмов, находят широкое применение в медицине, ветеринарии и в сельском хозяйстве для борьбы с заболеваниями животных и растений. В настоящее время количество разнообразных антибиотиков превысило шесть тысяч, причем число новых препаратов ежегодно возрастает. Продуцентами антибиотиков служат различные группы микроорганизмов. Мицелиальные грибы синтезируют такие широко известные антибиотики, как пенициллины, цефалоспорины. Стрептомицеты служат продуцентами стрептомицина, хлоромфеникола, тетрациклиновых антибиотиков и актиномицина, а бактерии Bacillus brevis образуют грамицидин.

К низшим фотоавтотрофным организмам, имеющим эукариотический тип клетки, обитающих преимущественно в водной среде или приспособившихся к жизни в почве и некоторых наземных местообитаниях, относятся водоросли.

Пищевые качества водорослей не уступают таковым высших растений. Биомасса их отличается высоким содержанием полноценных белков (включающих все необходимые для питания человека и животных аминокислоты, в том числе незаменимые), витаминов и других физиологически активных веществ.

Водоросли используются также в земледелии как удобрения, фиксаторы атмосферного азота, продуценты кислорода и органических веществ (в том числе типа антибиотиков), регуляторы влажности, агенты, улучшающие структуру почвы и повышающие почвенное плодородие. В животноводстве они применяются в качестве белково-витаминных добавок в рацион животных, источников микроэлементов и ростовых веществ, способствующих повышению продуктивности сельскохозяйственных животных.

Водоросли используются как промышленное сырьё для получения альгиновых кислот и альгинатов, агар-агара, каррагенана, сорбита, маннита, этилового и метилового спиртов, органических кислот, эфиров, разнообразных ферментов, витаминов, антибиотиков и др. физиологически активных веществ. Возрастает значение водорослей в медицине как регенераторов лечебных грязей, источников получения уникальных медпрепаратов (заменителей крови, растворимых хирургических нитей, противодиабетических и противоопухолевых препаратов, соединений, способствующих выведению радиоактивных веществ из организма при лучевой болезни и др.).

Обладая многими полезными для человека свойствами, водоросли вместе с тем могут приносить значительный ущерб народному хозяйству, вызывая биокоррозию промышленных и строительных материалов, порчу произведений искусства, памятников архитектуры, вызывают «цветение» воды, сопровождаемое выделением токсических веществ, кислородной недостаточностью, массовой гибелью беспозвоночных и рыб.

Растительные клетки

Культура растительных клеток является искусственно созданной биологической системой, функционирующей in vitro и сохраняющей многие черты, присущие интактному растению. Несмотря на некоторое снижение биосинтетической способности, культивируемые клетки растений синтезируют гораздо большее количество метаболитов по сравнению с микробными клетками.

Многие продукты вторичного обмена культур клеток были получены в промышленных или лабораторных условиях. Например, сердечные гликозиды — из культуры ткани наперстянки, стероиды — из диаскореи дельтовидной, алкалоиды — из культуры ткани мака, а также из раувольфии змеиной и т. д., всего более ста веществ, имеющих существенное значение для промышленности и медицины. Основными проблемами, осложняющими получение целевых продуктов из культуры растительных клеток, являются создание генетически стабильных штаммов и выделение метаболитов из млечников или вакуолей, где они обычно накапливаются.

При помощи методов генной инженерии созданы клетки или растения-регенераты с новыми свойствами. В последние годы достигнуты большие успехи, связанные с генетической трансформацией клеток, в том числе и растительного происхождения. Схема трансформации включает в себя получение протопласта, введение в него необходимой генетической информации, формирование полноценной растительной клетки, клонирование и регенерацию. В данной схеме «трансформированный протопласт — суспензионная культура — каллусная культура — целое растение»— наиболее тех-синтезировали химерные белки, состоящие из А- или В-цепи инсулина, присоединенной через метионин к р-галактозидазе. При помощи бромциана, специфически расщепляющего белки по остатку метионина, выделяли индивидуальную цепь инсулина. Далее цепи соединяли в единую активную молекулу инсулина. Образование дисульфидных цепей in vitro явилось лимитирующей стадией всего процесса, причем выход был незначительным. В связи с этим был разработан метод получения проинсулина человека с последующим созреванием его in vitro. Были синтезированы несколько десятков олигонуклеотидов, соединенных затем при помощи ДНК-лигазы. Полученные двухцепочечные фрагменты ДНК, соответствующие гену, кодирующему человеческий инсулин, были встроены в плазмиду, а затем перенесены в Е. coli

Полученные рекомбинантные клетки синтезировали проинсулин, который затем in vitro превращали в зрелый инсулин. В настоящее время генно-инженерный инсулин широко применяется в медицинской практике.

Интерфероны— низкомолекулярные белки, обладающие выраженной противовирусной активностью. Кроме того, интерфероны проявляют фармакологический эффект при таких заболеваниях, как гепатит В, рассеянный склероз, некоторые локализации опухолей. Различают три класса интерферонов по месту их синтеза в клетках человека и животных: а-интерферон из лейкоцитов, р-интерферон из фибробластов и у-интерферон из тимуса. а-Интерферон является простым белком, р- и у-белки — гликозилированы. Интерферон является одним из самых эффективных средств лечения вирусных инфекций, но он видоспецифичен и может быть получен только из клеток человека. Технология выделения и очистки интерферонов малоэффективна прежде всего из-за крайне малого выхода конечного продукта. Поэтому получение генно-инженерного продукта является перспективной альтернативой традиционным методам выделения интерферона. Значительным событием явилась удачная попытка введения гена интерферона в дрожжевые клетки. Замена промотора гена человеческого интерферона на ген дрожжевой алкогольдегидрогеназы обеспечила эффективную экспрессию гена интерферона. Замена бактериальной клетки в качестве реципиента на дрожжевую сыграла огромную роль для всей генно-инженерной техники вообще и для получения интерферонов в частности.

Генно-инженерные вакцины.Вакцинация человека и животных основана на выработке антител в ответ на введение антигена — ослабленного или инактивированного вируса. Применение живых вакцин чревато заражением, а инактивация вирусов может резко снизить их иммуногенность. Антигенные свойства вирусных частиц определяются в основном их белковыми компонентами, поэтому выделение индивидуального вирусного белка дает возможность получения вакцины, лишенной указанных выше недостатков.

Вирусные белки могут быть получены генно-инженерным методом. Для синтеза вирусных белков используют клетки высших эукариот, имеющих полноценный аппарат созревания сложных белков. Синтетические пептиды могут реагировать с антителами против целой вирусной частицы. Целенаправленный синтез таких пептидов, содержащих аминокислотные последовательности, характерные для фрагментов тех или иных вирусных белков, является перспективным направлением для создания эффективных синтетических вакцин.

Культура клеточных суспензий.Под суспензионными культурами понимают выращивание в жидкой среде отдельных клеток или небольших групп с использованием аппаратуры, обеспечивающей аэрацию и перемешивание.

Для получения суспензионных культур используют каллусную ткань рыхлого типа, которая легко фрагментируется на отдельные клетки и небольшие агрегаты при помещение ее в перемешиваемую жидкую среду. С этой целью при культивировании каллуса из среды исключают цитокинины или снижают их концентрацию, а увеличивают концентрацию ауксинов.

Наиболее простой принцип - накопление, периодическое культивиро­вание суспензий. В этом случае размножение популяции клеток осущест­вляются в закрытой системе в постоянном объеме питательной среды. Обычно начальная плотность клеточной популяции составляет 0, 5x105— 2, 5х 1 о5 клеток на мл питательного раствора. Сосуды с суспензией закреп­ляют на платформе шейкера (встряхивателя) или устанавливают на качалки ротационного типа. В этих условиях обеспечивается аэрация и, кроме того, нарастающая масса клеточных агрегатов распадается на отдельные Фрагменты. В лабораторных условиях обычно используют сосуды объемом 100—250 мл с небольшим объемом питательной среды - 20—70 мл. Крупномасштабное культивирование осуществляют в сосудах объемом до нескольких декалитров с продуванием жидкой среды стерильным воздухом.

 

Другие методы выращивания клеточных культур - непрерывное культи­вирование с поддержанием баланса между разбавлением питательной среды и удалением части суспензии. Было обнаружено, что если при нако­пительном культивировании клеточных суспензий в фазе логарифми­ческого роста культуры в сосуд добавляют свежую среду, то деление клеток возможно поддерживать неограниченно долго. Это и послужило основой создания систем, позволяющих осуществлять непрерывное культиви­рование.

Непрерывные культуральные системы подразделяют на полу проточные и проточные.

ПОЛУПРОТОЧНЫЙ РЕЖИМ ВЫРАЩИВАНИЯ

При этом производится отбор определенной части клеточной суспензии через интервалы времени и разбавление оставшейся части суспензии свежей средой. Через суспензию пропускают стерильный воздух. Культуру размешивают магнитной мешалкой. Культивирование может продолжаться в течение нескольких месяцев.

ПРОТОЧНЫЙ РЕЖИМ ВЫРАЩИВАНИЯ

При этом осуществляется непрерывное снабжение свежей средой с удалением равного объема клеточной суспензии. В таком режиме автоматизированные ферментеры (культуральные сосуды) могут функционировать в течение нескольких лет. Ферментеры, используемые для производства больших клеточных масс, могут иметь объем до 1500 л.

Практическое использование культуры клеточных суспензий: для изуче­ния дифференциации клеток, их биосистематических особенностей и популяционных взаимоотношений; для промышленного получения необходимых продуктов клеточного метаболизма.

Вопросы для самоконтроля.

1.Типы предприятий биотехнологической промышленности, особенности их размещения.

2. Общая характеристика продукции биотехнологических производств.

3. Выделение целевых продуктов из клеточной биомассы.

4. Классификация процессов брожения по конечным продуктам.

 

⇐ Предыдущая123456

Поделиться: