Правила взятия, транспортировки материала в бак. лаборатории на возбудители ГСИ.

Правила взятия, транспортировки материала в бак. лаборатории на возбудители ГСИ.

Взятие, транспортировка и посев материала производится согласно следующим документам:

1) Приказ №535 от 22 апреля 1985 года «Об унификации микробиологических(бактериологи-

ческих) методов исследования, применяемых в клинико-диагностических лабораториях

лечебно-профилактических учреждений»

2) МУ 4.2.2039 -05«Техника сбора и транспортирования биоматериала в микробиологические лаборатории»

Микробиологические методы исследования крови.

Показания для исследования:

Подозрение на сепсис и/или бактериемию.

Взятие исследуемого материала:

 

- Как правило забирают кровь на подъеме температуры (а не на высоте лихорадки), до начала

специфического антибактериального лечения, или, по крайней мер, через 12-24 часа после

последнего введения препарата больному

-Для взятия крови необходимо пользоваться стерильным шприцем, системы для одноразового ис-

пользования освобождают от упаковки только непосредственно перед употреблением.

-Кровь берут у постели больного или в перевязочной стерильным шприцем или системой для

одноразового взятия крови с соблюдением всех правил асептики.

Кожу над пунктируемой веной обрабатывают 70% спиртом, затем 1-2% настойкой йода, затем

снова спиртом для удаления избытка йода. Обработку проводят круговыми движениями от центра

к периферии.

Пока один человек обрабатывает кожу больного над пунктируемой веной, пунктирует вену и бе-

рет кровь, другой –над пламенем спиртовки открывает пробки флаконов, подставляет флаконы

под струю крови из шприца, обжигает горлышки и пробки флаконов и закрывает их.

- Не следует брать кровь из внутрисосудистых катетеров, кроме случаев, когда предполагает-

Ся сепсис катетерного происхождения.

- Непосредственно перед посевом резиновую пробку флакона дезинфицируют 70% этиловым спир-

том, затем прокалывают пробку флакона иглой шприца и производят посев крови

-Для результативного бактериологического исследования необходимо сеять достаточные количе-

ства крови (не менее 10 мл у взрослых и 5 мл у детей) в большое количество питательной среды

в соотношении 1: 10, чтобы преодолеть бактерицидные свойства крови.

-Флаконы маркируют и до транспортировки в лабораторию хранят обязательно при комнатной

температуре (не в холодильнике)

-При подозрении на катетерную инфекцию исследуют внутрисосудистый катетер. В асептических условиях отрезают его дистальный конец(длиной около 5 см ), помещают в стерильный широкогор-

лый сосуд(пробирку) с завинчивающейся крышкой и без промедления доставляют в лабораторию.

 

Согласно приказа №535:

Минимально использовать 2 среды:

1) «Двойная среда», состоящая из скошенного во флаконе 150 мл 1, 7-2% питательного ага-

ра и 150 мл полужидкой среды, приготовленной на питательном бульоне. Кровь засевают в

жидкую часть среды. Инкубируют в термостате при 37⁰ С.Флаконы ежедневно просматри-

вают, при этом, наклоняя флакон, смачивают поверхность питательным бульоном.

Это исключает необходимость высева на плотные питательные среды и, следовательно,

уменьшает риск контаминации при пересевах.

2) «Среда для контроля стерильности»- тиогликолевая среда.

3) Жидкая среда Сабуро(Двойная среда Сабуро) для выделения грибов.

Согласно приказа №535 культивирование в течение 6 недель в термостате при 37⁰ С с ежедневным

просмотром в течение первых 8 дней. При появлении видимого роста делают мазки, окрашенные по Граму, и в соответствии с данными бактериоскопии делают высевы на среды.

При отсутствии видимого роста на 3, 5, 8 день из всех сред, кроме двойной среды и СКС делают вы-

севы на 5% кровяной агар и мазки на стеклах, которые окрашивают по Граму. Посевы инкубируют

в анаэробных и аэробных условиях. Выращенные бактерии идентифицируют, определяют их свойс-

тва, чувствительность к антибиотикам.

При отсутствии роста на 9-10 день выдают отрицательный ответ.

Однако флаконы с засеянной средой выбрасывать не рекомендуется, необходимо продолжать держать их в термостате в течение 4-6 недель, проверяя появление роста 2-3 раза в неделю.

 

Оценка результатов:

При наличии роста результаты оцениваются в зависимости от вида выделенных бактерий,

скорости и массивности их роста.

Многократные посевы крови повышают вероятность выделения гемокультуры и позволяют раз-

личить истинные патогенны от случайных контаминантов.

Однократное выделение коагулазонегативных стафилококков, коринебактерий, пропионибактерий, Bacillus spp., негемолитических и зеленящих стрептококков следует соотносить с клиническими данными.

Выделяемые м/о: золотистый стафилококк, энтеробактерии, листерии, синегнойная палочка.

 

 

Рекомендуется проводить повторные посевы крови.

 

Существуют автоматизированные системы для гемокультивирования BACTEC и BactAlert («Био-

мерье»), основанные на непрерывном мониторинге роста гемокультур по нарастанию концентрации CO₂ в инкубационной среде, с регистрацией газообразования методом флуоресценции или колориметрии. В зависимости от модели прибора одновременно можно исследовать 50, 120, 240 образцов.

Для посева используют флаконы с ПС для культивирования аэробных, анаэробных м/о, грибов и

микобактерий туберкулеза.

Объем исследуемой крови (8 мл для взрослых, 3 мл-для детей).Засеянные флаконы помещают в индивидуальные ячейки в инкубационном блоке прибора, в основании которых расположены светоизлучающие и светопоглощающие диоды)

Каждый флакон индивидуально считывается каждые 10-15 минут до появления признаков микробного роста, который регистриуется по нарастанию уровней флуоресценции CO₂ (BACTEC) или изменению цвета сенсора (BaсT/Alert). Данные сохраняются и анализируются на компьютере с построением кривой роста.

В течение первых суток достигается 90% положительных результатов, максимальные сроки иссле-

дования составляют 5 дней.

 

 

Исследование спинномозговой жидкости

Показания:

Воспалительные заболевания ЦНС (менинигиты, энцефалиты, менингоэнцефалиты)

Взятие материала:

Получают путем люмбальной пункции, или, что реже пункции желудочков мозга.

Материал необходимо забирать до начала антибиотикотерапии.

Взятие материала производит врач.

Место пункции обрабатывают антисептиком и 70% этиловым спиртом, иглу с мандреном вводят между поясничными L3- L4, L4-L5 или пояснично-крестцовыми L5-S1.Достигнув субарахноида-

льного пространства, удаляют мандрен, и ликвор появляется на конце иглы.

Медленно набирают ликвор в стерильные, герметично закрывающиеся пробирки.

Обычно используют 3 пробирки:

№1-для клинического анализа.

№2-для микробиологического.

№3-для биохимического анализа.

Для микробиологического присылают пробирку №2, желательно центрифужную, или одну пробир-

ку из трех с самым мутным содержимым в нужном объеме.

Ликвор немедленно доставляют в лабораторию, при отсутствии такой возможности материал сохра-

няют при 37⁰ С.

Охлаждение ликвора ниже 30⁰ С ведет к утрате жизнедеятельности менингококков.

Проведение исследования

-Центрифугирования образца (5 минут при 3500 об/мин) и из осадка делают мазки.

Если ликвор мутный, то мазки делают без центрифугирования.

Мазки после фиксирования окрашивают метиленовым синим и по Граму.

Результаты микроскопии позволяют установить наличие менингококков или условно-патогенных микроорганизмов, вызвавших

бактериальный менинигит. Посев ликвора производится на набор сред:

Сывороточный агар (д.б. свежеприготовленным)

5% кровяной агар

Шоколадный агар

Простой агар

Среда для контроля стерильности

Среда Сабуро*

0, 1 % полужидкий агар для обогащения ликвора

 

Методика посева

Проводят посев 2-4 капель гнойного ликвора или ресуспензированного осадка на чашку со

свежеприготовленным сывороточным агаром, на чашку с кровяным агаром, простым агаром,

шоколадным агаром.

Капли растирают подогретым шпателем на поверхности агара.

После этого чашку с простым агаром помещают в термостат 37⁰ С, а другие чашки инкубируют в

атмосфере с повышенным СО₂ (микроаэрофильные условия)

Инкубация в данных условиях повышает выявление менингококков, пневмококков, листерий.

В пробирку, к оставшемуся от посева и микроскопипрования осадку, добавляют 5 мл стерильного

0, 1% полужидкого агара и помещают в термостат для накопления.

Надосадочную жидкость, полученную после центрифугирования используют для обнаружения

антигена серологическими методами (РЛА-обнаружение H.influanzae, N.meningitidis, S.pneumoniae,

S.agalactiae)- метод скрининговый и не заменяет бактериологического исследования/

Если ликвора мало, то его засевают только на среду обогащения.

Если ликвор прозрачный, то центрифугирование не производят, мазок не делают, и вся его часть,

оставшаяся после посева засевается на среду обогащения.

Плотные среды следует инкубировать в течение минимум 72 часов, полужидкий агар до 5-7 дней.

При отсутствии роста колоний на плотных средах делают высев со среды накопления на чашку с

сывороточным агаром и кровяным агаром.

При появлении роста изучают характер роста, морфологию выросших бактерий при окраске по Граму.

Интерпретация результатов

В норме ликвор стерилен.

Наиболее частые возбудители менингита у новорожденных:

Энтеробактерии (E/coli, Proteus spp., Klebsiella pneumonia, Enterobacter spp.)

Pseudomonas aeruginosa

Streptococcus gr.B, D

Listeria monocytogenes

 

У детей раннего возраста:

N.meningitidis.(менингококк)

S.pneumoniae (пневмококк)

H.influanzae (гемофильная палочка)

Исследование этого очага.

Проведение исследования

Центрифугирование объемов жидкости > 5 мл в стерильных пробирках15-30 мин. при 2500-3500

оборотах/мин.

С соблюдением правил асептики собирают пастеровской пипеткой отдельно надосадочную жид-

кость и осадок.

Из осадка готовят тонкий мазок и окрашивают его по Граму.

Посевы осуществляют на кровяной и шоколадный агар(инкубация 18-24 часа в атмосфере 5-7%

СО₂), а также неселективный анаэробный агар (Агар Цейсслера)-инкубация в анаэробных усло-

виях при 35⁰ С 48 часов), а также тиогликолевую среду с добавлением 10% кроличьей сыворотки

или сывороткой крупного рогатого скота.

Результаты посевов исследуют ежедневно.

При отсутствии роста на плотных средах и наличии роста на ТИО, делают высевы на плотные

питательные среды.

 

 

Исследование мочи

Показания к исследованию:

Инфекции МВП(циститы, пиелонефриты)

Бессимптомная бактериурия

Моча здорового человека в норме стерильна.

Этиология

70-95% осложненных и неосложненных ИМВП- Е.соli, реже-другие энтеробактерии(Proteus

Spp., Klebsiella spp.)

Взятие материала

 

Взятие образца должно быть выполнено:

До начала антибиотикотерапии или в интервалах между курсами лечения.

Наиболее часто-образцом для исследования является средняя порция свободно выпущенной пер-

вой утренней мочи в объеме 3-5 мл после соответствующей гигиенической подготовки, позво- ляющей минимизировать контаминацию образца.

Первая порция мочи всегда контаминирована микрофлорой уретры.

Применение сред накопления не допускается.***

Наиболее достоверные результаты могут быть получены при сборе утренней мочи.Образец должен быть получен после ночного отдыха до завтрака.Во время ночного отдыха происхо- дит концентрация мочи в мочевом пузыре и делается возможным размножение бактерий в моче.

Другие способы забора мочи:

-Через катетер ( у тяжелыхбольных)

-Посредством надлобковой пункции мочевого пузыря

-Через постоперационную уростому

-Либо с использованием специальных сборников мочи

 

Образцы должны быть доставлены в течение 2 часов, при невозможности доставки в эти сроки допускается хранение образца в холодильнике при температуре +4⁰ С. не более 12 часов.

Проведение исследования.

Исследование направлено на выделение возбудителя и определение степени бактериурии.

Основные питательные среды:

Питательный агар*** (приказ №535)

5% кровяной агар –на нем определяется степень бактериурии.

Посев методом секторных посевов.

Платиновой петлей диаметром 2 мм и емкостью 0, 005 мл производят посев мочи(30-40 штрихов

на сектор А, после этого петлю прожигают и производят посев из сектора А в сектор I, и аналогич-

ным образом из сектора I во II и из II в III.Инкубация 37⁰ С 18-24 часа.

Учет по количеству колоний выросших на секторах, согласно таблице высчитывают обсеменен-

ность на 1 мл мочи.

Данный метод не толькопозволяет определить степнеь бактериурии, но и выделить возбудитель в

чистой культуре.

При латентном течении уроинфекции, а также после лечения антибактериальными препаратами

рекомендуется производить посев 0, 1 мл цельной мочи на плотные питательные среды и в пробир-

ку с 0, 25% сахарным бульоном.Инкубация 37⁰ С 18-24 часа.

При отсутствии роста на 5% кровяном агаре чашки выдерживают 3 суток в термостате.Из сахарно-

го бульона делают высев на чашки с кровяным агаром.

Качество исследования повышается при использовании для посевадполнительных селективных

сред для выделения энтеробактерий и энтерококков(среда Эндо, Левина, среда Мак-Конки, желчно-

щелочной агар), а также дрожжеподобных и мицелиальных грибов (среда Сабуро).

Использование хромогенных агаров типа «Уроселектагара».

На селективные среды посев штрихом, может быть засеяно 2 образца.

Идентификация выделенных микроорганизмов проводится с использованием традиционных мето-

дов и тест-систем.

Согласно приказу №535:

1) бактериурия< 10³ КОЕ/мл ---отсутствие воспалительного процесса

2) бактериурия=10⁴ КОЕ/мл ---- сомнительный результат, исследование повторить.

3) бактериурия> 10⁵ КОЕ/мл ----указывает на наличие воспалительного процесса.

При наличии катетера:

бактериурия=10⁴ КОЕ/мл- при наличии клинических проявлений имеет значение

бактериурия> 10⁵ КОЕ/мл -даже при отсутствии клинических проявлений имеет значение.

В образцах мочи, полученных путем надлобковой пункции, этиологическое значение имеет

любая степень бактериурии.

В случае выделения двух микроорганизмов клиническое значение каждого оценивается, исходя

из количества, степени патогенности и частоты выделения.

Учитывается также выделение монокультуры в сочетании с высокой степенью бактериурии-острый процесс.

При хронических процессах-микробные ассоциации и низкая степень бактериурии.

Возможно использование ускоренных методов диагностики-системы Uricult/-DUO

 

Промывные воды бронхов.

- при отсутствии или скудном количестве мокроты производят смыв из бронхов физиологическим раствором, однако, при этом микробиологическая ценность снижается из-за значительного разведения. Концентрация бактерий в бронхиальном смыве в 10-1000 раз ниже, чем в мокроте.

При бронхоскопии рекомендуется вводить не более 5 мл физиологического раствора с последующей его аспирацией в стерильную пробирку.

Ход исследования.

· Микроскопия исследуемого материала.

Одновременно с посевом приготавливают мазки, окрашенные по методу Грама.

Микроскопическое исследование является важным ориентиром. По результатам микроскопии

могут быть внесены изменения в ход микробиологического исследования.

При просмотре мазков мокроты оценивают общую картину микрофлоры: наличие скоплений

грамположительных кокков, цепочек грамположительных кокков, мелких ланцетовидных

кокков, окруженных зоной неокрашенной капсулы, грамотрицательных кокков, грамотрица-

тельных палочек, псевдомицелия гриба.

При исследовании мокроты обращают внимание на наличие гранулоцитов, которые всегда

можно обнаружить при воспалительных процессах.

 

 

· Посев:

- 5% кровяной агар – основная питательная среда для посева.

- Желточно-солевой агар (среда Чистовича)

-Агар с гретой кровью (Шоколадный агар)

-Среда Эндо

- Среда Сабуро

Посев мокроты:

- Мокроту выливают в чашку Петри, с помощью стерильных игл выбирают 2-3 гнойных комочка.

- 3-хкратно отмывают в стерильном физ.растворе.

- Посев производят стеклянным стерильным шпателем, равномерно растирая материал по

по поверхности среды.

- Количественный посев – 1 мл мокроты + 9 мл питательного бульона или 2% пептонной воды и гомогенизируют в банке со стеклянными бусами 20 мин.

Готовят серийные разведения до 10 ⁷, делают высевы по 0, 1 мл из разведений 10 ⁷ , 10 ⁵, 10 ³

и 10¹ на кровяной 5% агар и агар с гретой кровью, посев на ЖСА, Эндо и Сабуро из 10¹.

Содержимое бронхов принимают за первое разведение.

- Посевы помещают в термостат при 37°С

Диагностически значимая концентрация ≥ 10⁶ для мокроты и ≥ 10⁴ для бронхиальных смывов.

Посев мазков из верхних дыхательных путей:

Посев выполняется тампоном, который втирают на небольшом участке 1х2 см, а затем штрихами

по всей поверхности питательной среды. Посевы помещают в термостат на 37⁰ С.

Просмотры посевов мокроты, отделяемого верхних дыхательных путей просматривают после 18-

24 часовой инкубации при 37⁰ С. Учитывают количество выросших колоний, соотношение отдель-

ных ассоциатов, выделяют чистые культуры и проводят их идентификацию.

Взятие материала.

Проводит врач с соблюдением правил асептики.

Кожу вокруг раны обрабатывают спиртом или другим антисептиком, некротические массы, тка-невой детрит и гной удаляют стерильной салфеткой.

Взятие материала стерильным тампоном производят круговыми движениями от центра к периферии поверхности раны.

Материал берут 2-мя тампонами, один- для микроскопии, другой – для бакпосева.

При наличии дренажей возможно взятие аспиратов из раны в объеме 1-2 мл.

Доставка в течение 1 часа.

Ход исследования.

· Микроскопия исследуемого материала.

Одновременно с посевом приготавливают мазки, окрашенные по методу Грама.

Микроскопическое исследование является важным ориентиром. По результатм микроскопии

Могут быть внесены изменения в ход микробиологического исследования.

· Посев:

- 5% кровяной агар – основная питательная среда

Посев производят по методу «тампон-петля»: тампоном проводится «дорожка» по диаметру

Чашки, а затем другой стороной тампона в обратном направлении. Материал рассевают по чашке при помощи петли, перпендикулярно дорожке.

- Среда для контроля стерильности (Тиогликолевая среда)

Инкубация в течение 5 суток.

Посевы помещают в термостат при 37°С

При отсутствии роста в первые сутки посевы оставляют в термостате, ежедневно просматри-

вают и при визуальном обнаружении роста также производят соответствующие отсевы.

Ответ об отсутствии роста выдают через 5 суток термостатирования.

Микробиологическое исследование отделяемого глаз.

Микробиологическое исследование проводят при заболеваниях конъюнктивы, век, слезных мешков,

роговицы.

В норме и только с конъюнктивы регулярно выделяются эпидермальные стафилококки, коринебактерии, непатогенные нейссерии.

У отдельных лиц временно могут выделяться золотистые стафилококки, зеленящие стрептококки, гемофильные бактерии, микоплазмы.

Причиной конъюнктивитов в преобладающем количестве случаев являются стафилококки: золотис-

тый стафилококк при остром конъюнктивите, эпидермальный – при хроническом.

Другими возбудителями являются:

Neisseria gonorrhoeae (гонококк)

Moraxella lacunata

Moraxella catharrhalis

Streptococcus pyogenes (пиогенный стрептококк)

Haemophilus pneumoniae (гемофильная палочка)

Pseudomonas aeruginosa (синегнойная палочка)

Энтеробактерии

Листерии

 

Материал берут с пораженных мест в разгар воспалительного процесса с соблюдением правил асептики. Не менее, чем за 5-6 часов до исследования отменяют все медикаменты и процедуры. Взятие производит врач-окулист.

В кабинете врача производят посев на тиогликолевую среду.

Исследование.

· Микроскопия исследуемого материала.

Одновременно с посевом приготавливают мазки, окрашенные по методу Грама.

Микроскопическое исследование является важным ориентиром.По результатм микроскопии

могут быть внесены изменения в ход микробиологического исследования.

· Посев:

- 5% кровяной агар – основная питательная среда

- Среда для контроля стерильности-тиогликолевая среда.

Первичные посевы на жидких питательных средах, присланные в лабораторию, помещаютв термостат при 37⁰ С.

Материал, взятый тампоном, с обильным гнойным отделяемом засевают на чашки с 5% кро-

вяным агаром и «среду для контроля стерильности»-тиогликолевую среду.

Термостатирование проводится в эксикаторе со свечой при 37⁰ С.

При наличии роста на жидкой среде делают высев на 5% кровяной агар, среду Эндо, ЖСА и

Сабуро.

Инкубация в течение 5 суток.

Микробиологическое исследование отделяемого ушей.

При воспалительных заболеваниях наружного, среднего или внутреннего уха исследуют гнойное или серозное отделяемое ушей.

В наружном слуховом проходе в норме присутствует собственная микрофлора, представленная эпидермальными стафилококками, непатогенными коринебактериями(дифтероидами).

Внутреннее и среднее ухо в норме стерильно.

Возбудители острого отита:

Staphylococcus aureus (золотистый стафилококк)

Streptococcus pyogenes (пиогенный стрептококк)

Streptococcus pneumonia (пневмококк)

Haemophilus pneumoniae (гемофильная палочка)

Corynebacterium diphtheriae (дифтерийная палочка)

Pseudomonas aeruginosa (синегнойная палочка)

Энтеробактерии

Листерии

Возбудители хронического отита:

- ассоциации грамотрицательных микроорганизмов.

-плесневые грибы Aspergillus, Penicillium, Mucor.

 

Взятие _ обработка кожи 70% спиртом с последующим промыванием физ. Раствором, взятие стерильным тампоном.

При поражении среднего уха исследуют пунктаты.

Исследование.

· Микроскопия исследуемого материала.

Одновременно с посевом приготавливают мазки, окрашенные по методу Грама.

Микроскопическое исследование является важным ориентиром.По результатм микроскопии

Могут быть внесены изменения в ход микробиологического исследования.

· Посев:

- 5% кровяной агар – основная питательная среда

- Среда для контроля стерильности- тиогликолевая среда.

- Среда Сабуро

- Шоколадный агар (при обследовании грудных детей)

Материал тщательно втирают в поверхность плотных питательных сред.

Термостатирование проводят в течение 24 ч при 37⁰ С, кровяной агар инкубируют в эксикаторе со свечой.

Посев на среде Сабуро выдерживают при 22-25⁰ С не менее 5 суток.

Посевы на тигликолевой среде -инкубация в течение 5 суток.

 

 

Питательные среды

5% кровяной агар (приказ №535)

Сахарный б-н(приказ №535)

Среда Эндо(приказ №535)

Среда Сабуро

Среда Чистовича

Уретра-

Отделяемое берут пластиковой одноразовой петелей объемом 1 мкл или тонким дакроновым

тампоном на алюминиевой проволоке.

Предварительно наружное отверстие уретры следует очистить марлевым или ватным тампоном.

Забор выполняет уролог.Тампон/петлю вводят на глубину 1-2 см и вынимают слегка нажимая

на боковые и заднюю стенки.

Для микроскопического и иммунофлуоресцентного исследования материал переносят на предмет-

ное стекло, прокатывая по нему тампоном или передвигая петлю с материалом с легким нажимом.

Для культурального исследования и ПЦР материал помещают в пробирку с соответствующими

транспортными средами.

 

Посев на 5% кровяной агар методом секторов аналогично посеву мочи.

 

 

Правила взятия, транспортировки материала в бак. лаборатории на возбудители ГСИ.

Взятие, транспортировка и посев материала производится согласно следующим документам:

1) Приказ №535 от 22 апреля 1985 года «Об унификации микробиологических(бактериологи-

ческих) методов исследования, применяемых в клинико-диагностических лабораториях

лечебно-профилактических учреждений»

2) МУ 4.2.2039 -05«Техника сбора и транспортирования биоматериала в микробиологические лаборатории»

1234Следующая ⇒

Поделиться: